Racjonalny dobór sprzętu HPLC Poradnik podstawowy

Chromatografia
Racjonalny dobór sprzętu HPLC
Poradnik podstawowy
Bartłomiej Kraska
Laboratorium Badawczo-Rozwojowe, Lipopharm.pl
W obecnych czasach trudno wyobrazić sobie prowadzenie badań
naukowych bez odpowiedniego
sprzętu laboratoryjnego. Niniejszy
przewodnik zakupu sprzętu HPLC
wskaże różnice w elementach oraz
założenia jakie trzeba podjąć.
Począwszy od prostych urządzeń
laboratoryjnych jak mieszadło czy
wirówka, po zaawansowany sprzęt
taki jak różnego rodzaju spektrometry. Od posiadanego sprzętu
bądź też swobodnego do niego dostępu często zależy sukces zespołu
naukowego. Kiedyś jako luksus,
dziś jako narzędzie wręcz niezbędne w laboratorium analitycznym oraz preparatywnym, stanowi wysokosprawny chromatograf
cieczowy (HPLC). Mnogość opcji
zakupu może sprawić duże trudności przede wszystkim osobom
nie mającym wcześniej z takim
urządzeniem styczności. Praktyka pokazuje, że w wielu miejscach
spotkać można urządzenia HPLC
posiadające funkcje, z których
nikt nigdy nie skorzystał i najprawdopodobniej nie zrobi tego
w przyszłości. Zdarza się nawet, że
właściciel urządzenia nie jest świadom potencjału swojego sprzętu.
Natomiast część wydanych niepotrzebnie środków można było
przeznaczyć na inny, bardziej potrzebny sprzęt. Tak więc z opcji
kupna najwyższej klasy urządzenia „na zapas” powinny przystać
tylko bogate instytucje. Dobór
sprzętu pod wieloma względami
4
przypomina zakup samochodu.
Można oczywiście kupić Ferrari
pod wpływem niespodziewanego
przypływu gotówki. Należy jednak
wziąć pod uwagę późniejsze utrzymanie tego auta oraz fakt, że i tak
nie będzie można wykorzystać ponadprzeciętnych jego parametrów.
Wykorzystanie sprzętu
Aby rozsądnie wykorzystać środki na zakup HPLC należy przede
wszystkim ocenić co jest potrzebne, ale również zastanowić się do
jakich zastosowań sprzęt nam
posłuży w przyszłości. Istotnym
czynnikiem będzie też charakter pracy, czy będą to precyzyjne
oznaczenia analityczne, a może
proste badanie czystości np. syntezowanych związków chemicznych. Inne wymagania stawiane są
chromatografom stosowanym w
przemyśle, inne urządzeniom pracującym w laboratoriach badawczych uczelni a jeszcze inne HPLC
kupuje się dla zajęć studenckich.
Należy pamiętać przy tym, że
chromatografy wymagają serwisowania i wymiany elementów
zużywalnych. Nagły brak środków na te cele może uniemożliwić
kontynuację podjętych prac, a w
skrajnych przypadkach zatrzymać pracę całego laboratorium.
Komponenty HPLC
Typowy zestaw HPLC składa się
z jednej lub dwóch pomp wysoko
ciśnieniowych (z mieszalnikiem),
dozownika i detektora. Badany
związek trafia poprzez dozownik, niesiony fazą ruchomą na
kolumnę, gdzie na zasadzie wykorzystywania różnych zjawisk
(np. adsorpcja, wymiana jonowa), ulega rozdzieleniu na złożu
i w różnej kolejności opuszcza
kolumnę. Eluat monitoruj się
za pomocą detektora podłączonego do komputera, co ułatwia
znacznie archiwizację danych.
W zestawach stosuje się jedną
lub dwie pompy HPLC, zwykle
o przepływach 0,01-10 ml/min.
Stosując jedną pompę można uzyskać wyłącznie rozdziały izokratyczne (cały czas płynie ten sam
eluent) lub w przypadku wyposażenia pompy w zawory elektromagnetyczne uzyskać tzw. gradient niskociśnieniowy. Gradient
wysokociśnieniowy uzyskuje się
poprzez niezależną pracę dwóch
lub więcej pomp izokratycznych.
