Mycobacterium tuberculosis

Transkrypt

COBAS® AMPLICOR®
Mycobacterium tuberculosis
MTB
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
Informacja dotycząca
zamówienia
AMPLICOR® Respiratory
Specimen Preparation Kit
RSP PREP
100 Tests P/N: 20756903 122
ART: 07 5690 3
US: 83267
AMPLICOR® M. tuberculosis
Positive Control Kit
MTB CTL
10 Sets
P/N: 20756954 122
ART: 07 5695 4
US: 83263
AMPLICOR® Mycobacterium
Amplification Kit
MYCO AMP
96 Tests
P/N: 20756784 122
ART: 07 5678 4
US: 83258
COBAS® AMPLICOR®
M. tuberculosis Detection Kit
MTB DK
100 Tests
P/N: 20757551 122
ART: 07 5755 1
US: 83279
COBAS® AMPLICOR®
Detection Reagents Kit
DK
100 Tests
P/N: 20757470 122
ART: 07 5747 0
US: 83276
COBAS® AMPLICOR®
Conjugate Detection Reagent
CN4
200 Tests
P/N: 20764213 123
ART: 07 6421 3
US: 83305
COBAS® AMPLICOR®
Wash Buffer
WB
500 Tests
P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
COBAS® AMPLICOR®
Internal Control Detection Kit
8/2009, Revision 6.0
IC DK
100 Tests
COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test
P/N: 20757608 122
ART: 07 5760 8
US: 83281
1/30
P/N: 03032129 049
Poniższy zestaw służy do detekcji kontroli wewnętrznej Mycobacterium
amplifikowanej przy użyciu zestawu do amplifikacji AMPLICOR®
Mycobacterium. Detekcja kontroli wewnętrznej jest opcjonalna dla użytkownika.
Przeznaczenie
Test COBAS® AMPLICOR® na obecność Mycobacterium tuberculosis (MTB) jest
testem przeznaczonym do jakościowej detekcji in vitro bakterii kompleksu
M. tuberculosis w próbkach klinicznych na analizatorze COBAS® AMPLICOR®.
Test wykorzystuje łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) oraz technikę
amplifikacji i hybrydyzacji kwasów nukleinowych do detekcji bakterii kompleksu
M. tuberculosis w ciekłych, odkażonych i zagęszczonych próbkach pobranych
z układu oddechowego ludzi, obejmujących odkrztuszoną i indukowaną plwocinę,
popłuczyny oskrzelowe i popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL).
Podsumowanie i objaśnienie testu
Prątki są to kwasooporne, nieruchome bakterie tlenowe w kształcie pałeczek,
nietworzące form przetrwalnikowych. Grupa ta zawiera kilka gatunków patogennych
dla ludzi. Wiele gatunków prątków jest saprofitami w glebie i wodzie. Głównymi
ludzkimi patogenami są gatunki kompleksu Mycobacterium tuberculosis
(M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum i M. microti) oraz M. leprae.
M. tuberculosis jest najważniejszym patogenem z grupy prątków. M. tuberculosis
występuje tylko u ludzi, którzy stanowią jego rezerwuar; prątki gruźlicy
rozprzestrzeniają się w populacji w drodze zakażenia kropelkowego. Około jedna
trzecia populacji na całym świecie to nosiciele M. tuberculosis obarczeni ryzykiem
rozwoju choroby. Szacunkowa liczba osób aktualnie zakażonych prątkami gruźlicy
w Stanach Zjednoczonych wynosi 15 milionów, a rocznie odnotowuje się
18 000 przypadków czynnej gruźlicy1. M. tuberculosis może wywoływać przewlekłą
chorobę płuc, ale również może prowadzić do zakażenia dowolnego narządu
ludzkiego organizmu. Z uwagi na niebezpieczeństwo rozprzestrzeniania się choroby,
możliwość rozwoju szczepów lekoopornych oraz ciężki przebieg schorzenia u osób
zakażonych wirusem HIV-1, szybka diagnostyka mikroorganizmów kompleksu
M. tuberculosis jest niezmiernie ważna. W skali całego świata gruźlica odpowiada za
3 miliony zgonów rocznie oraz 26% przypadków zgonów osób dorosłych w krajach
rozwijających się, których można by było uniknąć1–5.
Do ostatecznego rozpoznania gruźlicy konieczna jest izolacja drobnoustroju
należącego do kompleksu M. tuberculosis. Rutynowe hodowle bakteryjne są
czasochłonne, uzyskanie ostatecznej diagnozy może trwać do ośmiu tygodni.
Najszybszą metodą detekcji prątków jest badanie mikroskopowe rozmazów
kwasoopornych, jest ona jednak mało czuła i nieswoista. Techniki immunologiczne
i serologiczne mają ograniczoną wartość z uwagi na słabą czułość i/lub swoistość6,7.
Analiza kwasów mykolowych pochodzących z prątków przy użyciu
wysokosprawnej chromatografii cieczowej stanowi użyteczne uzupełnienie hodowli
i badań biochemicznych8. Gatunkowo swoiste sondy z kwasów nukleinowych
znacząco poprawiły możliwość szybkiego potwierdzenia wyników hodowli
bakteryjnej w przypadku kilku gatunków prątków9. Udowodniono, że opracowanie
swoistych dla prątków testów opartych na PCR w dalszym stopniu usprawniło
szybką diagnostykę gruźlicy, umożliwiając bezpośrednią detekcję prątków
w próbkach klinicznych10–22.
Zasady procedury
Test COBAS® AMPLICOR® MTB jest oparty na czterech głównych procesach:
przygotowanie próbki; amplifikacja PCR23,24 docelowego DNA przy użyciu
primerów biotynylowanych; hybrydyzacja produktów amplifikacji do sond
oligonukleotydowych swoistych dla elementu docelowego (elementów
docelowych); oraz detekcja produktów amplifikacji związanych z sondami
metodą kolorymetryczną.
2/30
Mycobacterium tuberculosis Test
Test COBAS® AMPLICOR® MTB pozwala na jednoczesną amplifikację
docelowego DNA kompleksu M. tuberculosis oraz wewnętrznej kontroli DNA
Mycobacterium. Odczynnik Master Mix zawiera parę biotynylowanych primerów
swoistych zarówno dla MTB, jak i dla kontroli wewnętrznej Mycobacterium.
Detekcja zamplifikowanego DNA kontroli wewnętrznej Mycobacterium jest
opcjonalna i zależna od użytkownika.
Przygotowanie próbki
Próbki pochodzące z układu oddechowego ludzi, obejmujące odkrztuszoną lub
indukowaną plwocinę, popłuczyny oskrzelowe i BAL (popłuczyny oskrzelowopęcherzykowe), upłynnione i odkażone za pomocą NALC-NaOH25, NaOH25 lub
SDS-NaOH26,27, po zagęszczeniu są przemywane roztworem do przemywania próbek
z dróg oddechowych. Drobnoustroje ulegają lizie przez inkubację w odczynniku
lizującym do próbek z dróg oddechowych, a próbka po dodaniu odczynnika
neutralizującego do próbek z dróg oddechowych jest gotowa do amplifikacji.
Amplifikacja PCR
Wybór sekwencji docelowej
Wybór docelowej sekwencji DNA jest uzależniony od identyfikacji regionów
w obrębie genomu prątka wykazujących maksymalny konserwatyzm spośród
gatunków kompleksu M. tuberculosis. Co za tym idzie, właściwa selekcja
primerów i sondy ma kluczowe znaczenie dla zdolności testu do wykrycia
wszystkich drobnoustrojów należących do kompleksu M. tuberculosis. Genom
Mycobacterium zawiera region liczący około 1500 nukleotydów, który koduje
gen dla 16S rRNA. Test COBAS® AMPLICOR® MTB wykorzystuje swoiste dla
gatunku Mycobacterium biotynylowane primery KY18 i KY75 w celu określenia
sekwencji około 584 nukleotydów w tym regionie.28,29,30
Amplifikacja sekwencji docelowej
Poddane obróbce próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do
amplifikacji (A-tubes), gdzie zachodzi PCR. Mieszanina reakcyjna jest podgrzewana
w celu denaturacji dwuniciowej helisy DNA oraz odsłonięcia sekwencji docelowych
primerów. Po ochłodzeniu się mieszaniny, biotynylowane primery KY18 i KY75
ulegają przyłączeniu do docelowej nici DNA. Termostabilna polimeraza DNA
pochodząca z bakterii Thermus aquaticus (Taq pol) w obecności jonów Mg2+
i nadmiaru trójfosforanów dezoksynukleotydów (dNTP), w tym trójfosforanu
dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksycytydyny i dezoksyurydyny
(zamiast dezoksytymidyny), wydłuża zhybrydyzowane primery wzdłuż sekwencji
docelowych i tworzy sekwencję DNA zwaną amplikonem. Analizator COBAS®
AMPLICOR® automatycznie powtarza powyższy proces przez określoną liczbę
cykli, w każdym z nich skutecznie podwajając ilość DNA amplikonu.
Amplifikacja kontroli wewnętrznej
W procesach amplifikacji wykorzystujących enzymy, takich jak PCR, zawartość
inhibitorów w próbce klinicznej może skutkować zmniejszoną wydajnością
amplifikacji. Do testu COBAS® AMPLICOR® MTB dodano kontrolę wewnętrzną
Mycobacterium, aby umożliwić identyfikację poddanych obróbce próbek
zawierających substancje, które mogą zakłócać amplifikację PCR. Kontrola
wewnętrzna Mycobacterium jest to plazmid DNA z regionami wiążącymi primery
identycznymi jak te w sekwencji DNA MTB, losową sekwencją wewnętrzną
o podobnej długości i składzie zasad jak sekwencja docelowa MTB, oraz unikatowym
regionem wiążącym sondę, który pozwala na odróżnienie kontroli wewnętrznej
Mycobacterium od amplikonu docelowego. Powyższe cechy wybrano, aby zapewnić
równoważną amplifikację DNA kontroli wewnętrznej Mycobacterium i badanego
MTB. Kontrola wewnętrzna Mycobacterium jest wprowadzana do każdej z reakcji
amplifikacji i ulega równoczesnej amplifikacji z DNA docelowym próbki klinicznej.
Detekcja kontroli wewnętrznej MTB jest opcjonalna i zależna od użytkownika.
3/30
Amplifikacja wybiórcza
Wybiórczą amplifikację docelowego DNA z próbki klinicznej w teście COBAS®
AMPLICOR® MTB uzyskano dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase LD (uracyloN-glikozylazy)31. Enzym AmpErase LD został oczyszczony, aby usunąć potencjalne
zanieczyszczenie bakteryjnym DNA. Enzym AmpErase LD rozpoznaje i katalizuje
rozkład nici DNA zawierających dezoksyurydynę, nie wpływając na DNA
zawierający dezoksytymidynę. Dezoksyurydyna nie jest obecna w występującym
w naturze DNA, lecz jest zawsze obecna w amplikonie z uwagi na użycie
trójfosforanu dezoksyurydyny w miejsce trójfosforanu dezoksytymidyny jako
jednego z dNTP w odczynniku Master Mix. Dlatego też tylko amplikon zawiera
dezoksyurydynę. Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość zanieczyszczającego
amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase LD przed amplifikacją docelowego
DNA. Enzym AmpErase LD katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę
w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie pierścienia dezoksyrybozy
w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym w pH
zasadowym odczynnika Master Mix, łańcuch amplikonu DNA pęka w pozycji
dezoksyurydyny, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym
AmpErase LD jest nieczynny w temperaturach powyżej 55°C, tj. w czasie trwania
całego cyklu termicznego, dlatego też nie niszczy on amplikonu docelowego. Po
amplifikacji całość pozostałego enzymu ulega denaturacji przez dodanie roztworu
denaturującego, zapobiegając w ten sposób degradacji dowolnego amplikonu
docelowego. Wykazano, że enzym AmpErase LD w teście COBAS® AMPLICOR®
MTB inaktywuje co najmniej 103 kopii amplikonu MTB zawierającego
dezoksyurydynę na jedną reakcję PCR.
