doccobas EGFR Mutation Test v2
download 
Reklamacja Transkrypt
cobas EGFR Mutation Test v2
cobas® EGFR Mutation Test v2 Do stosowania w diagnostyce in vitro cobas® DNA Sample Preparation Kit 24 Tests P/N: 05985536190 cobas® cfDNA Sample Preparation Kit 24 Tests P/N: 07247737190 cobas® EGFR Mutation Test v2 P/N: 07248563190 24 Tests ® cobas EGFR Mutation Test v2 SPIS TRE CI ® cobas EGFR Mutation Test v2: Zastosowanie Podsumowanie oraz opis testu Informacje podstawowe ....................................................................................................................... 5 Zasady procedury ................................................................................................................................ 7 Przygotowanie próbek ................................................................................................................ 7 Amplifikacja PCR ........................................................................................................................ 7 CZ A: DO STOSOWANIA Z PRÓBKAMI TKANKI Przygotowanie próbek Materia y i odczynniki Dostarczane materia y i odczynniki.................................................................................................... 10 Przechowywanie i u ytkowanie odczynników .................................................................................... 12 Wymagane materia y dodatkowe ....................................................................................................... 13 Urz dzenia i oprogramowanie wymagane, lecz niedostarczane ....................................................... 14 Wymagania dotycz ce rodków ostro no ci i u ytkowania Ostrze enia i rodki ostro no ci ........................................................................................................ 14 Dobra praktyka laboratoryjna ............................................................................................................. 14 Zanieczyszczenie ............................................................................................................................... 15 Integralno ........................................................................................................................................ 15 Utylizacja ............................................................................................................................................ 15 Rozlanie p ynów i czyszczenie ........................................................................................................... 16 Pobieranie, transport i przechowywanie próbek ................................................................................ 16 Pobieranie próbek ..................................................................................................................... 16 Przechowywanie i trwa Przechowywanie i stabilno próbek podczas transportu ........................................................... 16 próbki przetworzonej .................................................................. 17 Procedura testowa Wykonywanie oznaczenia .................................................................................................................. 17 Instrukcja u ytkowania .............................................................................................................. 18 Procedura izolacji DNA ............................................................................................................. 20 Ocena ilo ciowa st enia DNA ................................................................................................. 22 Amplifikacja i detekcja............................................................................................................... 22 Konfigurowanie aparatu ............................................................................................................ 23 Konfiguracja zlecenia testu ....................................................................................................... 23 Konfigurowanie aparatu ............................................................................................................ 24 Obliczanie rozcie czenia roztworu podstawowego DNA, pochodz cego z próbki .................. 24 Rozcie czenie próbki ................................................................................................................ 25 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 2 ® cobas EGFR Mutation Test v2 Konfiguracja reakcji................................................................................................................... 26 Przygotowanie roboczych odczynników Master Mix (MMX-1, MMX-2 i MMX-3 v2) ................ 26 Przygotowanie p ytki ................................................................................................................. 27 Rozpocz cie reakcji PCR ......................................................................................................... 27 Wyniki Interpretacja wyników......................................................................................................................... 28 Ponowny test próbek z niewa nymi wynikami ................................................................................... 28 Kontrola jako ci i wa no wyników .................................................................................................. 29 Kontrola mutacji ........................................................................................................................ 29 Kontrola ujemna ........................................................................................................................ 29 Ograniczenia metody ......................................................................................................................... 29 Ocena skuteczno ci w badaniach nieklinicznych Czu analityczna — granica próby lepej ..................................................................................... 