Sprawozdanie z warsztatów badawczych na Wydziale Chemii

Sprawozdanie z warsztatów badawczych na Wydziale Chemii Uniwersytetu Warszawskiego
i w laboratoriach innych uczelni i placówek badawczych
W dniach od 22. do 26. lutego bieżącego roku miałam przyjemność uczestniczyć
w warsztatach chemicznych organizowanych przez Krajowy Fundusz na rzecz Dzieci. Głównym
punktem programu (aczkolwiek nie jedynym) były zajęcia w pracowniach naukowych uczelni.
Ja miałam okazję poznać Pracownię Peptydów, znajdującą się w Zakładzie Chemii Organicznej UW,
której kierownikiem jest pani dr hab. Aleksandra Misicka-Kęsik. W dwuosobowym zespole, wraz
z Łukaszem Krawczykiem, mogliśmy przyjrzeć się, jakie problemy badawcze rozpatrują tamtejsi
pracownicy.
Tematyka zajęć dotyczyła syntezy i analizy biologicznie aktywnych analogów peptydów.
Łańcuchy peptydowe powstają naturalnie we wszystkich organizmach żywych. Celem pracowni jest
natomiast wytworzenie tych biologicznie aktywnych związków in vitro. Uzyskane peptydy służą
m. in. do prowadzenia badań nad cytostatykami – lekami stosowanymi w chemioterapii.
Cisplatyna to jedna z substancji najbardziej rozpowszechnionych w walce z nowotworami.
Jest ona słabo przyswajalnym związkiem nieorganicznym, ponieważ zawarta w niej platyna należy
do grupy metali ciężkich, źle tolerowanych przez organizm ludzki. Ponadto, ze względu na budowę
cząsteczek, cisplatyna w małym stopniu przedostaje się do wnętrza żywych komórek.
Dlatego też, w odwiedzonym przez nas zakładzie, opracowuje się nowe substancje, które pozwolą
cytostatykom skuteczniej działać przeciwko chorobom nowotworowym. Wytwarza się krótkie
łańcuchy peptydowe, kompleksujące atomy platyny. Tym samym, otrzymany związek upodabnia
się do membrany komórkowej. Należy spodziewać się, że tak spreparowany lek będzie łatwiej
przechodził przez barierę – błonę cytoplazmatyczną – i swobodnie wnikał do jądra zmutowanej
komórki. Tam zahamuje proces namnażania się komórek nowotworowych, bezpośrednio oddziałując
z nićmi DNA genomu.
W pracowni wykonywaliśmy głównie syntezy oligopeptydów. Niektóre z nich stanowić mogą
podstawę do tworzenia nowych cytostatyków. Jednak najważniejszym celem nie było otrzymanie
produktu, lecz opanowanie różnych technik ich pozyskiwania. Współczesna synteza biopolimerów
(do tej właśnie klasy związków zalicza się peptydy) opiera się na kilku odmiennych metodach.
Ogólnie, sposoby otrzymywania należy podzielić na klasyczne oraz eksperymentalne.
Podczas warsztatów zostały przeprowadzone dwie różnego rodzaju syntezy klasyczne.
Pierwsza z nich przebiegała w roztworze. Reakcji ulegały cząsteczki aminokwasu fenyloalaniny,
tworząc dipeptyd. Omawiany proces zachodził w sposób selektywny, ponieważ do syntezy użyto
substratów z odpowiednio zablokowanymi grupami funkcyjnymi, tak aby otrzymać wyłącznie
pożądany produkt i aby uniemożliwić powstanie długiego polimeru, złożonego z wielu cząsteczek
fenyloalaniny. Postęp reakcji kontrolowano, wykorzystując cienkowarstwową chromatografię
cieczową (TLC). Po jej zakończeniu oczyszczono dipeptyd, a następnie odparowano rozpuszczalniki
do sucha za pomocą wyparki. Wydajność reakcji była bardzo wysoka i wyniosła 95%. Wykonano
również analogiczną syntezę dipeptydu składającego się z histydyny i fenyloalaniny (His-Phe).
Druga metoda otrzymywania łańcuchów peptydowych została wynaleziona w 1962 roku
przez Roberta B. Merrifielda i jest pewną modyfikacją pierwszej. Zamiast w roztworze, przeprowadza
się ją na ciele stałym, które zazwyczaj stanowi żywica. Do nośnika dołącza się początkowy
aminokwas, a później kolejne, tworząc osadzony w fazie stałej biopolimer. Zaplanowano syntezę
dwóch oligopeptydów o strukturach:
• Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Ttds-Asp(COOH)2
• Tyr-Pro-Phe-Phe-Ttds-Glu-COOH.