Reakcja hybrydyzacji
Po amplifikacji PCR, analizator COBAS® AMPLICOR® automatycznie dodaje
roztwór denaturujący do probówek A-tube w celu chemicznej denaturacji
amplikonu MTB oraz amplikonu wewnętrznej kontroli Mycobacterium
i uzyskania jednoniciowego DNA. Próbki zdenaturowanego amplikonu przenosi
się następnie do naczynek D używanych do oznaczeń. Do poszczególnych
naczynek D dodaje się zawiesiny magnetycznych cząsteczek pokrytych sondą
oligonukleotydową swoistą dla kompleksu M. tuberculosis (KY172T3) lub
wewnętrznej kontroli Mycobacterium (SK535). Znakowane biotyną amplikony
MTB i wewnętrzna kontrola Mycobacterium ulegają hybrydyzacji ze swoistymi
dla badanego materiału sondami oligonukleotydowymi związanymi
z cząsteczkami magnetycznymi. Hybrydyzacja amplikonów ze swoistą dla
badanego materiału sondą zwiększa ogólną swoistość testu.
Reakcja detekcji
Bezpośrednio po reakcji hybrydyzacji analizator COBAS® AMPLICOR®
przepłukuje cząstki magnetyczne w naczynkach D w celu usunięcia niezwiązanego
materiału, a następnie dodaje koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej. Koniugat
awidyny i peroksydazy chrzanowej wiąże się ze znakowanymi biotyną amplikonami,
które uległy hybrydyzacji ze swoistymi dla badanego materiału sondami
oligonukleotydowymi związanymi z cząsteczkami magnetycznymi. Analizator
COBAS® AMPLICOR® usuwa niezwiązany kompleks, płucząc cząsteczki
magnetyczne, a następnie do każdego naczynka D dodaje roztwór substratów
zawierający nadtlenek wodoru oraz 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę (TMB).
W obecności nadtlenku wodoru peroksydaza chrzanowa związana z cząsteczkami
katalizuje utlenianie TMB, tworząc barwny kompleks, którego absorbancję mierzy
analizator COBAS® AMPLICOR® przy długości fali 660 nm.
4/30
Odczynniki
RSP PREP
AMPLICOR® zestaw do przygotowywania
próbek z dróg oddechowych
100 testów P/N: 20756903 122
ART: 07 5690 3
US: 83267
2 x 25 ml
RW
(roztwór do przemywania próbek z dróg oddechowych)
bufor Tris-HCl
< 1% substancja ułatwiająca rozpuszczanie
EDTA
0,05% azydek sodu
RL
(odczynnik lizujący do próbek z dróg oddechowych)
0,2% wodorotlenek sodu
EDTA
0,05% azydek sodu
3 x 6 ml
RN
(odczynnik neutralizujący do próbek z dróg oddechowych)
bufor Tris-HCl
chlorek magnezu
0,05% azydek sodu
2 x 5 ml
MTB CTL
10 zestawów P/N: 20756954 122
AMPLICOR®
M. tuberculosis Positive Control Kit
ART: 07 5695 4
US: 83263
AMPLICOR® M. tuberculosis zestaw kontroli dodatniej
MTB (+) C
[kontrola (+) M. tuberculosis]
bufor Tris-HCl
< 0,001% niezakaźny plazmid DNA (bakteryjny)
zawierający sekwencje M. tuberculosis
< 0,005% poly rA RNA (syntetyczny)
EDTA
0,05% azydek sodu
10 × 0,75 ml
AMPLICOR® Mycobacterium MYCO AMP 96 testów P/N: 20756784 122
Amplification Kit
ART: 07 5678 4
US: 83258
AMPLICOR® Mycobacterium zestaw do amplifikacji
MYCO MMX
(Odczynnik Mycobacterium Master Mix)
bufor Tris-HCl
glicerol
< 0,01% AmpliTaq® (polimeraza DNA Taq, bakteryjna)
< 0,001% dATP, dCTP, dGTP, dUTP
< 0,005% primery KY18 i KY75, biotynylowane
0,05% azydek sodu
3 x 1,7 ml
5/30
3 x 0,1 ml
AmpErase LD enzyme
(uracylo-N-glikozylaza z niską zawartością DNA)
bufor Tris-HCl
< 0,01% uracylo-N-glikozylaza (bakteryjna)
EDTA
ditiotreitol
glicerol
chlorek sodu
0,05% azydek sodu
MYCO IC
3 x 0,1 ml
(kontrola wewnętrzna Mycobacterium)
bufor Tris-HCl
< 0,001% niezakaźny plazmid DNA (bakteryjny)
zawierający sekwencje wiążące Mycobacterium, identyczne
z docelowym DNA MTB i unikatowy region wiążący sondę.
EDTA
barwnik amarantowy
0,05% azydek sodu
MYCO (–) C
[kontrola (–) Mycobacterium]
bufor Tris-HCl
EDTA
0,05% azydek sodu
1 x 0,75 ml
100 testów P/N: 20757551 122
COBAS® AMPLICOR®
MTB DK
ART: 07 5755 1
COBAS® AMPLICOR® zestaw do detekcji M. tuberculosis
US: 83279
MT PS1
1 x 100 testów
(zawiesina 1 sondy MTB)
bufor MES
< 0,3% zawiesina cząsteczek Dynabeads® (o właściwościach
paramagnetycznych) pokrytych oligonukleotydową sondą
wychwytującą, swoistą dla MTB (KY172T3)
0,09% azydek sodu
MT4
bufor fosforanu sodu
29,9% tiocyjanian sodu
chlorek sodu
< 0,2% substancja ułatwiająca rozpuszczalność
29,9% (udział wagowy) tiocyjanian sodu
+
Xn
1 x 100 testów
Produkt szkodliwy
6/30
COBAS® AMPLICOR®
100 testów P/N: 20757470 122
DK
ART: 07 5747 0
COBAS® AMPLICOR® zestaw odczynników do detekcji US: 83276
DN4
(roztwór denaturujący)
1,6% wodorotlenek sodu
EDTA
błękit tymolowy
1,6% (udział wagowy) wodorotlenek sodu
+
Xi
1 x 100 testów
Produkt drażniący
CN4
1 x 100 testów
(koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej)
bufor Tris-HCl
< 0,001% koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej
surowicza albumina bydlęca (ssacza)
Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.)
0,1% fenol
1% substancja konserwująca ProClin® 150
SB3
(substrat A)
roztwór cytrynianu
0,01% nadtlenek wodoru
0,1% substancja konserwująca ProClin® 150
5 x 75 testów
SB
(substrat B)
0,1% 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB)
40% dimetyloformamid (DMF)
5 x 5 ml
T
40% (udział wagowy) dimetyloformamid (DMF)
Produkt toksyczny
R: 61-20/21-36
Może działać szkodliwie na dziecko
w łonie matki. Działa szkodliwie
przez drogi oddechowe i w kontakcie
ze skórą. Działa drażniąco na oczy.
S: 53-45
Unikać narażenia - przed użyciem
zapoznać
się
z
instrukcją.
W przypadku awarii lub jeżeli źle się
poczujesz, niezwłocznie zasięgnij
porady lekarza - jeżeli to możliwe,
pokaż etykietę.
7/30
COBAS® AMPLICOR®
200 testów P/N: 20764213 123
CN4
ART: 07 6421 3
COBAS® AMPLICOR® odczynnik do detekcji koniugatu US: 83305
CN4
2 x 100 testów
bufor Tris-HCl
< 0,001% koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej
surowicza albumina bydlęca (ssacza)
Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.)
0,1% fenol
1% substancja konserwująca ProClin® 150
COBAS® AMPLICOR®
WB
Wash Buffer
COBAS® AMPLICOR® bufor płuczący
500 testów P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
WB
(10X-koncentrat płuczący)
< 2% bufor fosforanowy
< 9% chlorek sodu
EDTA
< 2% detergent
0,5% substancja konserwująca ProClin® 300
2 x 250 testów
Ostrzeżenia i środki ostrożności
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Niniejszy test jest przeznaczony do użycia wyłącznie z upłynnionymi,
odkażonymi i zagęszczonymi próbkami pobranymi z układu oddechowego od
ludzi, włączając odkrztuszoną i indukowaną plwocinę, popłuczyny oskrzelowe
i BAL, które zostały upłynnione, odkażone i zagęszczone przy użyciu metod
wykorzystujących NALC-NaOH25, NaOH25 lub SDS-NaOH26,27.
Nie pipetować za pomocą ust.
Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych laboratorium. Przy
obchodzeniu się z próbkami i odczynnikami z zestawów stosować jednorazowe
rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Dokładnie
umyć ręce po pracy z próbkami i odczynnikami testowymi.
Unikać skażenia odczynników bakteriami podczas pobierania porcji z butelek
z odczynnikami. Zaleca się stosowanie jałowych, jednorazowych pipet oraz
końcówek pipet.
Nie łączyć odczynników z różnych serii ani z różnych butelek z tej samej serii.
Wyrzucić wszystkie nieużyte odczynniki, postępując zgodnie z przepisami
krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi.
Nie używać zestawu po upływie daty ważności.
Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (Material Safety Data Sheets –
MSDS) są dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche.
Praca w laboratorium musi przebiegać w sposób jednokierunkowy – należy ją
rozpocząć w obszarze przedamplifikacyjnym i przemieszczać się jednokierunkowo
w stronę obszaru poamplifikacyjnego (amplifikacji/detekcji). Czynności poprzedzające
8/30
proces amplifikacji muszą zaczynać się od przygotowania odczynników, a następnie
przygotowania próbki. Materiały i wyposażenie muszą być przeznaczone wyłącznie do
określonej czynności poprzedzającej proces amplifikacji; nie wolno używać ich do
innych czynności ani przemieszczać między obszarami. W każdym obszarze konieczne
jest używanie rękawiczek, które należy zmienić przed opuszczeniem danego obszaru.
Wyposażenie i materiały zastosowane do przygotowania odczynnika nie mogą być
używane podczas czynności związanych z przygotowywaniem próbki lub
pipetowaniem albo obróbką zamplifikowanego DNA lub innych źródeł docelowego
DNA. Materiały i urządzenia używane w czynnościach po amplifikacji muszą
pozostawać zawsze w obszarze poamplifikacyjnym.
Z próbkami należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym, stosując
laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak określone w dokumentach
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories32 oraz w CLSI
Document M29-A333. Dokładnie wyczyścić i zdezynfekować odpowiednim
roztworem dezynfekującym wszystkie powierzchnie pracy.
Odczynniki RW, RL, RN, MYCO MMX, AmpErase LD enzyme, MYCO IC,
MTB (+) C, MYCO (–) C i MT PS1 zawierają azydek sodu. Azydek sodu może
reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub
miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory
zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać je dużą
ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków.
