Zastosowanie HPLC do oznaczania IA-Asp

IDENTYFIKACJA I ANALIZA ILOŚCIOWA IAA ASPARAGINIANU
METODĄ WYSOKOCIŚNIENIOWEJ CHROMATOGRAFII
CIECZOWEJ (HPLC)
WSTĘP
Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (ang. high pressure liquid chromatography, HPLC) jest metodą pozwalającą na identyfikację i analizę kilkudziesięciu składników mieszaniny jednocześnie z zachowaniem wysokiej dokładności. Cechą charakterystyczną tej metody jest bardzo mała średnica ziaren (3-10 µm) nośnika chromatograficznego względem całej fazy stacjonarnej. Im mniejsza średnica ziarna tym większa powierzchnia czynna nośnika i lepszy rozdział chromatograficzny. PowyŜsza cecha stwarza
konieczność stosowania wysokich ciśnień podczas przepływu fazy ruchomej. Wysokie
ciśnienie (nawet do 35 MPa) jest generowane przez pompy wyposaŜone w tłoki tytanowe.
Wysoka rozdzielczość chromatografii pozwala na nanoszenie niewielkich objętości próbek (od 5 do 50µl).
W skład zestawu do HPLC wchodzą:
•
sonifikator: urządzenie usuwające pęcherzyki gazu z roztworu
•
pompa tłocząca eluent,
•
autosampler – urządzenie samoczynnie pobierające próbki, zaopatrzony w dozownik
prób (injector)- strzykawkę z igłą pobierająca zadaną objętość próbki,
•
kolumna chromatograficzna,
•
detektor umoŜliwiający wykrycie rozdzielanych związków chemicznych opuszczających kolumnę
•
komputer pozwalający na rejestrację i integrację wyników chromatografii.
Najczęściej uŜywanym detektorem współpracującym z zestawem HPLC jest spektrofotometr przepływowy mierzący absorbancję w zakresie UV. Pomiar absorbancji odbywa
się w sposób ciągły i nie wymaga kaŜdorazowego pobierania eluatu (wycieku z kolumny)
do kuwety. Auksyny i ich koniugaty zawierają w swojej strukturze pierścień indolowy
wykazujący maksimum absorbancji przy λ= 275 nm, stąd detektor podczas analizy tych
związków ustawiony jest na tę długość fali. Podstawowym parametrem charakteryzującym HPLC jest czas retencji (Rt), czas jaki upływa od nastrzyknięcia związku na kolum-
1
nę do momentu zarejestrowania przez detektor jego największej ilości (szczytu) w wypływie. Porównanie czasów retencji związków wypływających z kolumny z czasami retencji odpowiednich wzorców pozwala na identyfikację składników mieszaniny. Analizę
ilościową wykonuje się w oparciu o wartość pola powierzchni pod szczytem. W tym celu
wykonuje się krzywą kalibracyjną, nastrzykując próbki roztworu wzorcowego w rosnących stęŜeniach. Po integracji chromatogramu z uŜyciem odpowiedniego oprogramowania, naleŜy wykreślić krzywą zaleŜności powierzchni szczytu od stęŜenia (lub ilości)
wzorca. Im większe stęŜenie rozdzielanego związku, tym większe pole powierzchni jego
szczytu.
Najpopularniejszym rodzajem HPLC jest chromatografia podziałowa w odwróconym
układzie faz (ang. reverse phase HPLC, RP-HPLC). Fazę stacjonarną stanowi nośnik
chromatograficzny zawierający idealnie sferyczne cząsteczki SiO2 związane kowalencyjnie z silnie hydrofobowymi łańcuchami węglowodorowymi o osiemnastu atomach węgla
(C18), stąd nazwa oktadecylosilan (ODS). Podczas chromatografii rozdzielane związki
ulegają ciągłemu podziałowi między fazę ruchomą (eluent), a fazę stacjonarną (hydrofobowy nośnik). Podczas rozdziału dwóch związków róŜniących się polarnością (hydrofobowa auksyna- IAA i polarny koniugat, IAA-Asp), związki polarne słabo oddziałują z
nośnikiem hydrofobowym i są szybciej eluowane z kolumny. Natomiast niepolarne substancje wiąŜą się z nośnikiem oddziaływaniami hydrofobowymi i są wymywane niepolarnym eluentem (np.: metanolem). Odwrócenie faz polega więc na zwiększeniu atrakcyjności fazy ruchomej (metanol) dla niepolarnego związku oddziałującego z fazą stacjonarną.