31 Granica wykrywalno ci przy u yciu mieszanek próbek FFPET ........................................................ 31 Minimalna zawarto Swoisto tkanki guza ...................................................................................................... 33 — mikroorganizmy i homologi EGFR ............................................................................... 34 Mikroorganizmy zwi zane z p ucami ........................................................................................ 34 Plazmidy homologów EGFR ..................................................................................................... 34 Substancje wp ywaj ce na wynik testu .............................................................................................. 34 Tkanka martwicza .............................................................................................................................. 34 Powtarzalno .................................................................................................................................... 35 Odtwarzalno przygotowywania próbek .......................................................................................... 35 Ocena klinicznej skuteczno ci testu Badanie odtwarzalno ci klinicznej ..................................................................................................... 36 Korelacja z metod referencyjn wykorzystuj próbki fazy III z badania EURTAC ....................... 37 Dane dotycz ce wyniku klinicznego .................................................................................................. 38 CZ B: DO STOSOWANIA Z PRÓBKAMI OSOCZA Przygotowanie próbek Materia y i odczynniki Dostarczane materia y i odczynniki.................................................................................................... 42 Przechowywanie i u ytkowanie odczynników .................................................................................... 44 Wymagane materia y dodatkowe ....................................................................................................... 45 Urz dzenia i oprogramowanie wymagane, lecz niedostarczane ....................................................... 45 Wymagania dotycz ce rodków ostro no ci i u ytkowania Ostrze enia i rodki ostro no ci ........................................................................................................ 46 Dobra praktyka laboratoryjna ............................................................................................................. 46 Zanieczyszczenie ............................................................................................................................... 47 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 3 ® cobas EGFR Mutation Test v2 Integralno ........................................................................................................................................ 47 Utylizacja ............................................................................................................................................ 47 Rozlanie p ynów i czyszczenie ........................................................................................................... 48 Pobieranie, transport i przechowywanie próbek ................................................................................ 48 Pobieranie próbek i praca z próbkami ...................................................................................... 48 Transport, przechowywanie i stabilno Przechowywanie i stabilno próbek ....................................................................... 48 próbki przetworzonej .................................................................. 48 Procedura testowa Wykonywanie oznaczenia .................................................................................................................. 49 Instrukcja u ytkowania .............................................................................................................. 49 Amplifikacja i detekcja............................................................................................................... 51 Konfigurowanie aparatu ............................................................................................................ 53 Konfiguracja reakcji................................................................................................................... 54 Przygotowanie p ytki ................................................................................................................. 55 Rozpocz cie reakcji PCR ......................................................................................................... 56 Wyniki Interpretacja wyników......................................................................................................................... 56 Wska nik pó ilo ciowy (SQI) ..................................................................................................... 57 Ponowny test próbek z niewa nymi wynikami .......................................................................... 57 Kontrola jako ci i wa no wyników .................................................................................................. 57 Kontrola mutacji ........................................................................................................................ 57 Kontrola ujemna ........................................................................................................................ 57 Ograniczenia metody ......................................................................................................................... 58 Ocena skuteczno ci w badaniach nieklinicznych Granica wykrywalno ci przy u yciu DNA linii komórkowych ............................................................. 59 Korelacja z MiSeq przy u yciu klinicznych próbek osocza K2 EDTA ................................................ 