Podczas obchodzenia się z odczynnikami RW, RL, RN, MYCO MMX, MT4, DN4,
CN4, SB3, SB i substratem roboczym (zmieszane odczynniki SB3 i SB) należy mieć
na sobie ochronę oczu, fartuch laboratoryjny i jednorazowe rękawiczki. Unikać
kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli
dojdzie do kontaktu, natychmiast spłukać dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną
podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania wspomnianych
odczynników należy przed wytarciem plam rozcieńczyć je wodą.
Należy unikać kontaktu SB i substratu roboczego ze skórą i błonami śluzowymi.
Jeżeli dojdzie do kontaktu ze skórą, natychmiast spłukać dużą ilością wody.
Dimetyloformamid zawarty w SB i substracie roboczym może działać szkodliwe
na płód w łonie matki; opisywano ponadto działania toksyczne po doustnym
przyjęciu dużych dawek. Należy unikać kontaktu ze skórą, wdychania oparów
oraz spożycia. Jeżeli dojdzie do kontaktu ze skórą, dokładnie spłukać za pomocą
mydła i wody oraz natychmiast zwrócić się o pomoc medyczną.
Do przygotowania próbek i kontroli należy bezwzględnie używać probówek
zakręcanych, aby uniknąć rozpryśnięcia próbki i możliwości krzyżowego
skażenia próbek. Nie należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym.
Wymagania dotyczące przechowywania i użytkowania
Nie zamrażać odczynników.
RW, RL i RN należy przechowywać w temperaturze 2–25°C. Jeżeli nie zostały
otwarte, odczynniki te są trwałe do upływu wymienionej daty ważności.
Odczynniki MYCO MMX, MYCO IC i AmpErase LD enzyme należy
przechowywać w temperaturze 2–8°C. Jeżeli nie zostały otwarte, odczynniki te są
trwałe do upływu wymienionej daty ważności. Po otwarciu odczynnik roboczy Master
Mix (przygotowany przez dodanie enzymu AmpErase LD enzyme i odczynnika
MYCO IC do MYCO MMX) musi być przechowywany w temperaturze 2–8°C i jest
trwały przez 4 tygodnie.
9/30
MTB (+) C i MYCO (–) C należy przechowywać w temperaturze 2–8°C.
Odczynniki te są trwałe do upływu podanej daty ważności.
Przechowywać MT PS1 i MT4 w temperaturze 2–8°C. Odczynniki te są trwałe
do upływu podanej daty ważności. Po zmieszaniu MT PS1 i MT4 odczynnik
roboczy jest trwały przez 30 dni w temperaturze 2–8°C. Odczynnik roboczy
może być używany maksymalnie przez sześć cykli pracy urządzenia (12 godzin
na cykl) i pomiędzy cyklami pracy urządzenia musi być przechowywany
w temperaturze 2–8°C.
DN4 należy przechowywać w temperaturze 2–25°C. DN4 jest trwały do upływu
podanej daty ważności. Po otwarciu DN4 jest trwały przez 30 dni w temperaturze
2–8°C lub do upływu daty ważności (zależnie od tego, który termin jest
wcześniejszy). DN4 można stosować w ciągu maksymalnie sześciu cykli pracy
urządzenia (12 godzin na cykl), a między poszczególnymi cyklami należy go
przechowywać w temperaturze 2–8°C.
CN4 należy przechowywać w temperaturze 2–8°C. CN4 jest trwały do upływu
podanej daty ważności. Po otwarciu CN4 jest trwały przez 30 dni w temperaturze
2–8°C lub do upływu daty ważności (zależnie od tego, który termin jest
wcześniejszy). CN4 można stosować w ciągu maksymalnie sześciu cykli pracy
urządzenia (12 godzin na cykl), a między poszczególnymi cyklami należy go
przechowywać w temperaturze 2–8°C.
SB3 i SB należy przechowywać w temperaturze 2–8°C. Jeżeli nie zostały
otwarte, odczynniki te są trwałe do upływu podanej daty ważności. Substrat
roboczy musi być przygotowywany codziennie przez zmieszanie SB3 z SB.
Substrat roboczy w analizatorze COBAS® AMPLICOR® jest trwały przez
16 godzin. SB3, SB ani substratu roboczego nie należy poddawać działaniu
metali, środków utleniających lub bezpośredniego światła.
WB należy przechowywać w temperaturze 2–30°C. WB jest trwały do upływu
podanej daty ważności. Zbadać WB oraz, jeżeli jest to konieczne, ogrzać
w 30–37°C w celu ponownego rozpuszczenia ewentualnego osadu. Roboczy
bufor płuczący (1X), przygotowany przez rozcieńczenie WB wodą destylowaną
lub dejonizowaną, powinien być przechowywany w pojemniku na bufor płuczący
analizatora COBAS® AMPLICOR® w temperaturze 2–25°C; bufor jest trwały
przez 2 tygodnie od daty przygotowania.
Pomiędzy przebiegami pracy urządzenia częściowo zużyte odczynniki służące do
detekcji należy przechowywać w temperaturze 2–8°C. Przed wprowadzeniem do
analizatora COBAS® AMPLICOR® odczynników z otwartych opakowań lub
odczynników roboczych należy sprawdzić ich datę ważności.
Dostarczane materiały
RSP PREP
AMPLICOR® zestaw do przygotowywania
próbek z dróg oddechowych
P/N: 20756903 122
ART: 07 5690 3
US: 83267
RW
(roztwór do przemywania próbek z dróg oddechowych)
RL
(odczynnik lizujący do próbek z dróg oddechowych)
RN
(odczynnik neutralizujący do próbek z dróg oddechowych)
10/30
AMPLICOR® M. tuberculosis
MYCO CTL
Positive Control Kit
AMPLICOR® M. tuberculosis zestaw kontroli dodatniej
P/N: 20756954 122
ART: 07 5695 4
US: 83263
MTB (+) C
[kontrola (+) M. tuberculosis]
AMPLICOR® Mycobacterium
MYCO AMP
Amplification Kit
AMPLICOR® Mycobacterium zestaw do amplifikacji
P/N: 20756784 122
ART: 07 5678 4
US: 83258
MYCO MMX
(odczynnik Mycobacterium Master Mix)
AmpErase LD enzyme
(uracylo-N-glikozylaza z niską zawartością DNA)
MYCO IC
(kontrola wewnętrzna Mycobacterium)
MYCO (–) C
[kontrola (–) Mycobacterium]
COBAS® AMPLICOR®
MTB DK
COBAS® AMPLICOR® zestaw do detekcji M. tuberculosis
P/N: 20757551 122
ART: 07 5755 1
US: 83279
MT PS1
MT4
COBAS® AMPLICOR®
DK
COBAS® AMPLICOR® zestaw odczynników do detekcji
P/N: 20757470 122
ART: 07 5747 0
US: 83276
DN4
(roztwór denaturujący)
CN4
SB3
(substrat A)
SB
(substrat B)
P/N: 20764213 123
COBAS® AMPLICOR®
CN4
ART: 07 6421 3
COBAS® AMPLICOR® odczynnik do detekcji koniugatu US: 83305
CN4
COBAS® AMPLICOR®
Wash Buffer
COBAS® AMPLICOR® bufor płuczący
WB
P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
WB
10X-koncentrat płuczący
11/30
Materiały wymagane, lecz niedostarczane
Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania
odczynników
– Pierścień A przeznaczony do analizatora COBAS® AMPLICOR®
z wbudowanymi 12 probówkami A-tube
– Statyw pierścienia A przeznaczony do analizatora COBAS® AMPLICOR®
– Pipeta Eppendorf Multipette® ze zbiorniczkiem Combitip®
o pojemności 1,25 ml (jałowa, pojedynczo pakowana)
– Pipetory (pojemność 100 µl)* z barierą aerozolową lub
z końcówkami z wyrzutnikiem
– Rękawice jednorazowe bezpudrowe
Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania
próbki i kontroli
– Polipropylenowe probówki z zakręcanym korkiem o pojemności
1,5 ml, jałowe, niesilikonizowane, stożkowe (Sarstedt 72.692.105
lub odpowiednik)**
– Statyw na probówki (Sarstedt 93.1428 lub odpowiednik)
– Sterylne pipety transferowe z precyzyjną końcówką
– Pipetory (pojemność 50 µl, 100 µl, 400 µl, 500 µl i 1000 µl)*
z barierą aerozolową lub końcówkami z wyrzutnikiem
– Mikrowirówka (maks. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g);
Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M lub odpowiednik
– Mieszadło wibracyjne
– Blok grzejny 60°C ± 2°C
– Rękawice jednorazowe bezpudrowe
Obszar obróbki poamplifikacyjnej – obszar amplifikacji/detekcji
– Analizator COBAS® AMPLICOR® z drukarką
– Instrukcja obsługi analizatora COBAS® AMPLICOR®
• Opcjonalnie: Oprogramowanie AMPLILINK obejmujące:
– Stacja danych z oprogramowaniem AMPLILINK, wyposażona
w drukarkę
– Podręcznik obsługi programu AMPLILINK w wersji 3.2 Series
do użytku z aparatem COBAS® AmpliPrep, analizatorem
COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS® TaqMan® 48
i analizatorem COBAS® AMPLICOR® (współpracujący
z programem AMPLILINK w wersji 3.2 Series) lub podręcznik
obsługi programu AMPLILINK w wersji 3.3 Series do użytku
z aparatem COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS®
TaqMan®, analizatorem COBAS® TaqMan® 48, analizatorem
COBAS® AMPLICOR® oraz aparatem cobas p 630
(współpracujący z programem AMPLILINK w wersji 3.3
Series)
–
–
–
–
–
–
–
Instrukcja metodyczna do testu COBAS® AMPLICOR® MTB
Stojak na naczynka D
Woda destylowana lub dejonizowana
Pipety serologiczne o pojemności 5 ml
Cylinder miarowy (o pojemności co najmniej 1 litra)
Mieszadło wibracyjne
Rękawice jednorazowe bezpudrowe
*
Dokładność pipetorów musi mieścić się w zakresie 3% podanej objętości. Tam,
gdzie jest to wskazane, konieczne jest stosowanie końcówek z barierą aerozolową
lub wyrzutnikiem, aby zapobiec krzyżowemu skażeniu próbki i amplikonu.
** Do przygotowywania próbek oraz kontroli należy stosować probówki
z zakręcanym korkiem, aby zapobiegać rozlaniu i potencjalnemu skażeniu
krzyżowemu próbek i kontroli. Nie należy stosować probówek z korkiem
zatrzaskowym.
12/30
Pobieranie, transport i przechowywanie próbek
Uwaga
Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie
zakaźnym.
Pobieranie próbek
Jedyne akceptowalne próbki z dróg oddechowych to: (a) odkrztuszona i indukowana
plwocina; (b) popłuczyny oskrzelowe; oraz (c) BAL pobrane do sterylnych,
plastikowych pojemników. Próbki te muszą być płynne, odkażone i zagęszczone przy
użyciu metod wykorzystujących NALC-NaOH25, NaOH25 lub SDS-NaOH26,27.