MATERIAŁY I METODY
Materiał:
•
preparat syntetazy IAA-Asp oczyszczonej z niedojrzałych nasion grochu, zamroŜony w -20°C i dializowany przed oznaczeniem wobec buforu: 25 mM Tris-HCl
pH 7,6; 5 mM 2-merkaptoetanol.
Chromatograf cieczowy Waters 717 firmy Waters (USA): kolumna chromatograficzna: C18 Nova Pack (150 x 3.9 mm, 4µm) z przedkolumną (20 x 3.9 mm, 4 µm)
Detektor: spektrofotometr przepływowy UV-Vis
Odczynniki:
•
20 % (v/v) metanol do HPLC
2
•
50 % (v/v) etanol
•
5% (v/v) kwas octowy w 50 % (v/v) etanolu
•
3 % (v/v) kwas trójfluorooctowy (TFA) w 50 % (v/v) etanolu
•
mieszanina wyjściowa: 270 mM Tris-HCl pH 8,6; 27 mM ATP, 27 mM MgCl2
•
32 mM IAA w 50 % (v/v) izopropanolu
•
32 mM kwas asparaginowy
WYKONANIE:
Przygotowanie krzywej kalibracyjnej
Z roztworu IAA-Asp o stęŜeniu 1 mM przygotować 100µl rozcieńczonych roztworów o stęŜeniach: 20µM, 50 µM, 80 µM, 110 µM, 130 µM 160 µM. Do rozcieńczeń
uŜywać 50 % etanol. Proszę obliczyć ilość nmoli IAA-Asp w 50 µl (objętość próbki nanoszona na kolumnę). Przenieść 60 µl kaŜdego z roztworów do szklanych vialek (małych
probówek do HPLC). Roztwory do oznaczeń przechowywać w lodówce.
Oznaczenie aktywności syntetazy IAA-Asp z niedojrzałych nasion grochu
Próba badana: Do probówki Eppendorfa napipetować 50 µl środowiska reakcyjnego oraz
30 µl preparatu enzymu. Próbę inkubować 60 minut w łaźni wodnej w temperaturze 30˚C.
Po czasie inkubacji, zatrzymać reakcję dodając 500 µl zimnego 50 % etanolu. Próbę wymieszać i odwirowć w mikrowirówce przez 5 minut.
Próba zerowa: 50 µl środowiska reakcyjnego inkubować 60 minut, dodać 500 µl zimnego
50% etanolu i na koniec 30 µl preparatu enzymu. Wymieszać i odwirować.
Elucja IAA-Asp z mieszaniny inkubacyjnej metodą chromatografii jonowymiennej
na mikrokolumnie DEAE-Sephadex A-25
DEAE (dietyloaminoetyl) jest anionitem, czwartorzędową aminą alifatyczną związaną
kowalencyjnie z Ŝelem Sephadex. Ze względu na dodatnio naładowany atom azotu, nośnik ten umoŜliwia oddziaływania z ujemnie naładowanymi cząsteczkami, pozwalając na
separację związków róŜniących się ładunkiem elektrycznym oraz wielkością tego ładunku. Podczas niniejszego procesu dochodzi do wymiany jonów. Z nośnikiem oddziałują
składniki mieszaniny obdarzone ładunkiem ujemnym, IAA, Asp, ATP, IAA-Asp. IAA
oraz ATP wykazują słabsze oddziaływania i wymywane są z kolumny 5% kwasem octowym. Asp podobnie jak IAA-Asp, produkt aktywności syntetazy IAA-Asp, ze względu
3
na dodatkową zjonizowaną grupę karboksylową, wiąŜą się silniej z anionitem, a ich elucja z kolumny wymaga odczynnika o większej sile jonowej (kwas trójfluorooctowy).
