Pół wieku syntezy peptydów

Biotechnologia
Pół wieku syntezy peptydów
Wojciech Kamysz
Laboratorium Badawczo-Rozwojowe Lipopharm.pl
Peptydy i białka należą do biopolimerów z którymi w obecnych czasach wiąże się duże nadzieje
aplikacyjne. Fascynacja ta trwa jednak już ponad pięćdziesiąt lat. W roku 1954 została opisana
przez Vigneaud’a synteza oksytocyny. Wraz z tym
wydarzeniem powstały teorie, że peptydy mogą
zastąpić konwencjonalne leki. Obecnie roczna
produkcja leków peptydowych (z wyłączeniem insuliny) sięga około jednej tony. Insulina produkowana jest w ilości około 20 ton rocznie, przez dwóch
światowych gigantów Novo Nordisc (Dania) oraz
Eli Lilly (USA). Wynika z tego, że rynek leków peptydowych poza insuliną jest bardzo ubogi. Dzieje się
to głównie za sprawą problemów z jakimi borykają
się producenci. Najważniejszym jest wysoki
koszt otrzymywania peptydów. Do tego dochodzą
poważne problemy ze stworzeniem postaci leku
(niska biodostępność, niska trwałość chemiczna
i biologiczna), ale i typowe problemy z przechowywaniem leków peptydowych. Odizolowanie
produktu (substancji leczniczej lub postaci leku) od
niesprzyjających warunków poprzez np. właściwe
opakowanie, powlekanie postaci leku (całej lub
fragmentów), stosowanie postaci mikrokompartmentowych (liposomy, mikro- i nanokapsułki),
stosowanie cyklodekstryn, zmiana stopnia rozdrobnienia nie zawsze pomaga. Czasami najskuteczniejsze okazuje się stosowanie substancji pomocniczych gwarantujących trwałość, stosowanie
inhibitorów enzymów (np. inhibitorów proteaz),
przeciwutleniaczy (kwas askorbinowy, askorbinian sodu, glutation, tiosiarczan sodu), czy modyfikacja struktury związków chemicznych (zastosowanie aminokwasów w konfiguracji D zamiast L).
Synteza na nośniku stałym
Synteza na nośniku stałym ma niespełna 50 lat.
Powszechnie znane podejście, nazywane od nazwiska twórcy metodą Merrifielda, posiada wiele
38
zalet, dzięki którym peptydy w obecnych czasach
syntezuje się stosunkowo szybko, często z wykorzystaniem urządzeń, zwanych syntezatorami peptydów. Pierwsze tego typu urządzenia powstały
już w latach 60-tych. Technika syntezy z wykorzystaniem nośników polega na przyłączeniu do
nierozpuszczalnego w fazie organicznej polimeru
substratu, do którego dobudowuje się kolejne segmenty, aminokwasy. Sam nośnik wcześniej jednak specjalnie przygotowuje się celem uzyskania
odpowiedniego linkera, do którego przyłącza się
pierwszy z aminokwasów. Linker jest ugrupowaniem chemicznym łączącym nierozpuszczalny
Laborant Nr 2/2011
Biotechnologia
polimer z pierwszym przyłączanym aminokwasem. Gwarantuje trwałość połączenia
w trakcie syntezy oraz łatwe
odszczepianie
zbudowanego
peptydu podczas deprotekcji gotowego produktu.
Synteza na nośniku stałym ma
olbrzymie zalety, dzięki którym
w ostatnich latach gwałtownie
rozwinęła się synteza organiczna różnorakich molekuł,
począwszy od biopolimerów takich jak kwasy nukleinowe, oligo- i polisacharydy, kończąc na
związkach niskocząsteczkowych.
Nadmiar nieprzereagowanych
substratów z łatwością odmywa
się w specjalistycznych naczyniach, zwanych powszechnie naczyniami Merrifielda. Podejście
Cl
P
Cl
wykorzystaie ortogonalności stosowanych osłon łańcuchów bocznych stosowanych aminokwasów oraz osłony grupy α-aminowej każdorazowo przyłączanego substratu. Już od czasów
pionierskich odkryć dotyczących
syntez na nośniku do osłony grup
aminowych stosuje się osłonę tertbutyloksykarbonylową
(Boc).
Ugrupowanie to odszczepiane
zwykle z wykorzystaniem kwasu
trifluorooctowego nie należy do
osłon chętnie wykorzystywanych
w syntezie krok po kroku. Dodatkowo strategia Boc wymaga
do odszczepianie peptydów od
nośnika ciekłego fluorowodoru.
Równolegle w latach 70-tych do
syntezy wprowadzono osłonę
Fmoc
(9-fluorenylometoksy-
to pozwala na stosowanie dużych
nadmiarów reagentów, minimalizację skali syntezy oraz stosowanie często substratów toksycznych. Wspominana wcześniej
możliwość automatyzacji syntezy na nośniku w ostatnim
pięcioleciu została wzbogacona
w możliwość syntezy w pełni
automatycznych syntezatorach
mikrofalowych, dzięki czemu
procesy kondensacji aminokwasów można przyspieszyć
nawet 10 krotnie.