Transport próbek
Odkażone próbki muszą być przewiezione do laboratorium w temperaturze 2–25°C
pod warunkiem, że dotrą tam w ciągu 24 godzin od chwili pobrania. Jeżeli próbki
nie dotrą do laboratorium w ciągu 24 godzin od chwili pobrania, będą musiały być
przechowywane w temperaturze –70°C i transportowane na suchym lodzie. Próbki
należy przesyłać zgodnie z wszystkimi przepisami krajowymi, wojewódzkimi
i lokalnymi dotyczącymi transportu czynników etiologicznych34.
Przechowywanie próbek Odkażone próbki można przechowywać w temperaturze –70°C do 8 miesięcy.
Przygotowane próbki można przechowywać w temperaturze –70°C do 6 miesięcy
lub do 4 dni w temperaturze 2–8°C.
Instrukcja użytkowania
Uwaga
Szczegółowe informacje na temat obsługi, drukowania wyników i interpretacji
sygnałów oraz komentarzy przedstawiono w (1) podręczniku obsługi
analizatora COBAS® AMPLICOR® lub (2) — w przypadku używania
programu AMPLILINK w wersji 3.2 Series — w podręczniku obsługi programu
AMPLILINK w wersji 3.2 Series współpracującego z aparatem COBAS®
AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS®
TaqMan® 48 i analizatorem COBAS® AMPLICOR®, bądź — w przypadku
używania programu AMPLILINK w wersji 3.3 Series — w podręczniku obsługi
programu AMPLILINK w wersji 3.3 Series współpracującego z aparatem
COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem
COBAS® TaqMan® 48, analizatorem COBAS® AMPLICOR® oraz aparatem
cobas p 630.
Uwaga
Jeśli obróbka próbki, amplifikacja i detekcja wykonywane są w jednym dniu
roboczym, wykonać procedurę, jak opisano poniżej. Jeśli przygotowanie próbki
wykonywane jest w dniu innym niż amplifikacja i detekcja, należy wykonać
przygotowanie odczynników w tym samym dniu co amplifikację i detekcję.
Uwaga
Wszystkie odczynniki muszą mieć temperaturę otoczenia przed użyciem. Tam,
gdzie jest to wskazane, należy używać pipetorów z końcówkami z barierą
aerozolową lub dodatnim wypieraniem. Należy dołożyć wszelkich starań, aby
zapewnić selektywną amplifikację.
Uwaga
Do przygotowania próbek oraz kontroli należy używać probówek z zakręcanym
korkiem, aby zapobiegać rozlaniu i możliwości skażenia krzyżowego próbek.
Nie należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym.
Przygotowanie
odczynników
Wykonywane w: Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania
odczynników
1.
Ustalić odpowiednią liczbę pierścieni A potrzebnych do oznaczenia próbek
pacjentów i kontrolnych. Przy każdej przeprowadzanej reakcji PCR należy
uwzględnić jedną kontrolę (+) M. tuberculosis oraz jedną kontrolę (–)
Mycobacterium (patrz rozdział „Kontrola jakości”). Umieścić pierścień A
w odpowiednim statywie.
13/30
Uwaga
Przygotowanie próbki
i kontroli
Uwaga
14/30
Nawet jeżeli nie będzie się przeprowadzać detekcji MYCO IC, należy dodać
MYCO IC do odczynnika Master Mix.
2.
Wymieszać probówkę z MYCO IC na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund.
Przygotować roboczy odczynnik Master Mix, dodając 100 µl MYCO IC i 100 µl
enzymu AmpErase LD enzyme do jednej fiolki MYCO MMX (mieszanina
wystarcza do przeprowadzenia 32 amplifikacji). Nie jest konieczne odmierzanie
objętości odczynnika Master Mix. Dodać 100 µl MYCO IC i 100 µl enzymu
AmpErase LD enzyme do pełnej fiolki z MYCO MMX. Zamknąć ponownie
probówkę i dokładnie wymieszać zawartość, odwracając 10–15 razy. Nie mieszać
roboczego odczynnika Master Mix na mieszadle wibracyjnym. Zanotować datę
przygotowania odczynnika na fiolce. Wyrzucić puste fiolki po MYCO IC
i enzymie AmpErase LD enzyme. Odczynnik roboczy Master Mix jest trwały
przez 4 tygodnie w temperaturze 2–8°C.
3.
Dodać 50 µl odczynnika roboczego Master Mix do każdej z probówek A-tube,
używając pipetora powtarzalnego ze zbiorniczkiem Combitip o objętości 1,25 ml
lub pipetora wyposażonego w barierę aerozolową lub końcówkę z wyrzutnikiem.
W tym czasie nie należy zamykać korków probówek A-tube.
4.
Umieścić pierścień A zawierający odczynnik roboczy Master Mix w plastikowej
torebce przeznaczonej do wielokrotnego zamykania i zamknąć szczelnie torebkę.
Przenieść pierścienie A do obszaru przedamplifikacyjnego – obszaru
przygotowania próbki i kontroli. Pierścienie A zawierające odczynnik roboczy
Master Mix należy przechowywać w temperaturze 2–8°C w obszarze przed
amplifikacją – przygotowania próbek badanych i kontrolnych, do czasu
zakończenia przygotowywania próbek badanych i kontrolnych. Odczynnik
roboczy Master Mix jest trwały przez 24 godziny w temperaturze 2–8°C
w probówkach A-tube umieszczonych w szczelnie zamkniętej torebce z tworzywa.
Przeprowadzane w: Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar
przygotowania próbki i kontroli
Aby wykonać amplifikację przygotowanych próbek i kontroli należy najpierw
wykonać kroki opisane w części „Przygotowanie odczynników”. Rozmrozić
przygotowane próbki i próbki kontrolne w temperaturze pokojowej i przejść do
etapu 10 z rozdziału „Przygotowanie próbki i kontroli”.
1.
Na każdą próbkę oznaczyć jedną polipropylenową probówkę o pojemności
1,5 ml z zakręcanym korkiem oraz próbkę kontrolną. Nie należy stosować
probówek z korkiem zatrzaskowym. Oznaczyć każdą probówkę do
przygotowania próbek numerem identyfikacyjnym próbki.
2.
Dodać 500 µl RW do każdej probówki z próbką badaną.
3.
Dodać 100 µl płynnej, odkażonej i zagęszczonej próbki z dróg oddechowych
do probówki zawierającej RW. Zamknąć ponownie probówkę i mieszać
przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym.
4.
Odwirować przy prędkości ≥ 12 500 x g przez 10 minut.
5.
Zaaspirować supernatant przy użyciu pipety transferowej z cienką końcówką
i dodać 100 µl RL do peletki, używając do każdej próbki nowej końcówki do
pipet z osłoną aerozolową. Mieszać przez 5 sekund na mieszadle
wibracyjnym do czasu uzyskania zawiesiny z peletki.
6.
Przygotować kontrole robocze w następujący sposób:
Uwaga
Konieczne jest przygotowanie świeżych kontroli roboczych każdego dnia,
w którym wykonywany jest test, a następnie należy je wyrzucić na koniec dnia.
a.
Wymieszać probówkę z MYCO (–) C przez 5 sekund na mieszadle
wibracyjnym. Przenieść 100 µl MYCO (–) C do polipropylenowej probówki
z zakrętką o pojemności 1,5 ml, używając pipetora z końcówką z barierą
aerozolową. Dodać 400 µl RL. Mieszać na mieszadle wibracyjnym przez
5 sekund. Przygotowana próbka jest kontrolą roboczą (–) Mycobacterium.
b. Mieszać probówkę z MTB (+) C przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym.
Przenieść 100 µl MTB (+) C do polipropylenowej probówki z zakrętką
o pojemności 1,5 ml, używając pipetora z końcówką z barierą aerozolową.
Dodać 400 µl RL. Mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund.
Przygotowana próbka jest kontrolą roboczą (+) M. tuberculosis.
c.
Przenieść 100 µl każdej z kontroli roboczych do polipropylenowej
probówki o pojemności 1,5 ml z zakrętką i poddać obróbce równolegle
z próbkami klinicznymi.
7. Inkubować próbki i kontrole w suchym bloku grzejnym w temperaturze
60°C ± 2°C przez 45 minut.
8. Wyjąć probówki z bloku grzejnego i odwirować pulsacyjnie przez 5 sekund,
aby usunąć kondensat z zakrętki.
9. Przy użyciu pipetora z końcówką do pipet z osłoną aerozolową dodać 100 µl
RN do każdej probówki z próbką i próbką kontrolną. Mieszać przez 5 sekund
na mieszadle wibracyjnym przy połowie prędkości maksymalnej. Należy
użyć nowej końcówki z osłoną aerozolową dla każdej próbki i kontroli.
10. Używając pipetora(-ów) z końcówką(-ami) z osłoną aerozolową, przenieść
50 µl każdej przygotowanej próbki chorego, kontroli roboczej (+)
M. tuberculosis i kontroli roboczej (–) Mycobacterium do odpowiednich
probówek A-tube z odczynnikiem roboczym Master Mix. Zachować
ostrożność, aby uniknąć przeniesienia materiału, który mógł nie zostać
ponownie zawieszony. Zamknąć probówki zakrętkami. Odnotować pozycję
próbki (próbek) od chorych i próbki kontrolnej na mapie pierścienia A.
11. Przenieść przygotowane próbki (próbki od pacjentów i próbki kontrolne)
w pierścieniach A do obszaru amplifikacji/detekcji. Przygotowane próbki
można przechowywać w temperaturze 2–8°C do 8 godzin.
Amplifikacja i
detekcja
Przeprowadzane w: Obszar obróbki poamplifikacyjnej – obszar
amplifikacji/detekcji
Należy wykonać następujące codzienne czynności serwisowe:
–
Przecierać stanowisko startowe przy użyciu wilgotnej szmatki pozbawionej
kłaczków, a następnie osuszyć je.
–
Wytrzeć końcówkę statywu na naczynka D wilgotną ściereczką
niezostawiającą włókien, a następnie wysuszyć.
–
Sprawdzić pojemnik buforu płuczącego i napełnić go w razie potrzeby.
–
Przygotować roboczy bufor płuczący (1X) w sposób podany poniżej. Zbadać
WB oraz, jeżeli jest to konieczne, ogrzać w 30–37°C w celu ponownego
rozpuszczenia ewentualnego osadu. Przygotować roboczy roztwór płuczący,
dodając 1 objętość WB do 9 objętości wody destylowanej lub dejonizowanej.
Dobrze wymieszać. Należy dbać o to, żeby w zbiornik buforu płuczącego
przez cały czas zawierał co najmniej 3–4 litry buforu płuczącego (1X).
15/30
–
Opróżnić pojemnik na resztki.
–
Uruchomić analizator COBAS® AMPLICOR®.
–
Podczas uruchamiania systemu sprawdzić strzykawki i przewody.
–
Podczas uruchamiania sprawdzić końcówkę transferową.
Przed każdym przebiegiem oznaczeń:
–
Sprawdzić pojemnik na resztki i opróżnić, jeśli to konieczne.
–
Sprawdzić pojemnik buforu płuczącego i dodać bufor, jeśli to konieczne.
–
Usunąć zużyte statywy na naczynka D.
–
Uruchomić analizator COBAS® AMPLICOR®.
Uruchamianie i obsługa systemu analizatora COBAS® AMPLICOR®
1. Sprawdzić ilości odczynników wewnątrz analizatora COBAS®
AMPLICOR®. Przygotować wystarczającą liczbę kaset z odczynnikami do
wykonania analizy wprowadzonych próbek.