2 ml zawiesiny DEAE-Sephadex A-25 w 50 % etanolu ułoŜyć w strzykawce o objętości 2
ml. ZłoŜe przemyć 10 objętościami 50 % etanolu, nie dopuścić do wyschnięcia ani zapowietrzenia nośnika. Po chromatografii, nośnik zregenerować dodając do zawiesiny anionitu, octan sodu do końcowego stęŜenia 1M.
500 µl klarownego supernatantu nanieść na powierzchnię kolumienki DEAE-Sephadex
A-25. Po wniknięciu próbki, przemyć złoŜe 1 ml 50 % etanolu. Następnie przemyć złoŜe
10 ml 5% kwasu octowego w 50% etanolu. Pod wylot kolumienki postawić probówkę
kalibrowaną. Na szczyt nanieść 1ml 3 % TFA w 50 % etanolu, IAA-Asp wyeluować 4 ml
3 % TFA w 50 % etanolu. 120 µl eluatu przenieść do vialki.
Przygotowanie zestawu HPLC do chromatografii
UWAGA: Wszystkie roztwory do HPLC powinny być specjalnej czystości, przygotowane z uŜyciem dejonizowanej wody i przesączone pod zmniejszonym ciśnieniem przez
sączek o średnicy porów 0,2 µm. W trakcie pracy chromatografu, musi być przez cały
czas włączony sonifikator. Przestrzegać kolejności włączania urządzeń!
Kolumnę zaopatrzoną w przedkolumnę podłączyć do dolnego i górnego adaptora.
WęŜyk doprowadzający roztwory na kolumnę przenieść do butelki z 20 % metanolem,
włączyć sonifikator, pompę, odkręcić zawór pompy i przepłukać przez 5 minut wybierając opcję PURGE. Zakręcić zawór, zatrzymać pompę (STOP) i z menu wybrać opcję
FLOW, ustawić szybkość przepływu na 0,5 ml/min i przemywać ok. 3 godzin.
Włączyć autosampler , po 5 minutach wybrać opcję PURGE PAGE i przepłukać strzykawkę autosamplera. Czynność powtórzyć 5 razy podczas przemywania całego układu.
Po zrównowaŜeniu kolumny, włączyć detektor. Po kalibracji detektora, włączyć komputer, uruchomić program Millenium 32. Ustawić długość fali detektora na 275 nm.
Do karuzeli autosamplera wstawić probówki zaczynając od pozycji 1.
Chromatografia
W programie Millenium 32, wpisać numery próbek, objętość nastrzykiwaną na kolumnę (50 µl dla wzorców, 100 µl dla eluatu z DEAE-Sephadex A-25 ) i czas retencji (5
4
minut). Uruchomić rozdział chromatograficzny. Po rozdziale wszystkich prób, wykonać
integrację otrzymanych chromatogramów, wydrukować chromatogramy i tabele.
OPRACOWANIE WYNIKÓW
Wykonać tabelę zaleŜności ilości nmoli IAA-Asp od pola powierzchni szczytu dla
IAA-Asp. Obliczyć współczynniki kalibracji dla kaŜdej próbki wzorca i średni współczynnik kalibracji (Kśr). Wykreślić krzywą kalibracyjną. Korzystając ze średniego współczynnika kalibracji, obliczyć aktywność enzymu: nmole IAA-Asp/60 minut wg wzoru:
X= pole powierzchni IAA-Asp pr. badanej – pole powierzchni IAA-Asp próby zerowej x Kśr x 2.
Porównać czas retencji dla IAA-Asp (wzorzec) i produktu reakcji.
5