W laboratorium został wykonany etap dołączenia do każdego z oligopeptydów cząsteczki
Ttds (monoamidu 4,7,10-trioksa-1,13-tridekanodiaminy kwasu bursztynowego). Najpierw należało
Agnieszka Stasiak
1
14 marca 2010
Sprawozdanie z warsztatów badawczych na Wydziale Chemii Uniwersytetu Warszawskiego
i w laboratoriach innych uczelni i placówek badawczych
otrzymać Ttds, acylując 4,7,10-trioksa-1,13-tridekanodiaminę za pomocą bezwodnika kwasu
bursztynowego:
O
H2N
O
NH2
O
O
O
O
+
4,7,10-trioksa-1,13-tridekanodiamina
bezwodnik kwasu
bursztynowego
octan etylu
O
H2N
O
O
O
Ttds
NH
OH
O
Rys. 1. Otrzymywanie Ttds w reakcji 4,7,10-trioksa-1,13-tridekanodiminy z bezwodnikiem kwasu bursztynowego.
Następnie zablokowano N-koniec otrzymanej cząsteczki tak, aby miała ona jedynie reaktywną
grupę karboksylową i mogła reagować selektywnie. W tym celu użyto grupy
9-fluorenylometoksykarbonylowej (w skrócie Fmoc). Dla potwierdzenia, że został uzyskany
oczekiwany produkt (Fmoc-Ttds-COOH), próbkę z mieszaniny reakcyjnej badano za pomocą dwóch
połączonych ze sobą technik: wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz spektrometrii
mas (MS).
Otrzymany związek – Fmoc-Ttds-COOH – posłużył bezpośrednio do syntezy dipeptydów Asp-Ttds
i Glu-Ttds.
Obydwie metody klasyczne mają swoje zalety, jak i wady. Synteza w roztworze
jest wyjątkowo żmudna i czasochłonna (na utworzenie właściwego produktu potrzeba około trzech
godzin). W reakcji powstają trudne do oddzielenia od właściwej substancji produkty uboczne,
a oczyszczenie wszystkich pośrednich związków wymaga dużego nakładu pracy. Przy tym, straty
peptydu spowodowane czynnikami mechanicznymi są już bardzo znaczące. Jednak ważną korzyścią,
którą daje opisywana technika, jest możliwość charakteryzowania otrzymanego półproduktu
po każdym przyłączeniu nowego aminokwasu. Wysoka jest również wydajność syntezy, jeśli będzie
ona prowadzona w odpowiedni sposób.
Synteza na ciele stałym pozwala zredukować oczyszczanie do prostych i szybkich czynności
(tak naprawdę jest to wyłącznie kilkukrotne przemywanie wypełnionej żywicą strzykawki). Ponadto,
cały proces można zautomatyzować. Skróceniu ulegnie wtedy czas reakcji. Lecz podstawowym
minusem tej techniki jest fakt, iż produkt można scharakteryzować dopiero po zakończeniu syntezy
i zdjęciu peptydu z żywicy. Jeśli w roztworze wolno było wydłużać łańcuch na obydwu jego końcach,
to nie można wykonać takiego zabiegu w fazie stałej. W zależności od rodzaju żywicy, syntezę
prowadzi się tylko w jednym kierunku. Podczas warsztatów używano nośnika, który przyłączał
do siebie grupę karboksylową pierwszego aminokwasu, a całą reakcję należało precyzyjnie
zaplanować od C- do N-końca. Problem stanowi także zwijanie się rosnącego łańcucha produktu,
które utrudnia dołączanie kolejnych cząsteczek. W reakcji tworzą się produkty uboczne, z jakich
przede wszystkim należy wymienić powstawanie mieszaniny racemicznej. Otrzymane oligopeptydy
mają podobną budowę strukturalną, ale odmienne jest w nich przestrzenne rozmieszczenie wiązań
atomowych. Taka niewielka różnica często powoduje, że produkt jest łatwo przyswajany
przez organizm ludzki albo może wręcz stanowić dla niego truciznę.
Obecnie wprowadza się nową metodę otrzymywania peptydów i białek. Wykorzystuje
się w niej promieniowanie mikrofalowe jako czynnik przyspieszający tworzenie wiązań peptydowych.
Jest to jednak technika całkowicie eksperymentalna, nad której udoskonaleniem ciągle prowadzi
się badania.
Agnieszka Stasiak
2
14 marca 2010
Sprawozdanie z warsztatów badawczych na Wydziale Chemii Uniwersytetu Warszawskiego
i w laboratoriach innych uczelni i placówek badawczych
Syntezę, identycznie jak poprzednio, przeprowadza się na ciele stałym. W polu
elektromagnetycznym, wytworzonym dzięki mikrofalom, łańcuchy peptydowe ulegają
rozprostowaniu, na skutek czego ich końce są bardziej dostępne dla kolejnych przyłączanych
aminokwasów.