2. Dokładnie wymieszać MT PS1 na mieszadle wibracyjnym. Dodać 2,5 ml
MT PS1 do kasety z MT4. Umieścić kasetę w statywie dla odczynników
specyficznych dla określonego testu. Usunąć zużytą fiolkę MT PS1.
Zanotować datę przygotowania odczynnika na kasecie MT4.
Uwaga
Jeżeli nie będzie wykonywana detekcja kontroli wewnętrznej, przejść do
etapu 4. W przeciwnym razie kontynuować etap 3.
3. Dokładnie wymieszać IC PS1 na mieszadle wibracyjnym. Dodać 2,5 ml
IC PS1 do kasety z IC4. Umieścić kasetę w statywie dla odczynników
specyficznych dla określonego testu. Usunąć zużytą fiolkę IC PS1.
Zanotować datę przygotowania odczynnika na kasecie IC4.
4. Przygotować roztwór substratu roboczego, odpipetowując 5 ml SB do jednej
kasety z SB3. Aby wymieszać roztwór, kilkakrotnie nabrać i usunąć płyn
z pipety. Wyrzucić zużytą fiolkę SB. Odnotować datę przygotowania na
kasecie z SB3.
5. Umieścić substrat roboczy w kasecie z SB3 w statywie dla roztworów
podstawowych.
6. Umieścić kasety z DN4 i CN4 w statywie dla roztworów podstawowych. Na
każdej kasecie odnotować datę jej otwarcia.
7. Oznaczyć ramki na odczynniki jako zwykłe lub określone dla danego testu,
używając klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania
AMPLILINK.
8. Skonfigurować ramki na odczynniki przez wprowadzenie pozycji
odczynników i numerów serii do analizatora COBAS® AMPLICOR®,
AMPLILINK.
9. Załadować statyw na odczynniki do analizatora COBAS® AMPLICOR®,
AMPLILINK. Upewnić się, że każda kaseta z odczynnikami znajduje się
w przypisanym jej miejscu i jest mocno zamocowana w statywie.
10. Umieścić statyw na naczynka D na platformie przeznaczonej dla naczynek D.
Dla każdej reakcji detekcji wymagana jest jedno naczynko D, a dla każdej
kasety z substratem roboczym wymagane są dwa naczynka D, aby umożliwić
wyzerowanie analizatora COBAS® AMPLICOR®.
16/30
11. Umieścić pierścienie A w segmentach termocyklera analizatora COBAS®
AMPLICOR®.
12. Załadować pierścienie A do analizatora COBAS® AMPLICOR®, używając
klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania AMPLILINK.
13. Utworzyć listę roboczą pierścienia A.
14. Szczelnie zamknąć pokrywę segmentu(-ów) termocyklera.
15. Uruchomić analizator COBAS® AMPLICOR®.
16. Zaczekać, aż analizator COBAS® AMPLICOR® wyświetli komunikat
o pomyślnym sprawdzeniu systemu w czasie uruchamiania.
Uwaga
Analizator COBAS® AMPLICOR® umożliwia wykonanie 6 oddzielnych
oznaczeń zawartości każdej probówki A-tube. Analizator COBAS®
AMPLICOR® oblicza wymaganą ilość każdego odczynnika do detekcji,
a przeprowadzone sprawdzanie obciążenia na początku każdego przebiegu testu
pozwala określić, czy dostępna jest wystarczająca ilość odczynników koniecznych
do testów.
17. Analizator COBAS® AMPLICOR® automatycznie wykonuje amplifikację
i detekcję. Wyniki wyrażone są w postaci wartości absorbancji przy długości
fali 660 nm oraz jako wynik dodatni lub ujemny.
Kontrola jakości
Z każdą serią próbek musi zostać przygotowana co najmniej jedna kontrola (+)
M. tuberculosis oraz jedna kontrola (–) Mycobacterium. Jak w przypadku każdej nowej
procedury laboratoryjnej, nowi operatorzy do czasu uzyskania przez nich wysokiej
biegłości w prawidłowym wykonywaniu procedury oznaczenia powinni rozważyć
użycie dodatkowych dodatnich i ujemnych prób kontrolnych podczas każdego
oznaczenia. Nie ma wymagań dotyczących położenia kontroli w pierścieniu A.
Aby upewnić się o prawidłowym przebiegu cyklu, należy sprawdzić sygnały
i komentarze na właściwym dla niego wydruku.
Kontrola ujemna
Absorbancja kontroli (–) Mycobacterium powinna być mniejsza od 0,25 przy
długości fali 660 nm. Jeżeli absorbancja kontroli (–) Mycobacterium jest równa lub
wyższa niż 0,25, cały przebieg oznaczeń jest nieprawidłowy. Należy powtórzyć
cały proces (przygotowanie próbek, amplifikacja i detekcja). Jeśli absorbancja
kontroli (–) Mycobacterium jest znacząco większa niż 0,25, w celu otrzymania
pomocy technicznej należy skontaktować się z miejscowym biurem Roche.
Kontrola dodatnia
Absorbancja kontroli (+) M. tuberculosis przy długości fali 660 nm powinna być
równa lub wyższa niż 2,0. Jeżeli absorbancja kontroli (+) M. tuberculosis wynosi
poniżej 2,0, cały cykl jest nieprawidłowy. Należy powtórzyć cały proces
(przygotowanie próbek, amplifikacja i detekcja). Jeżeli absorbancja kontroli (+)
M. tuberculosis wynosi systematycznie poniżej 2,0, należy skontaktować się
z lokalnym przedstawicielstwem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
Kontrola
Aby zbadać efektywność przygotowywania próbek (zalecane raz w miesiącu),
przygotowywania próbek 104 studzienek z M. tuberculosis należy przygotować w sposób opisany
w rozdziale „Przygotowanie próbki i kontroli”, a następnie zbadać je tak samo
jak próbki kliniczne. Jeżeli próbka została właściwie przygotowana przy użyciu
testu COBAS® AMPLICOR® MTB, powinno się uzyskać wartość absorbancji
większą lub równą 0,35 przy długości fali 660 nm.
17/30
Wyniki
Interpretacja wyników
Interpretacja wyników
Bez użycia detekcji kontroli wewnętrznej
1.
Aby upewnić się o poprawnym przebiegu cyklu, należy sprawdzić sygnały
(FLG, flags) i komentarze umieszczone na wydruku dla danego cyklu. Jeżeli
cykl jest nieprawidłowy, należy powtórzyć go w całości (przygotowanie
próbek, amplifikacja i detekcja).
2.
W przypadku prawidłowego cyklu wyniki próbek interpretuje się
w następujący sposób:
A660
Komentarz
< 0.35
NEGATIVE
Nie wykryto DNA MTB. Próbka przypuszczalnie
nie zawiera M. tuberculosis. Wynik ujemny nie
wyklucza obecności zakażenia MTB, gdyż wyniki
zależne są od odpowiedniego pobrania próbki,
nieobecności inhibitorów oraz obecności
wystarczającej ilości DNA do detekcji.
≥ 0.35
POSITIVE
Wykryto DNA MTB. Wynik dodatni badania
próbki na obecność M. tuberculosis.
Przy użyciu detekcji kontroli wewnętrznej
1.
Aby upewnić się o poprawnym przebiegu cyklu, należy sprawdzić sygnały
(FLG, flags) i komentarze umieszczone na wydruku dla danego cyklu. Jeżeli
cykl jest nieprawidłowy, należy powtórzyć go w całości (przygotowanie
próbek, amplifikacja i detekcja).
2.
W przypadku prawidłowego cyklu wyniki próbek interpretuje się
w następujący sposób:
Wynik próbki MTB
18/30
Interpretacja
Wynik próbki IC
A660
< 0.35
Komentarz
NEGATIVE
A660
≥ 0.35
< 0.35
NEGATIVE
< 0.35
≥ 0.35
POSITIVE
DOWOLNY
Interpretacja
Komentarz
POSITIVE Nie wykryto DNA MTB. Próbka
przypuszczalnie nie zawiera M. tuberculosis.
Wynik ujemny nie wyklucza obecności
zakażenia MTB, gdyż wyniki zależne są od
odpowiedniego pobrania próbki,
nieobecności inhibitorów oraz obecności
wystarczającej ilości DNA do detekcji.
NEGATIVE Wynik ujemny nieważny. Przygotować
następną porcję wyjściowej próbki. Jeżeli
wyjściowa próbka nie jest dostępna,
należy pobrać nową.
DOWOLNY
Wykryto DNA MTB. Wynik dodatni
badania próbki na obecność MTB.
Środki ostrożności dotyczące procedury
Praca w laboratorium musi przebiegać w sposób jednokierunkowy – należy ją
rozpocząć w obszarze przedamplifikacyjnym i przemieszczać się jednokierunkowo
w stronę obszaru poamplifikacyjnego (amplifikacji/detekcji). Czynności
poprzedzające proces amplifikacji muszą zaczynać się od przygotowania
odczynników, a następnie przygotowania próbki. Materiały i wyposażenie muszą być
przeznaczone wyłącznie do określonej czynności przed procesem amplifikacji i nie
wolno używać ich do innych czynności ani przemieszczać między obszarami.
W każdym obszarze konieczne jest używanie rękawiczek, które należy zmienić przed
opuszczeniem danego obszaru. Wyposażenie i materiały zastosowane do
przygotowania odczynnika nie mogą być używane podczas czynności związanych
z przygotowywaniem próbki lub pipetowaniem albo obróbką zamplifikowanego DNA
lub innych źródeł docelowego DNA. Materiały i urządzenia używane w czynnościach
po amplifikacji muszą pozostawać zawsze w obszarze poamplifikacyjnym.
Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia
badania kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej.
Z uwagi na wysoką czułość analityczną niniejszego testu należy zachować
wyjątkową ostrożność, aby zapewnić czystość zestawów odczynników oraz
mieszanin do amplifikacji. Należy ściśle monitorować czystość wszystkich
odczynników. Należy usunąć wszystkie podejrzane odczynniki.
Ograniczenia metody
Niniejszy test został zwalidowany dla płynnych, odkażonych i zagęszczonych próbek
pobranych z układu oddechowego ludzi, włączając odkrztuszoną i indukowaną
plwocinę, popłuczyny oskrzelowe i BAL. Próbki te zostały upłynnione, odkażone
i zagęszczone przy użyciu metod wykorzystujących NALC-NaOH25, NaOH25 lub
SDS-NaOH26,27. Badanie innych rodzajów próbek może dawać wyniki fałszywie
ujemne lub fałszywie dodatnie.
Uzyskanie wiarygodnych wyników zależy od właściwego pobrania próbki,
transportu, przechowywania oraz procedur obróbki.
Detekcja drobnoustrojów kompleksu M. tuberculosis zależna jest od liczby bakterii
obecnych w próbce i mogą na nią mieć wpływ metody pobrania próbki, czynniki
zależne od pacjenta (np. wiek, obecność objawów) i/lub stadium zakażenia.
Wyniki fałszywie ujemne mogą się pojawiać na skutek hamowania polimerazy. Do
testu COBAS® AMPLICOR® MTB dodano kontrolę wewnętrzną Mycobacterium,
aby umożliwić identyfikację poddanych obróbce próbek zawierających substancje,
które mogą zakłócać amplifikację PCR.