Zestaw izokratyczny jest na początek pracy z HPLC najtańszym
rozwiązaniem. Urządzenie takie
można już kupić za 35 tyś PLN. Z
powodzeniem można analizować
na nim znane związki bazując na
ich monografiach. Jednak nadaje
się on tylko tam gdzie używa się
zazwyczaj tej samej metody (składu fazy ruchomej). Dla każdej nowej, nieznanej substancji trzeba
żmudnie, najczęściej metodami
prób i błędów, szukać właściwego
składu fazy ruchomej. Użytkownik musi się często „wstrzelić”
Laborant Nr 1/2010
Chromatografia
w warunki, co nie jest proste. W
przeciwnym przypadku analizowane substancje zostaną wypłukane z kolumny z objętością
martwą lub zatrzymane na złożu, czyli w obu przypadkach nie
ulegną rozdzieleniu. W zestawie
gradientowym jest pełna kontrola nad składem fazy ruchomej w czasie i można swobodnie dobierać nowe warunki w
oparciu o dwa lub więcej eluenty.
Analizowane próbki wprowadza
się na kolumnę za pośrednictwem dozownika. W przypadku
dozowników ręcznych przydatną
funkcją jest tzw. autostart, który
umożliwia automatyczne uruchamianie pomiaru natychmiast
po nastrzyknięciu próbki. Bar-
www.czasopismolaborant.pl
dzo ważnym elementem dozownika jest pętla nastrzykowa. Pętla określa jaką maksymalną obję
tość próbki można jednorazowo
nanieść na kolumnę. W celach
analitycznych należy stosować pętle w miarę krótkie, o niewielkiej
objętości (zwykle 20 µl) a celach
preparatywnych części powyżej
1 ml. Dobrym, ale drogim rozwiązaniem jest zastosowanie automatycznego podajnika próbek,
autosamplera. Niewątpliwą zaletą
autosamplerów jest możliwość
częściowej bądź pełnej automatyzacji pracy w laboratorium. Pozwala on na zaprogramowanie
kilkudziesięciu analiz. Możliwość
pracy w nocy i w dni wolne od
pracy powoduje, że zestaw HPLC
jest w pełni wykorzystany. Wadą
automatycznych podajników jest
jednak koszt, sięgający 30-50 tyś
PLN oraz ewentualna awaryjność.
Bardzo ważnym elementem każdego zestawu HPLC jest detektor.
Umożliwia to monitorowanie co
wychodzi z kolumny chromatograficznej. Wybierając właściwy
detektor należy pamiętać, że nie
jest to element tani i trzeba o niego
dbać. Detektory za sprawą często
skomplikowanej elektroniki, czułe
są na skoki napięcia a do elementów szczególnie delikatnych mechanicznie należy sama cela pomiarowa podatna na potencjalne
zabrudzenia. W zależności jakie
przepływy się stosuje w detektorach montuje się cele analityczne
5
Chromatografia
lub preparatywne. Na rynku dostępnych jest szereg detektorów
HPLC. Najbardziej uniwersalnym
jest detektor spektrofotometryczny wykorzystujący promieniowanie UV-Vis. Warunkiem, aby
badane związki były widzialne
muszą one posiadać w swej strukturze chromofory. Najtańszym
modelem jest detektor bez możliwości zmiany fali. Wybierając
filtr np. 254 nm można z powodzeniem badać związki posiadające ugrupowania aromatyczne.
Odmianą detektora UV-Vis jest
też detektor z matrycą diodową
(DAD) obrazujący całe spektrum
promieniowania w jakim był badany związek. Do większości analiz wystarcza zakres 200-300 nm.
Na rynku podstępnych jest szereg
innych detektorów do różnych
zastosowań. Są to detektory fluorescencyjne, refraktometryczne,
elektrochemiczne, detektory rozproszenia laserowego, czy masowe.
Kolumna chromatograficzna
Jednym z podstawowych warunków, aby odnieść sukces podczas
pracy z HPLC jest odpowiednia
kolumna. Niestety nie istnieją
kolumny uniwersalne. Co więcej
różne kolumny charakteryzują
się wieloma parametrami co nie
ułatwia wyboru najwłaściwszej
kolumny dla wykonywanych doświadczeń. Podstawową różnicą
jest rodzaj złoża jakimi są wypełnione. Zwykle złoże kolumny stanowi krzemionka o średnicy ziaren
3 lub 5µm. Złoże to jest modyfikowane odpowiednimi ugrupowaniami chemicznymi. Najczęściej
stosuje się ugrupowania oktylowe
(C8) oraz oktadecylowe (C18).