Rys. 2. Osadzony na żywicy łańcuch peptydu w trakcie syntezy ulega zwinięciu na skutek tworzenia się wiązań wodorowych i innych
oddziaływań. Pole elektromagnetyczne, wytworzone przez mikrofale, zapobiega temu procesowi, dlatego łańcuch jest rozprostowany
i N-koniec peptydu staje się łatwiej dostępny dla atakujących go aminokwasów.
Niewątpliwą zaletą użycia mikrofal jest kilkunastokrotny wzrost tempa reakcji (dołączenie
aminokwasu zajmuje 15 minut zamiast trzech godzin). Ponadto produkt otrzymuje się w sposób
bardziej wydajny niż metodami klasycznymi. Należy też zwrócić uwagę, że promieniowanie
mikrofalowe przeciwdziała reakcjom ubocznym, występującym w konwencjonalnej syntezie i pozwala
uzyskać peptyd o dużo większej czystości. Niestety, kluczową rolę w syntezie odgrywa
typ zastosowanej żywicy. Za decydujący czynnik uważa się jej obsadzeni, czyli ilość milimoli peptydu,
jaką jest w stanie zaadsorbować jeden gram nośnika. W rzeczywistości, dla każdego tworzonego
peptydu czy białka, optymalna wartość obsadzenia jest inna i należy zastosować indywidualne
warunki dla poszczególnych syntez. Sprawia to wiele niedogodności podczas prowadzenia
doświadczeń.
W laboratorium rozpoczęliśmy pracę nad wytworzeniem dwóch pentapeptydów o budowie:
• H2N-Met-Phe-D-Arg-Phe-Lys-CONH2
• H2N-Cys-Phe-D-Arg-Phe-Lys-CONH2.
W każdym procesie użyto aminokwasów z zablokowanymi grupami aminowymi. W pierwszym
przypadku zastosowano żywicę o obsadzeniu 0,46 mmol∙g -1. Nie powiodło się jednak dołączenie
do niej nawet początkowego aminokwasu, tj. lizyny. Z kolei druga synteza przebiegała na nośniku
stałym o obsadzeniu 0,64 mmol∙g-1. Tutaj udało się otrzymać dipeptyd Phe-Lys, dalsze dołączenie
kolejnych aminokwasów było niemożliwe ze względu na ich rozbudowaną strukturę.
Synteza przy pomocy mikrofal jest ciekawą i nowatorską metodą, aczkolwiek wymaga jeszcze wielu
badań, by mogła stać się powszechnie stosowaną.
Oprócz pracy nad peptydami, poszerzyłam swoją wiedzę o β-aminokwasach. Budują
one β-peptydy, które wykazują większą odporność na działanie enzymów niż naturalne α-peptydy.
Często są one również dłużej aktywne i bardziej selektywne. β-peptydy wykorzystuje się także
do wytwarzania laktamów oraz antybiotyków. W pracowni wykonano trzy etapy z syntezy
β2-tryptofanu. Pierwszy z nich polegał na zablokowaniu grupy karboksylowej kwasu
3-(3-indolilo)propionowego za pomocą metanolu (była to reakcja estryfikacji, prowadzona
w środowisku chlorku tionylu). Na grupę karboksylową nałożono osłonę, aby nie przereagowała
ona z innymi substratami użytymi w syntezie. Następnie przeprowadzono reakcję utworzenia
Agnieszka Stasiak
3
14 marca 2010
Sprawozdanie z warsztatów badawczych na Wydziale Chemii Uniwersytetu Warszawskiego
i w laboratoriach innych uczelni i placówek badawczych
bezwodnika 3-(3-indolilo)propionowo-propionowego, do którego dołączono pomocnik chiralny:
(+)-10,2-sultam. Związek ten sprawia, że jako ostateczny produkt powstaje tylko jeden z możliwych
enancjomerów o konfiguracji R. Czystość otrzymanego produktu końcowego sprawdzono przy użyciu
spektrometru mas. Wydajność reakcji wyniosła 65%.
Ostatnim wykonanym zadaniem była synteza łącznika, często umieszczanego wewnątrz
badanych peptydów. Łącznik ten w skrócie nazywany jest Bu-O-TEG i powstaje w reakcji estryfikacji
kwasu 3,6,9-trioksaundekanodikarboksylowego (TEG) przy użyciu reszty n-butylowej. Reakcję
katalizowano kationową żywicą jonowymienną i przebiegała ona przez trzy godziny w temperaturze
90°C. Kolba, w której znajdowała się mieszanina reakcyjna, była zabezpieczona chłodnicą zwrotną.
Po zakończeniu procesu zawartość naczynia odparowano do sucha na wyparce. Otrzymano produkt
w postaci klarownego, bezbarwnego oleju. Wynik spektrometrii mas pozwolił wywnioskować,
że (oprócz oczekiwanego łącznika) powstał także dwukrotnie podstawiony ester Bu-O-TEG-O-Bu.
Agnieszka Stasiak
Agnieszka Stasiak
4
14 marca 2010