Dodanie enzymu AmpErase LD do odczynnika Master Mix zmniejsza ryzyko
skażenia amplikonu. Jednak kontaminacji z dodatnich kontroli MTB i materiałów
klinicznych można uniknąć tylko przez dobre praktyki laboratoryjne i dokładne
realizowanie procedur wyszczególnionych w niniejszym podręczniku metod.
Jak w przypadku każdego testu diagnostycznego, wyniki testu COBAS®
AMPLICOR® MTB należy interpretować z uwzględnieniem wszystkich
dostępnych wyników badania klinicznego i badań laboratoryjnych.
Produktu tego powinny używać wyłącznie osoby wykwalifikowane w technikach PCR.
Niniejszego produktu można używać wyłącznie w analizatorze COBAS®
AMPLICOR®.
19/30
Mutacje w obrębie wysoko konserwatywnego regionu genomu bakteryjnego,
z którym wiążą się startery i/lub sonda używane w teście COBAS® AMPLICOR®
Mycobacterium tuberculosis, chociaż rzadkie, mogą spowodować niewykrycie
bakterii.
Z uwagi na różnice pomiędzy technologiami zaleca się, aby przed zmianą
stosowanych metod użytkownik przeprowadził w laboratorium badanie korelacji
stosowanych metod w celu określenia jakościowych różnic występujących
pomiędzy nimi.
Charakterystyka skuteczności
Swoistość analityczna:
Swoistość analityczną testu COBAS® AMPLICOR® MTB oceniono na podstawie
testów przeprowadzonych przy użyciu następujących bakterii i wirusów, z których
wiele stanowi prawidłową florę lub często spotykane patogeny dróg oddechowych.
Wszystkie izolaty bakterii przebadano przy użyciu 106 komórek/ml lub 105 kopii
kwasu nukleinowego/PCR. Izolaty wirusów zbadano, używając wymienionych
poniżej poziomów PFU/ml. Żaden z badanych izolatów nie wykazał dodatniego
odczynu w teście COBAS® AMPLICOR® MTB.
Gatunki Mycobacterium
20/30
Mycobacterium asiaticum
Mycobacterium marinum
Mycobacterium aurum
Mycobacterium neoaurum
Mycobacterium avium
Mycobacterium nonchromogenicum
Mycobacterium chitae
Mycobacterium phlei
Mycobacterium cookii
Mycobacterium scrofulaceum
Mycobacterium fallax
Mycobacterium senegalens
Mycobacterium flavescens
Mycobacterium simiae
Mycobacterium fortuitum
Mycobacterium smegmatis
Mycobacterium gastri
Mycobacterium sphagni
Mycobacterium gordonae
Mycobacterium szulgai
Mycobacterium intracellulare
Mycobacterium terrae
Mycobacterium kansasii
Mycobacterium thermoresistibile
Mycobacterium komassense
Mycobacterium triviale
Mycobacterium malmoense
Mycobacterium xenopi
Gatunki inne niż Mycobacterium
Acinetobacter calcoaceticus
Actinomadura madurae
Actinomyces pyogenes
Actinoplanes italicus
Aeromonas hydrophila
Arcanobacterium haemolyticum
Arthrobacter oxydans
Bacillus subtilis
Bacteroides fragilis
Blastomyces dermatitidis
Bordetella parapertussis
Bordetella pertussis
Branhamella (Moraxella) catarrhalis
Brevibacterium linens
Campylobacter jejuni
Candida albicans
Chromobacterium violaceum
Citrobacter freundii
Clostridium perfringens
Coccidioides immitis
Corynebacterium aquaticum
Corynebacterium diphtheriae
Corynebacterium flavescens
Corynebacterium glutamicum
Corynebacterium jeikeium
Corynebacterium minutissimum
Corynebacterium pseudodiphtheriticum
Corynebacterium pseudotuberculosis
Corynebacterium renale
Corynebacterium striatum
Corynebacterium xerosis
Cryptococcus neoformans
Deinococcus radiodurans
Dermatophilus congolensis
Eikenella corrodens
Enterobacter cloacae
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Escherichia coli
Fusobacterium nucleatum
Gordona sputi
Haemophilus influenzae
Haemophilus parainfluenzae
Histoplasma capsulatum
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae
Lactobacillus casei
Legionella micdadei
Legionella pneumophila
Microbacterium lactamicum
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria lactamica
Neisseria meningitidis
Nocardia asteroides
Nocardia brasiliensis
Nocardia farcinica
Nocardia nova
Nocardia otitidiscaviarum
Nocardia transvalensis
Oerskovia turbata
Peptococcus niger
Peptostreptococcus anaerobius
Peptostreptococcus magnus
Porphyromonas asaccharolytica
Porphyromonas gingivalis
Prevotella melaninogenica
Propionibacterium acnes
Pseudomonas aeruginosa
Rhodococcus aichiensis
Rhodococcus bronchialis
Rhodococcus chubuensis
Rhodococcus equi
Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis
Serratia marcescens
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus agalactiae
Streptococcus gordonii
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Streptomyces griseus
Veillonella atypica
Veillonella parvula
Vibrio parahaemolyticus
Xanthomonas maltophilia
Yersinia enterocolitica
21/30
Izolaty wirusowe
WIRUS
Badanie poprzez PFU/PCR
Adenowirus
Cytomegalowirus
Herpes Simplex I
Herpes Simplex II
Wirus grypy, typ B
Parainfluenza 2
Wirus syncytium
nabłonka oddechowego
3,2 x 105
98
5,6 x 105
brak danych
Nieznany*
2,8 x 105
28
* Próbka ta pochodziła z popłuczyn gardła pacjenta.
Izolaty chlamydii
Czułość analityczna:
Oczyszczone DNA
Gatunki chlamydii
Badane IFU/PCR
Chlamydia pneumoniae
Chlamydia trachomatis
188
88
Limit detekcji testu COBAS® AMPLICOR® MTB określono przez ustalenie
minimalnej liczby kopii docelowego DNA M. tuberculosis, która może być
powtarzalnie wykrywana przez niniejszą procedurę. Osiągnięto to przez analizę
seryjnych rozcieńczeń oczyszczonego, docelowego DNA. Wyniki pokazują, że
w jednej reakcji PCR test COBAS® AMPLICOR® MTB może wykryć 1 kopię
DNA kompleksu M. tuberculosis oraz że w jednej reakcji PCR 5 lub więcej kopii
oczyszczonego DNA M. tuberculosis było wykrywane w 100% przypadków. Pięć
kopii DNA kompleksu M. tuberculosis w reakcji PCR odpowiada 1000 kopii
DNA kompleksu M. tuberculosis na ml próbki.
Limit detekcji testu COBAS® AMPLICOR® MTB określono przez ustalenie
Czułość analityczna:
Komórki M. tuberculosis minimalnej liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) M. tuberculosis, które mogą
być wykryte w powtarzalny sposób przez niniejszą procedurę. Osiągnięto to przez
analizę seryjnych rozcieńczeń zmianowanych hodowli każdego z dwunastu izolatów
M. tuberculosis. Wyniki pokazują, że test COBAS® AMPLICOR® MTB może
wykryć jedno CFU na reakcję PCR i że 40 CFU na reakcję PCR było wykrywane
w 100% przypadków dla każdego z dwunastu izolatów kompleksu
M. tuberculosis. Jedno CFU M. tuberculosis na reakcję PCR odpowiada 40 CFU
M. tuberculosis na ml próbki.
Dokładność
22/30
Dokładność testu COBAS® AMPLICOR® MTB w obrębie cyklu, pomiędzy
cyklami, pomiędzy różnymi dniami oraz całkowitą dokładność testu oceniano
zgodnie z metodami określonymi w wytycznych CLSI (EP5-A2) „Ocena
skuteczności urządzeń chemii klinicznej”36. Procedura ta pozwala na określenie
dokładności w obrębie cyklu, pomiędzy cyklami, pomiędzy różnymi dniami oraz
całkowitej dokładności testu dzięki przeprowadzeniu wielodniowego badania,
w którym bierze udział wielu operatorów. Badanie wykonano w laboratoriach
Roche Molecular Systems Diagnostic Development przy użyciu testów COBAS®
AMPLICOR® MTB pochodzących z jednej serii. Dla celów niniejszego badania
kontrolę (+) Mycobacterium poddano obróbce, a następnie rozcieńczono
buforami do przygotowania próbek, aby uzyskać stężenia 10 i 20 kopii
DNA/reakcję amplifikacji. Cykl składający się z 24 testów był przeprowadzany
codziennie przez 10 dni przez każdego z 2 operatorów. Każdy cykl obejmował
8 powtórzeń każdego z 2 stężeń kontroli (+) Mycobacterium oraz kontrolę (–)
Mycobacterium. Wyniki omawianego badania przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1. Dokładność testu COBAS® AMPLICOR® MTB
Docelowy MTB
LICZBA KOPII/REAKCJA PCR
Całkowita liczba powtórzeń
Średnia absorbancja
0
10
Kopie/reakcja PCR
Kopie/reakcja PCR
Kopie/reakcja PCR
20
160
160
160
0,017
3,746
3,889
Wartość minimalna
0,007
1,316
3,334
Wartość maksymalna
0,029
4,000
4,000
Odchylenie standardowe
0*
0,218
0*
Współczynnik zmienności
0*
5,8%
0*
0,007
0,185
0,139
40,5%
4,9%
3,6%
0,0017
0,373
0,081
10,1%
10,0%
2,1%
0,007
0,470
0,161
41,7%
12,6%
4,1%
Pomiędzy dniami
Między przebiegami
Wewnątrz przebiegu
Razem
* Przybliżona wartość składnika wariancji była ujemna i z tego względu została ustawiona na zero.
Skuteczność kliniczna
Test COBAS® AMPLICOR® MTB oceniano w badaniu przeprowadzanym
w 7 ośrodkach klinicznych w Stanach Zjednoczonych, Kanadzie i Europie. Aby ocenić
skuteczność kliniczną testu COBAS® AMPLICOR® MTB, wyniki porównano
z wynikami hodowli MTB i ze zweryfikowanymi wynikami badań, które obejmowały
hodowlę MTB i wyniki przeglądowe pacjentów w formie diagramu (tabele 2 i 3).
Wyniki rozmazu AFB i hodowli prątków oraz testu COBAS® AMPLICOR® MTB
uzyskano dla 5430 próbek. Spośród nich, wynik rozmazu AFB był dodatni dla
271 próbek, w przypadku 5159 próbek wynik był ujemny. Z 271 prób, których wynik
rozmazu AFB był dodatni, 200 dało dodatni wynik także w przypadku hodowli MTB
i testu COBAS® AMPLICOR® MTB; osiem próbek było dodatnich w hodowli
i ujemnych w teście COBAS® AMPLICOR® MTB. Sześćdziesiąt trzy (63) próby
dodatnie w rozmazie AFB były ujemne w hodowli MTB. Siedemnaście (17) z nich
było dodatnich dla bakterii niegruźliczych, a w przypadku czterdziestu sześciu (46)
hodowla była ujemna dla wszystkich prątków.
Obecność MTB w grupie wszystkich próbek, według wyników hodowli, wynosiła
6,5% (352/5430). Obecność MTB w grupach dodatnich i ujemnych rozmazów
wynosiła odpowiednio 76,8% (208/271) i 2,8% (144/5159). Zastosowanie
wewnętrznej kontroli do oceny wyników testu ujawniło, że 2,8% (155/5430) próbek
wykazywało wielokrotne działanie hamujące w stosunku do reakcji PCR.