Chemia Boc, Fmoc
i nic więcej…
Chemiczna synteza peptydów
opiera się na zastosowanie grup
ochronnych. Kluczową sprawą
w projektowaniu syntezy jest
P
O
HO
P
O
P
Cl
Cl
HO
Cl
P
P
Cl
Rys. 1. Przykłady nośników (żywic) do syntezy peptydów. A – Merrifielda, B – Barlosa, C – Wanga
CH
CH3 3
HC
CH
H3C 3
CH3 3
O
tBu
O TFA
CH
CH3 3tBu
TFA
O
CH
O
CH3 3
zywica Wanga
O
CH
zywica Wanga
O
CH3 3
tBu
piperydyna
piperydyna
Fmoc
Fmoc
NH
NH
H
H
O
O
O
O
NH
NH
O
O
tBu
NH
NH
NH
NH
O O
O O
O
O
O
O
P
P
TFA
TFA
Rys. 2. Schemat reakcji podczas syntezy metodą Fmoc.
www.czasopismolaborant.pl
39
Biotechnologia
karbonylową),
która
ulega
odszczepieniu z użyciem piperydyny. Ze względu na koszt pochodnych
aminokwasowych,
powszechna stała się ona w laboratoriach dopiero 20 lat później.
W obu podejściach syntetycznych stosuje się identyczne
środki kondensujące i przeciwracemizacyjne (od 50 lat te same!). Pomimo, że powstają nowe
nośniki a katalogi dedykowane
laboratoriom peptydowym są pełne „nowości” w gruncie rzeczy
opierają się na tych samych linkerach. Ze względów marketingowych nośnikom przypisuje
się nadzwyczajne właściwości.
W rzeczywistości są to zwykle
polimery bazujące na polistyrenie sieciowanym diwinylobenzenem w ilości 0,5-2%. Szacuje
się, że żywice oparte o polistyren
stanowią 90% wszystkich nośników stosowanych w syntezie
organicznej. W praktyce wybór
żywicy zastosowanej do syntezy
peptydu zależy od struktury syntezowanego peptydu (np. od tego
czy syntezowany peptyd ma posiadać wolna grupę karboksylową
na C-końcowym aminokwasie,
czy też grupę amidową) oraz
czy peptydy posiadają krótki,
czy długi łańcuch. W przypadku
peptydów dłuższych stosuje się
nośniki o mniejszym osadzeniu
grup funkcyjnych.
Oczyszczanie i analiza
Oczyszczanie peptydów należy
do czynności o dużej trudności.
Pozostające w próbce zanieczyszczenia często bowiem są też
peptydami o podobnej strukturze. Proces oczyszczania komplikuje często fakt możliwości zmian
chemicznych w trakcie przygotowania próbki lub samego
40
rozdziału. Przykładami jest utlenianie wolnych reszt cysteiny do
wiązań disulfidowych, cyklizacja
N- końcowej glutaminy do kwasu
piroglutaminowego czy modyfikacja reszt aminokwasów poprzez przyłączanie się aktywnych
pochodnych osłon podczas
deprotekcji z nośnika. Pierwszymi
sposobami
oczyszczania peptydów była klasyczna
chromatografia
kolumnowa
na krzemionce. Szybko jednak
została wyparta przez filtrację
żelową na złożach Sephadex oraz
chromatografię jonowymienną.
Do lat 80-tych techniki te były
jedynymi sprawnymi sposobami
oczyszczania syntetycznych peptydów. Wraz z wprowadzeniem
do chemii wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC),
metody te często mają znaczenie
historyczne i młode pokolenie
badaczy zajmujących się peptydami nawet ich nie umie. HPLC
w układzie faz odwróconych
wymaga jednak drogiego sprzętu
co powoduje, że w obecnych
czasach nie wszystkie zespoły
naukowe są zdolne do samodzielnej syntezy i oczyszczania peptydów. Najprostszy chromatograf
preparatywny wraz z kolumną
kosztuje około 100 tyś PLN.
Do tego dochodzi koszt eluentów i materiałów oraz kosztów
serwisowania sprzętu, który
jest podatny na awarie. Otrzymanie suchej próbki jest realizowane poprzez suszenie sublimacyjne z użyciem liofilizatorów.
Kolejnym ograniczeniem jest
badanie tożsamości otrzymanych
produktów. Zarówno wykonanie
analizy aminokwasowej (obecnie
odchodzi się od tego) jak i uzyskanie widma masowego wymaga
posiadania
specjalistycznego
sprzętu lub zlecenia drogich
analiz specjalistycznym pracowniom. Zdarza się, że po syntezie otrzymuje się kilka produktów i te koszty są jeszcze wyższe.
W chwili obecnej największe
korzyści przynosi spektrometria
mas z jonizacją techniką desorpcji laserowej na matrycy i analizatorem czasu przelotu (MALDITOF). Najnowocześniejsze spektrometry mas posiadają też
możliwość określenia sekwencji
aminokwasowej oraz przypisania struktury zanieczyszczeniom.
Chemia kombinatoryczna
i niespełnione nadzieje
Możliwość łączenia aminokwasów w różne kombinacje
w połączeniu z metodą syntezy na nośniku polimerowym
zaowocowała rozwojem chemii
równoległej i chemii kombinatorycznej. Do kluczowych
podejść należy procedura opracowana w 1984 r. przez Geysena (osadzanie aminokwasów
na prętach polietylenowych,
które zanurzane są w naczyniach reakcyjnych z odpowiednim aminokwasem), czy rok
później opublikowana metoda
torebek herbacianych Houghtena
(żywica umieszczona w perforowanych torebkach polipropylenowych). Kamieniem milowym
mogła okazać się upubliczniona
w 1988 r. metoda portioning–
mixing Arpada Furki, polegająca
na rezygnacji z kontroli sekwencji syntezowanych peptydów
i wymagająca wyłącznie sekwencyjnego dzielenia i mieszania nośników wraz z peptydami.
Patrząc na liczbę doniesień naukowych związanych z chemią
kombinatoryczną
faktyczne
efekty nie są jednak imponujące.
Laborant Nr 2/2011