Wypełnienia te stosowane są w
ponad połowie kolumn sprzedawanych na świecie. Wybór kolum6
ny podyktowany jest głównie charakterystyka związków, które mają
być oznaczane. Inne kolumny należy zastosować do peptydów,
inne do tłuszczy, a jeszcze inne
do polimerów. W ofercie znajdują
się także kolumny do zadań specjalnych, np. rozdziału związków
chiralnych czy też związków silnie polarnych (kolumny HILIC).
Szczegółowa charakterystyka kolumn, ich możliwości
oraz zastosowanie zostaną przedstawione w jednym
z kolejnych wydań Laboranta.
Sytuacja komfortowa jest, gdy
eksperymentator ma szczęście
zajmować się tylko jedną, określoną grupą związków chemicznych
to wybór odpowiedniej kolumny
nie jest kłopotliwy. W zupełności wystarczy jedna niedroga, oczywiście pod warunkiem
przestrzegania zasad odpowiedniej pracy oraz jej konserwacji.
Jeżeli zaś praca w laboratorium
ma charakter wszechstronny to
niezbędne będzie zaopatrzenie
się także w inne rodzaje kolumn,
których ceny dochodzą nawet do
kilkunastu tysięcy złotych. Należy jednak uważać na różnego
typu „cudowne” wynalazki, gdzie
producenci obiecują rewelacyjnie krótkie analizy w porównaniu do kolumn standardowych,
gdyż aby osiągnąć takie rezultaty potrzebne są niekiedy specjalne parametry sprzętu HPLC
oraz warunki rozdziału którym
nie będziemy w stanie sprostać.
Aby wydłużyć żywotność kolumn
należy przestrzegać określonych
zasad. Przede wszystkim nie nale
ży stosować wyższych przepływów
niż takich do jakich kolumna jest
przystosowana. W przeciwnym
przypadku złoże może zostać bezpowrotnie uszkodzone. Podobnie
stanie się gdy przekroczy się odpowiednią wartość temperatury
oraz pH fazy ruchomej. Dodatkowo niektóre kolumny (np. kolumny monolityczne) wrażliwe są na
wstrząsy wywołane upadkiem lub
uderzeniem. Sprawność kolumny
można też łatwo utracić nanosząc
wraz z analitem zanieczyszczenia
lub też badając substancje niewskazane dla danego złoża. Może
się również zdarzyć, że pewne
związki dosłownie zaklejają kolumnę, czasem nawet uniemożliwiając jej odblokowanie. Często
kolumny chronione są za pomocą
prekolumny pełniącej rolę filtra.
Pomimo że „zmęczoną” kolumnę
można poddać procesowi regeneracji, warto mieć zaplanowany w budżecie zakup chociażby
używanej, sprawnej kolumny.
Test dostępnych w publikacjach metod regeneracji kolumn zostanie przedstawiony
w jednym z kolejnych wydańLaboranta
Odgazowywanie eluentów oraz
termostatowanie kolumny
Przygotowując eluenty stanowiące fazę ruchomą należy zadbać
o ich dostateczne odgazowanie.
W tym celu można eluent poddać działaniu ultradźwięków
lub odgazować z wykorzystaniem helu. Opcjonalnie można
zastosować profesjonalny degazer wbudowany w urządzenie.
Analizy HPLC są czułe na zmiany temperatury i większość analiz powinna być wykonywania
w warunkach stałej temperatu
Laborant Nr 1/2010
Chromatografia
ry. Podobnie, jeśli istnieje obawa o możliwość krystalizacji
analizowanych związków niskiej
temperaturze. Oferta tych urządzeń jest obecnie na rynku bardzo bogata i znalezienie czegoś
w rozsądnej cenie nie powinno
stanowić większego problemu.
Oprogramowanie
Program obsługujący sterujący
urządzeniami HPLC oraz zbierający i przetwarzający dane jest
drogim, ale niezbędnym elementem każdego współczesnego zestawu. Zwykle chromatografy
pracują tylko z dedykowanym
oprogramowaniem oferowanym
przez producenta. Zdarza się że
potencjalni klienci rezygnują z
zakupu danego modelu właśnie
przez nieintuicyjne, trudne w obsłudze i to nawet przez kwalifikowany serwis oprogramowanie.