Przy zastosowaniu wewnętrznej kontroli w interpretacji wyników badań, czułość
kliniczna testu COBAS® AMPLICOR® MTB w stosunku do hodowli w grupie
próbek dodatnich pod względem rozmazu wynosiła 96,2% (200/208), a swoistość
kliniczna 73,8% (45/61). W porównaniu ze zweryfikowanymi wynikami badań,
czułość kliniczna testu COBAS® AMPLICOR® MTB wynosiła 96,4% (217/225),
a swoistość kliniczna 100% (45/45). W grupie prób o ujemnym wyniku rozmazu,
czułość kliniczna testu COBAS® AMPLICOR® MTB względem hodowli wynosiła
66,4% (93/140), a swoistość kliniczna 99,2% (4726/4763). W porównaniu ze
zweryfikowanymi wynikami badań, czułość kliniczna testu COBAS® AMPLICOR®
MTB wynosiła 72,8% (118/162), a swoistość kliniczna 99,7% (4832/4845).
23/30
Przy niezastosowaniu wewnętrznej kontroli w interpretacji wyników badań,
czułość kliniczna testu COBAS® AMPLICOR® MTB względem hodowli
w grupie próbek dodatnich pod względem rozmazu wynosiła 96,2% (200/208),
a swoistość kliniczna 74,6% (47/63). W porównaniu ze zweryfikowanymi
wynikami badań, czułość kliniczna testu COBAS® AMPLICOR® MTB wynosiła
96,4% (217/225), a swoistość kliniczna 100% (46/46). W grupie prób o ujemnym
wyniku rozmazu, czułość kliniczna testu COBAS® AMPLICOR® MTB
względem hodowli wynosiła 64,6% (93/144), a swoistość kliniczna 99,3%
(4978/5015). W porównaniu ze zweryfikowanymi wynikami badań, czułość
kliniczna testu COBAS® AMPLICOR® MTB wynosiła 71,3% (117/164),
a swoistość kliniczna 99,7% (4982/4995).
24/30
Tabela 2. Skuteczność testu COBAS® AMPLICOR® MTB na próbkę
bez wewnętrznej kontroli
Ośrodek Kategoria próbki
Wszystkie próbki
1
2
3
4
5
6
7
N
1025
Rozmaz +
63
Rozmaz –
962
Wszystkie próbki
893
Rozmaz +
37
Rozmaz –
856
Wszystkie próbki
762
Rozmaz +
11
Rozmaz –
751
Wszystkie próbki
585
Rozmaz +
12
Rozmaz –
573
Wszystkie próbki
1046
Rozmaz +
57
Rozmaz –
989
Wszystkie próbki
910
Rozmaz +
69
Rozmaz –
841
Wszystkie próbki
209
Rozmaz +
22
Rozmaz –
187
Wszystkie próbki
5430
OGÓŁEM Rozmaz +
Rozmaz –
271
5159
Częstość
W porównaniu do hodowli
występowania
Czułość Swoistość
W porównaniu do wyników zweryfikowanych
Czułość Swoistość
PPV
NPV
8,7%
(89/1025)
79,4%
(50/63)
4,1%
(39/962)
6,2%
(55/893)
81,1%
(30/37)
2,9%
(25/856)
4,2%
(37/762)
81,8%
(9/11)
3,1%
(23/751)
1,5%
(9/585)
16,7%
(2/12)
1,2%
(7/573)
5,6%
(59/1046)
80,7%
(46/57)
1,3%
(13/989)
10,0%
(91/910)
78,3%
(54/69)
4,4%
(37/841)
8,1%
(17/209)
77,3%
(17/22)
0,0%
(0/187)
6,5%
(352/5430)
76,8%
(208/271)
2,8%
(144/5159)
84,8%
(89/105)
100,0%
(59/59)
65,2%
(30/46)
89,4%
(59/66)
100,0%
(32/32)
79,4%
(27/34)
87,5%
(28/32)
88,9%
(8/9)
87,0%
(20/23)
90,0%
(9/10)
100,0%
(2/2)
87,5%
(7/8)
89,4%
(59/66)
98,1%
(51/52)
57,1%
(8/14)
78,3%
(72/92)
88,9%
(48/54)
63,2%
(24/38)
100,0%
(18/18)
100,0%
(17/17)
100,0%
(1/1)
85,9%
(334/389)
96,4%
(217/225)
71,3%
(117/164)
77,5%
(69/89)
100,0%
(50/50)
48,7%
(19/39)
87,3%
(48/55)
100,0%
(30/30)
72,0%
(18/25)
87,5%
(28/32)
88,9%
(8/9)
87,0%
(20/23)
88,9%
(8/9)
100,0%
(2/2)
85,7%
(6/7)
88,1%
(52/59)
97,8%
(45/46)
53,8%
(7/13)
78,0%
(71/91)
88,9%
(48/54)
62,2%
(23/37)
100,0%
(17/17)
100,0%
(17/17)
–
(0/0)
83,2%
(293/352)
96,2%
(200/208)
64,6%
(93/144)
96,8%
(906/936)
30,8%
(4/13)
97,7%
(902/923)
98,7%
(827/838)
71,4%
(5/7)
98,9%
(822/831)
100,0%
(730/730)
100,0%
(2/2)
100,0%
(728/728)
99,8%
(575/576)
100,0%
(10/10)
99,8%
(565/566)
99,1%
(978/987)
54,5%
(6/11)
99,6%
(972/976)
99,9%
(818/819)
100,0%
(15/15)
99,9%
(803/804)
99,5%
(191/192)
100,0%
(5/5)
99,5%
(186/187)
99,0%
(5025/5078)
74,6%
(47/63)
99,3%
(4978/5015)
98,9%
89,9%
(910/920)
(89/99)
100,0%
100,0%
(4/4)
(59/59)
98,9%
75,0%
(906/916)
(30/40)
100,0%
100,0%
(827/827)
(59/59)
100,0%
100,0%
(5/5)
(32/32)
100,0%
100,0%
(822/822)
(27/27)
100,0%
100,0%
(730/730)
(28/28)
100,0%
100,0%
(2/2)
(8/8)
100,0%
100,0%
(728/728)
(20/20)
100,0%
100,0%
(575/575)
(9/9)
100,0%
100,0%
(10/10)
(2/2)
100,0%
100,0%
(565/565)
(7/7)
99,7%
95,2%
(977/980)
(59/62)
100,0%
100,0%
(5/5)
(51/51)
99,7%
72,7%
(972/975)
(8/11)
100,0%
100,0%
(818/818)
(72/72)
100,0%
100,0%
(15/15)
(48/48)
100,0%
100,0%
(803/803)
(24/24)
100,0%
100,0%
(191/191)
(18/18)
100,0%
100,0%
(5/5)
(17/17)
100,0%
100,0%
(186/186)
(1/1)
99,7%
96,3%
(5028/5041) (334/347)
100,0%
100,0%
(46/46)
(217/217)
99,7%
90,0%
(4982/4995) (117/130)
98,3%
(910/926)
100,0%
(4/4)
98,3%
(906/922)
99,2%
(827/834)
100,0%
(5/5)
99,2%
(822/829)
99,5%
(730/734)
66,7%
(2/3)
96,6%
(728/731)
99,8%
(575/576)
100,0%
(10/10)
99,8%
(565/566)
99,3%
(977/984)
83,3%
(5/6)
99,4%
(972/978)
97,6%
(818/838)
71,4%
(15/21)
98,3%
(803/817)
100,0%
(191/191)
100,0%
(5/5)
100,0%
(186/186)
98,9%
(5028/5083)
85,2%
(46/54)
99,1%
(4982/5019)
25/30
Tabela 3. Skuteczność testu COBAS® AMPLICOR® MTB na próbkę z wewnętrzną kontrolą
Ośrodek
Kategoria próbki
Wszystkie próbki
1
2
3
4
5
6
7
OGÓŁEM
26/30
N
1025
Rozmaz +
63
Rozmaz –
962
Wszystkie próbki
893
Rozmaz +
37
Rozmaz –
856
Wszystkie próbki
762
Rozmaz +
11
Rozmaz –
751
Wszystkie próbki
585
Rozmaz +
12
Rozmaz –
573
Wszystkie próbki
1046
Rozmaz +
57
Rozmaz –
989
Wszystkie próbki
910
Rozmaz +
69
Rozmaz –
841
Wszystkie próbki
209
Rozmaz +
22
Rozmaz –
187
Wszystkie próbki
5430
Rozmaz +
271
Rozmaz –
5159
Częstość
występowania
Zahamowanie
8,7%
(89/1025)
79,4%
(50/63)
4,1%
(39/962)
6,2%
(55/893)
81,1%
(30/37)
2,9%
(25/856)
4,2%
(32/762)
81,8%
(9/11)
3,1%
(23/751)
1,5%
(9/585)
16,7%
(2/12)
1,2%
(7/573)
5,6%
(59/1046)
80,7%
(46/57)
1,3%
(13/989)
10,0%
(91/910)
78,3%
(54/69)
4,4%
(37/841)
8,1%
(17/209)
77,3%
(17/22)
0,0%
(0/187)
6,5%
(352/5430)
76,8%
(208/271)
2,8%
(144/5159)
4,8%
(49/1025)
0,0%
(0/63)
5,1%
(49/962)
4,0%
(36/893)
0,0%
(0/37)
4,2%
(36/856)
1,4%
(11/762)
0,0%
(0/11)
1,5%
(11/751)
1,5%
(9/585)
0,0%
(0/12)
1,6%
(9/573)
1,5%
(16/1046)
0,0%
(0/57)
1,6%
(16/989)
2,5%
(23/910)
1,4%
(1/69)
2,6%
(22/841)
4,3%
(9/209)
0,0%
(0/22)
4,8%
(9/187)
2,8%
(153/5430)
0,4%
(1/271)
2,9%
(152/5159)
W porównaniu do hodowli
Czułość
Swoistość
80,2%
(69/86)
100,0%
(50/50)
52,8%
(19/36)
88,9%
(48/54)
100,0%
(30/30)
75,0%
(18/24)
87,5%
(28/32)
88,9%
(8/9)
87,0%
(20/23)
88,9%
(8/9)
100,0%
(2/2)
85,7%
(6/7)
88,1%
(52/59)
97,8%
(45/46)
53,8%
(7/13)
78,0%
(71/91)
88,9%
(48/54)
62,2%
(23/37)
100,0%
(17/17)
100,0%
(17/17)
–
(0/0)
84,2%
(293/348)
96,2%
(200/208)
66,4%
(93/140)
96,6%
(854/884)
30,8%
(4/13)
97,6%
(850/871)
98,5%
(730/741)
71,4%
(5/7)
98,8%
(725/734)
100,0%
(706/706)
100,0%
(2/2)
100,0%
(704/704)
99,8%
(554/555)
100,0%
(10/10)
99,8%
(544/545)
99,1%
(954/963)
50,0%
(5/10)
99,6%
(949/953)
99,9%
(791/792)
100,0%
(14/14)
99,9%
(777/778)
99,5%
(182/183)
100,0%
(5/5)
99,4%
(177/178)
98,9%
(4771/4824)
73,8%
(45/61)
99,2%
(4726/4763)
W porównaniu do wyników zweryfikowanych
Czułość
Swoistość
PPV
NPV
86,4%
(89/103)
100,0%
(59/59)
68,2%
(30/44)
90,9%
(60/66)
100,0%
(32/32)
82,4%
(28/34)
87,5%
(28/32)
88,9%
(8/9)
87,0%
(20/23)
90,0%
(9/10)
100,0%
(2/2)
87,5%
(7/8)
89,4%
(59/66)
98,1%
(51/52)
57,1%
(8/14)
78,3%
(72/92)
88,9%
(48/54)
63,2%
(24/38)
100,0%
(18/18)
100,0%
(17/17)
100,0%
(1/1)
86,6%
(335/387)
96,4%
(217/225)
72,8%
(118/162)
98,9%
(863/873)
100,0%
(4/4)
98,8%
(859/869)
100,0%
(791/791)
100,0%
(5/5)
100,0%
(786/786)
100,0%
(719/719)
100,0%
(2/2)
100,0%
(717/717)
100,0%
(566/566)
100,0%
(10/10)
100,0%
(556/556)
99,7%
(961/964)
100,0%
(5/5)
99,7%
(956/959)
100,0%
(795/795)
100,0%
(14/14)
100,0%
(781/781)
100,0%
(182/182)
100,0%
(5/5)
100,0%
(177/177)
99,7%
(4877/4890)
100,0%
(45/45)
99,7%
(4832/4845)
89,9%
(89/99)
100,0%
(59/59)
75,0%
(30/40)
100,0%
(60/60)
100,0%
(32/32)
100,0%
(28/28)
100,0%
(28/28)
100,0%
(8/8)
100,0%
(20/20)
100,0%
(9/9)
100,0%
(2/2)
100,0%
(7/7)
95,2%
(59/62)
100,0%
(51/51)
72,7%
(8/11)
100,0%
(72/72)
100,0%
(48/48)
100,0%
(24/24)
100,0%
(18/18)
100,0%
(17/17)
100,0%
(1/1)
96,3%
(335/348)
100,0%
(217/217)
90,1%
(118/131)
98,4%
(863/877)
100,0%
(4/4)
98,4%
(859/873)
99,2%
(791/797)
100,0%
(5/5)
99,2%
(786/792)
99,4%
(719/723)
66,7%
(2/3)
99,6%
(717/720)
99,8%
(566/567)
100,0%
(10/10)
99,8%
(556/557)
99,3%
(961/968)
83,3%
(5/6)
99,4%
(956/962)
97,5%
(795/815)
70,0%
(14/20)
98,2%
(781/795)
100,0%
(182/182)
100,0%
(5/5)
100,0%
(177/177)
98,9%
(4877/4929)
84,9%
(45/53)
99,1%
(4832/4876)
Piśmiennictwo
1.
