Analiza aktywnych składników leków metodą HPLC Cel ćwiczenia

Analiza aktywnych składników leków
Ćwiczenie: Analiza aktywnych składników leków metodą HPLC
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest ilościowe oznaczenie kofeiny w leku APAP Extra i potwierdzenie
danych podanych przez producenta lekarstwa. Ćwiczenie ma również na celu ugruntowanie
wiedzy dotyczącej chromatografii cieczowej, ze szczególnym naciskiem na chromatografię w
odwróconej fazie.
Wstęp
Chromatografia cieczowa (LC Liquid Chromatography) jest techniką rozdzielania, w
której faza ruchoma jest cieczą. Obecnie zdecydowanie najbardziej popularna jest tzw.
wysokosprawna
chromatografia
cieczowa
(HPLC
–
High
Performance
Liquid
Chromatography).
W HPLC próbka zostaje wprowadzona na kolumnę chromatograficzną pod wysokim
ciśnieniem poprzez fazę ruchomą (eluent). Wypełnieniem kolumny jest faza stacjonarna w
postaci gęsto upakowanych ziaren o średnicy rzędu 3-10 µm lub porowata warstwa
monolityczna (tzw. kolumny monolityczne). HPLC jest historycznie podzielona na dwie różne
podklasy oparte na polaryzacji faz ruchomych i stacjonarnych. Chromatografia, w której faza
stacjonarna jest bardziej polarna niż faza ruchoma (np. toluen jako faza ruchoma,
krzemionka jako faza stacjonarna) określana jest jako chromatografia normalnej fazy (NPLC –
Normal Phase). Gdy jest odwrotnie, (np. woda-metanol jako faza ruchoma i C18
oktadecylosilanowa jako faza stacjonarna) mamy do czynienia z chromatografią w
odwróconej fazie (RPLC – Reverse Phase). W praktyce chromatografia w odwróconej fazie
jest znacznie bardziej popularna od chromatografii w fazie normalnej. Ogólny podział
chromatografii jest przedstawiony na rys. 1
1
Analiza aktywnych składników leków
Rys. 1 Ogólny podział chromatografii cieczowej.
Aparatura:
HPLC:
Chromatograf HPLC Shimadzu (pompy tłokowe, detektor DAD, panel sterujący),
kolumna chromatograficzna Luna (Phenomenex) ze złożem typu C18 (długość 2 cm, średnica
wewnętrzna 2 mm, średnica ziaren złoża 3 μm). Autosampler (opcjonalnie): Famos – LC
Packings Dionex
Rys. 2. Schemat przedstawiający system chromatograficzny stosowany podczas analizy lekarstwa
APAP Extra.
Przygotowanie lekarstwa do analizy:
Moździerz, wirówka, filtry strzykawkowe 0,20 μm z membraną RC (regenerowana
celuloza), Vortex, waga techniczna, waga analityczna
Odczynniki:
Acetonitryl, woda, kwas trifluorooctowy (TFA)
2
Analiza aktywnych składników leków
Wykonanie ćwiczenia:
1. Przygotować 4 roztwory kofeiny dla wykonania krzywej kalibracyjnej wykorzystując
roztwór wzorcowy o stężeniu 0.1 mg/ml (w 50% metanolu)
a. 10 µg/ml
b. 5 µg /ml
c. 2.5 µg /ml
d. 1 µg /ml
Roztwory b-d przygotować przez odpowiednie rozcieńczenie roztworu a wodą
2. Za pomocą iniektora (lub autosamplera) wstrzyknąć każdy z powyższych roztworów
na kolumnę chromatograficzną (zaczynając od najniższego stężenia), wykorzystując
metodę chromatograficzną podaną przez asystenta.
3. Po nastrzyknięciu rozpuszczalnika powtórzyć serię pomiarów, również zaczynając od
najmniejszego stężenia.
4. Wykreślić krzywą kalibracyjną – zależność pola powierzchni pod pikiem (średnia
arytmetyczna dwóch pomiarów) od stężenia kofeiny w roztworze.
5. Pobrać od asystenta jedną pastylkę APAP Extra i zważyć na wadze analitycznej.
6. Utrzeć pastylkę za pomocą moździerza.
7. Odważyć ok. 1 mg lekarstwa i rozpuścić w odpowiedniej objętości 50% roztworu
metanolu w eppendorfie o pojemności 2 ml, tak aby stężenie wynosiło 1mg/ml.
8. Zastanowić się nad ewentualnym rozcieńczeniem próbki wodą przed wstrzyknięciem
na kolumnę chromatograficzną.
9. Za pomocą iniektora (lub autosamplera) wstrzyknąć na kolumnę roztwór lekarstwa
wykorzystując tą samą metodę rozdziału jak w przypadku wykonania krzywej
kalibracyjnej (UWAGA: przed nastrzykiem przepłukać iniektor za pomocą 50%
metanolu – dlaczego?).
10. Odczytać pole powierzchni pod pikiem odpowiadającym czasowi retencji kofeiny.
11. Określić ilość kofeiny w lekarstwie, porównać z ulotką producenta i zanalizować
przyczyny ewentualnych błędów pomiarowych.
3
Analiza aktywnych składników leków
Zagadnienia do opracowania:
Podstawy chromatografii cieczowej, ogólny podział (szczególnie chromatografia
kolumnowa adsorpcyjna, podziałowa, jonowymienna i sitowa). Podstawowe definicje takie
jak: całkowity czas retencji, zerowy czas retencji, zredukowany czas retencji, sprawność
kolumn. Analiza ilościowa (wysokość pików, pole powierzchni pod pikiem), fazy stacjonarne i
ruchome szczególnie dla chromatografii w odwróconej fazie.
Literatura:
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), Katedra Analizy Środowiska,
Uniwersytet Gdański, Gdańsk 2007 (opracownie dostępne na stronie internetowej:
http://www.chem.ug.edu.pl/zas/dydaktyka/dyplomowa/slady_hplc.pdf)
podręcznik Chemii Analitycznej.
4
lub
jakikolwiek