Inne oprogramowanie jest zalecane do przemysłu, inne (zwykle
dużo uboższe) dla instytucji naukowych. Nie warto przepłacać
i kupić to, co jest naprawdę potrzebne, gdyż cena oprogramowani stanowi zwykle nawet 1020% ceny całego zestawu HPLC.
Koszty stałe i nieoczekiwane
Pomimo, ze urządzenia HPLC
zwykle nie ulegają częstym awariom, wymagają jednak drobnych
naprawa i przeglądów serwisowych. W urządzeniach modułowych wiele czynności serwisowych można wykonać na własną
rękę. Należy wziąć jednak pod
uwagę potrzebę ewentualnego
wezwania autoryzowanego serwisu. Podczas zakupu wydaje się za
kluczowe poznanie cennika oraz
sposobu realizacji zleceń napraw
przez poszczególne firmy. Sama
robocizna napraw serwisowych
www.czasopismolaborant.pl
może być w standardowej cenie
(200-300 PLN/h) jednak dojazd
do miejsca naprawy może wynieść nawet kilkakrotnie więcej.
Do najczęściej wymienianych
elementów HPLC należą lampa detektora oraz zawory głowic
pomp. Lampy do detektorów UV
mają gwarancję działania obliczoną zwykle na 1000-2000 godzin i
kosztują, w zależności od modelu
i producenta, około 2000 PLN. Do
kosztów stałych należy także zaliczyć organiczną fazę ruchomą oraz
filtry strzykawkowe, które stosuje
się dla zwiększenia żywotności kolumny. Do nieoczekiwanych kosztów należy zaliczyć uszkodzenia
kolumny na wskutek niewłaściwego użytkowania, uszkodzenia
sprzętu poprzez drgania i wibracje czy zatarcie głowicy i uszczelek pompy przez niedopilnowanie uzupełnienia eluentu, bądź
wykrystalizowania soli z roztworów buforowych, używanych jako
modyfikatorów fazy ruchomej.
Myśląc o zakupie zestawu HPLC
warto pamiętać o tym, że na jakość uzyskiwanych wyników
duży wpływ będzie miała czystość
używanych rozpuszczalników, w
tym szczególnie wody. Woda stanowi podstawę w chromatografii faz odwróconych, dlatego na
etapie planowania należy zdecydować czy regularnie będzie się
kupowało wodę o jakości HPLC
w butelkach, czy zakupiony zostanie zestaw do oczyszczania
wody. Decyzja powinna opierać się o prognozę ilości analiz.
Nowy czy używany ?
Wybór czy sprzęt ma być
nowy, czy używany zależy głow
nie od budżetu. Trzeba sobie
jednak zdać sprawę, że starszy nie zawsze znaczy gorszy.
Zwykle silnik, elektronika oraz
obudowa bardzo rzadko ulegają
zużyciu, natomiast elementy zużywalne takie jak lampa UV czy
zawory należy wymieniać z podobną częstością w obu wypadkach. Do dziś dnia w wielu laboratoriach z łatwością można znaleźć
sprawne urządzenia sprzed 20-30
lat. Niekiedy więc zakup dwóch
„używek” może okazać się lepszym pomysłem niż jednego egzemplarza nowego, dzięki czemu
w laboratorium może pracować
więcej niż jedna osoba lub można wykonywać powierzone zadania szybciej przy wykorzystaniu dwóch maszyn jednocześnie.
Jaka firma ?
Najczęściej zadawane pytanie
przed zakupem chromatografu
dotyczy najlepszego producenta
sprzętu. Odpowiedź nie jest łatwa.
W obrębie jednej firmy pojawiają
się modele lepsze bądź gorsze, intuicyjne lub też niewygodne. Nie
zawsze należy kupować najdroższe
modele aby analizy były solidnie
wykonane. Często o zadowolenieu
klienta decyduje odpowiednie
podejście serwisu. Powszechnie
wiadowo, ze każde HPLC ulega drobnym lub poważniejszym
awariom. Odpowiednia reakcja
serwisu, podejście do użytkowników oraz przystepne ceny napraw
są czynnikiem decydujacym o
wybraniu takiej a nie innej fimry.
Trudne jest także zasięganie opinii
osób trzecich lub pytanie o opinię
sprzedawców sprzetu. Przedstawiciele handlowi będą chwalić tylko i wyłącznie oferowany sprzęt.
7