Tuberculosis Elimination Revisited: Obstacles, Opportunities, and a
Renewed Commitment--Advisory Council for the Elimination of
Tuberculosis (ACET). Morbidity and Mortality Weekly Reports 1999.
(RR09); 1-13.
2.
Metchock, B.G., Nolte, F.S. and Wallace, R.J. 1999. Mycobacterium, pp.
339-437: In: Manual of Clinical Microbiology, 7th ed., eds. Murray, P.R.,
Baron, E.J., Pfaller, M.A. et al. American Society for Microbiology,
Washington, D.C.
3.
Bloom, B.R. and Murray, C.J.L. 1992. Tuberculosis: commentary on a
reemergent killer. Science 257:1055-1063.
4.
Böttger, E.C. 1991. Detection, differentiation, and systematics of bacterial
pathogens - the family Mycobacteriaceae. Immunitat und Infection 19:143152.
5.
World Health Organization (WHO). 1995. WHO Report on the Tuberculosis
Epidemic, 1995.
6.
Daniel, T.M. 1990. The rapid diagnosis of tuberculosis: a selective review.
Journal of Laboratory Clinical Medicine 116:277-282.
7.
Hermans, P.W.M., Schuitema, A.R.J., Soolingen, D.V. et al. 1990. Specific
detection of Mycobacterium tuberculosis complex strains by polymerase
chain reaction. Journal of Clinical Microbiology 28:1204-1213.
8.
Butler, W.R., Jost, K.C. and Kilburn, J.O. 1991. Identification of
mycobacteria by high-performance liquid chromatography. Journal of
Clinical Microbiology 29:2468-2472.
9.
Huang, C.H. and Jungkind, D.L. 1991. Non-radioactive probe for the rapid
identification of Mycobacterium avium complex from clinical specimens.
Molecular and Cellular Probes 5:277-280.
10. Pfyffer, G.E., Kissling, P., Jahn, E.M.I. et al. 1996. Diagnostic performance
of amplified Mycobacterium tuberculosis direct test with cerebrospinal fluid,
other nonrespiratory, and respiratory specimens. Journal of Clinical
Microbiology 34:834-841.
11. Miller, N., Hernandez, S.G. and Cleary, T.J. 1994. Evaluation of Gen-Probe
amplified Mycobacterium tuberculosis direct test and PCR for direct
detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens. Journal of
12. Yuen, K., Yam, W., Wong, L. et al. 1997. Comparison of two automated DNA
amplification systems with a manual one-tube nested PCR assay for diagnosis
of pulmonary tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology 35:1385-1389.
27/30
13. Walker, G.T., Nadeau, J.G., Linn, C.P. et al. 1996. Strand displacement
amplification (SDA) and transient-state fluorescence polarization detection
of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Chemistry 42:9-13.
14. Smith, J.H., Buxton, D., Cahill, P. et al. 1997. Detection of Mycobacterium
tuberculosis directly from sputum by using a prototype automated Q-Beta
replicase assay. Journal of Clinical Microbiology 35:1477-1483.
15. Brisson-Noel, A., Aznar, C., Chareau, C. et al. 1991. Diagnosis of
tuberculosis by DNA amplification in clinical practice evaluation. The
Lancet 338:364-366.
16. Eisenach, K.D., Sifford, M.D., Cave, M.D. et al. 1991. Detection of
Mycobacterium tuberculosis in sputum samples using a polymerase chain
reaction. American Review of Respiratory Diseases 144:1160-1163.
17. De Wit, D., Steyn, L., Shoemaker, S. et al. 1990. Direct detection of
Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens by DNA amplification.
Journal of Clinical Microbiology 28:2437-2441.
18. Sjobring, U., Mecklenburg, M., Andersen, A.B. et al. 1990. Polymerase chain
reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical
19. Cousins, D.V., Wilton, S.D., Francis, B.R. et al. 1992. Use of polymerase
chain reaction for rapid diagnosis of tuberculosis. Journal of Clinical
20. Sritharan, V. and Barker Jr., R.H. 1991. A simple method for diagnosing
M. tuberculosis infection in clinical samples using PCR. Molecular and
Cellular Probes 5:385-395.
21. Ichiyama, S., Iinuma, Y., Tawada, Y. et al. 1996. Evaluation of Gen-Probe
amplified Mycobacterium tuberculosis direct test and Roche PCR-microwell
plate hybridization method (AMPLICOR® Mycobacterium) for direct
detection of mycobacteria. Journal of Clinical Microbiology 34:130-133.
22. Kox, L.F., van Leeuwen, J., Kniper, S. et al. 1995. PCR assay based on DNA
coding for 16S rRNA for detection and identification of mycobacteria in
clinical samples. Journal of Clinical Microbiology 33:3225-3233.
23. Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F. et al. 1985. Enzymatic amplification of
β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of
sickle cell anemia. Science 230:1350-1354.
24. Mullis, K.B. and Faloona, F.A. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a
polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155:335-350.
25. Kent, P.T. and Kubica, G.P. 1985. US DHHS. Public Health
Mycobacteriology. A guide for the level III laboratory. Centers for Disease
Control, Atlanta, GA.
28/30
26. Zolnir-Dovc, M., Poljak, M., Seme, K. et al. 1995. Evaluation of two
commercial amplification assays for detection of Mycobacterium
tuberculosis complex in respiratory specimens. Infection 23:216-221.
27. Taquet, A. and Tison, F. 1996. L’utilisation des détergents pour l’isolement
des mycobactéries. Bulletin International Union de Tuberculose 38:59-67.
28. Tevere, V.J., Hewitt, P.L., Dare, A. et al. 1996. Detection of Mycobacterium
tuberculosis by PCR amplification with pan-Mycobacterium primers and
hybridization to an M. tuberculosis-specific probe. Journal of Clinical
29. Stahl, D.A. and Urbance, J.W. 1990. The division between fast- and slowgrowing species corresponds to natural relationships among the
mycobacteria. Journal of Bacteriology 172:116-124.
30. Böddinghaus, B., Rogall, T., Flohr, T. et al. 1990. Detection and
identification of mycobacteria by amplification of rRNA. Journal of Clinical
31. Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA
glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain
reactions. Gene 93:125-128.
32. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 1999. Richmond,
J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC)
93-8395.
33. Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory
Workers from Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, 2005.
34. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st
Edition. 2000. 704 pp.
35. Zolg, W.J. and Philippi-Schulz, S. 1994. The superoxide dismutase gene; a
target for detection and identification of mycobacteria by PCR. Journal of
36. Clinical and Laboratory Standards Institute. Evaluation of Precision
Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guideline. CLSI
Document EP5-A2 Villanova, PA:CLSI, 1999.
29/30
"
Distributed by
Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, 08876 USA
Członek Grupy Roche
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
Industriestrasse 7
6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics
2, Avenue du Vercors
38240 Meylan, France
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Straße 116
68305 Mannheim, Germany
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics S.p.A.
Viale G. B. Stucchi 110
20052 Monza, Milano, Italy
Roche Diagnostics, SL
Avda. Generalitat, 171-173
E-08174 Sant Cugat del Vallès
Barcelona, Spain
Roche Diagnostics
201, boulevard Armand-Frappier
H7V 4A2 Laval, Québec, Canada
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877 273-3433)
Distribuidor em Portugal:
Roche Sistemas de Diagnósticos Lda.
Estrada Nacional, 249-1
2720-413 Amadora, Portugal
Roche Diagnostica Brasil Ltda.
Av. Engenheiro Billings, 1729
Jaguaré, Building 10
05321-010 São Paulo, SP Brazil
ROCHE, AMPLICOR, AMPLILINK, AMPLIPREP, AMPLITAQ, TAQMAN,
AMPERASE i COBAS są znakami handlowymi firmy Roche.
Cząsteczki paramagnetyczne Dynabeads® są przedmiotem licencji od właściciela
patentów Dynal Biotech ASA, Oslo, Norwegia. Dynabeads® jest zarejestrowanym
znakiem handlowym Dynal Biotech ASA, Oslo, Norwegia, na który udzielono
licencji firmie Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana.
Eppendorf Multipette® i Eppendorf Combitip® są zastrzeżonymi znakami
towarowymi Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, Niemcy.
ProClin® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Rohm and Haas
Company.
Copyright 2009, Roche Molecular Systems, Inc.
Wszelkie prawa zastrzeżone.
8/2009
(00058003575-05ENGL)
05217130049-03
30/30

Mycobacterium tuberculosis

Transkrypt

Podobne dokumenty

obejmuje wykrywanie obecności DNA prątków należących do

Buty 661 Filter MTB czarne rozm. 43

Gruźliczak mózgu u 8-miesięcznego niemowlęcia

ISE Deproteinizer

Nietypowy obraz gruźlicy płuc u chorej z przewlekłą niewydolnością

Buty Shimano SH M122 niebieskie

Zestawy badań chłodziw

Testy uwalniania interferonu gamma nowym