59 Liniowo ........................................................................................................................................... 60 Powtarzalno .................................................................................................................................... 63 Dodatkowe informacje Oznaczenia ........................................................................................................................................ 64 Wytwórca i dystrybutorzy ................................................................................................................... 65 Znaki towarowe i patenty ................................................................................................................... 65 Copyright ............................................................................................................................................ 65 Pi miennictwo .................................................................................................................................... 66 Wersja dokumentu ............................................................................................................................. 67 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 4 ® cobas EGFR Mutation Test v2 cobas® EGFR Mutation Test v2: Zastosowanie Test cobas® EGFR Mutation Test v2 jest oparty na reakcji PCR zachodz cej w czasie rzeczywistym, przeznaczony do jako ciowej detekcji i identyfikacji mutacji w eksonach 18., 19., 20. i 21. genu koduj cego receptor naskórkowego czynnika wzrostu (ang. epidermal growth factor receptor, EGFR) w DNA pochodz cym z utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie próbek tkanki (ang. formalin-fixed paraffin-embedded tissue, FFPET) nowotworowej lub osocza od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem p uca (ang. non-small cell lung cancer, NSCLC). Test jest tak e przeznaczony jako pomoc w doborze pacjentów z NSCLC do terapii inhibitorem kinazy tyrozynowej (ang. tyrosine kinase inhibitor, TKI) EGFR. Test cobas® EGFR Mutation Test v2 do stosowania z osoczem jest tak e wskazany do pó ilo ciowego oznaczania mutacji w eksonach 18., 19., 20. i 21. genu EGFR z seryjnie pobranych próbek osocza ludzkiego jako pomoc w leczeniu pacjentów z rakiem NSCLC. Próbki FFPET s przetwarzane przy u yciu zestawu cobas® DNA Sample Preparation Kit, a próbki osocza s przetwarzane przy u yciu cobas® cfDNA Sample Preparation Kit. Test cobas® EGFR Mutation Test v2 i analizator cobas z 480 s stosowane razem do automatycznej amplifikacji i detekcji. Podsumowanie oraz opis testu Informacje podstawowe Uaktywnienie si mutacji genu koduj cego EGFR nast puje g ównie w przypadku NSCLC i skutkuje konstytutywn aktywacj bia ka EGFR, które wykazuje aktywno kinazy, przyczyniaj c si tym samym do rozwoju procesu onkogennego1. Cz sto wyst powania tych mutacji w niewyselekcjonowanych przypadkach NSCLC wynosi oko o 10–30%2, 3. Jednak mutacje te wyst puj cz ciej (cho nie wy cznie) u niepal cych/pal cych rzadko pacjentek pochodzenia azjatyckiego, u których w badaniach histopatologicznych wykrywa si gruczolakoraka4. Najcz stsze mutacje EGFR w NSCLC obejmuj ró ne delecje w eksonie 19. i mutacj substytucji L858R w eksonie 21.; mutacje te cznie stanowi oko o 85% mutacji EGFR obserwowanych w NSCLC5. Test cobas® EGFR Mutation Test v2 (cobas® EGFR Test) to test reakcji PCR zachodz cej w czasie rzeczywistym opracowany do wykrywania mutacji substytucji G719X w eksonie 18., mutacji delecji w eksonie 19., mutacji substytucji T790M i S768I w eksonie 20., mutacji insercji w eksonie 20. oraz mutacji substytucji L858R i L861Q w eksonie 21. Tabela 1 wymienia mutacje EGFR wykrywane za pomoc testu cobas® EGFR. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 5 ® cobas EGFR Mutation Test v2 Tabela 1 ® Test cobas EGFR jest przeznaczony do detekcji nast puj cych mutacji Ekson Grupa mutacji EGFR Ekson 18. G719X Ekson 19. Ex19Del S768I T790M Ekson 20. Ex20Ins Ekson 21. L858R L861Q 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 Sekwencja kwasu nukleinowego genu koduj cego EGFR 2156G>C 2155G>A 2155G>T Identyfikator 6 COSMIC 2240_2251del12 6210 2239_2247del9 6218 2238_2255del18 6220 2235_2249del15 6223 2236_2250del15 6225 2239_2253del15 6254 2239_2256del18 6255 2237_2254del18 12367 2240_2254del15 12369 2240_2257del18 12370 6239 6252 6253 2239_2248TTAAGAGAAG>C 12382 2239_2251>C 12383 2237_2255>T 12384 2235_2255>AAT 12385 2237_2252>T 12386 2239_2258>CA 12387 2239_2256>CAA 12403 2237_2253>TTGCT 12416 2238_2252>GCA 12419 2238_2248>GC 12422 2237_2251del15 12678 2236_2253del18 12728 2235_2248>AATTC 13550 2235_2252>AAT 13551 2235_2251>AATTC 13552 2253_2276del24 13556 2237_2257>TCT 18427 2238_2252del15 23571 2233_2247del15 26038 2303G>T 2369C>T 2307_2308ins9GCCAGCGTG 2319_2320insCAC 2310_2311insGGT 2311_2312ins9GCGTGGACA 2309_2310AC>CCAGCGTGGAT 2573T>G 2573_2574TG>GT 2582T>A 6241 6240 12376 12377 12378 13428 13558 6224 12429 6213 6 ® cobas EGFR Mutation Test v2 Zasady procedury Test cobas® EGFR jest oparty na dwóch g ównych procesach: (1) r cznym przygotowaniu próbki w celu pozyskania DNA z próbek FFPET lub osocza oraz (2) amplifikacji PCR i detekcji docelowego DNA z u yciem komplementarnych par primerów oraz znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi sond oligonukleotydowych. Test cobas® EGFR jest przeznaczony do detekcji nast puj cych mutacji: Ekson 18.: G719X (G719A, G719C i G719S) Ekson 19.: delecje i mutacje z one Ekson 20.: S768I, T790M i insercje Ekson 21.: L858R i L861Q Detekcj mutacji uzyskuje si w toku analizy PCR za pomoc analizatora cobas z 480. Do ka dego przebiegu testowego w cza si kontrol mutacji oraz kontrol ujemn w celu potwierdzenia wa no ci przebiegu. Przygotowanie próbek Zestawy cobas® DNA Sample Preparation Kit oraz cobas® cfDNA Sample Preparation Kit to zestawy do cznego przygotowywania próbek oparte na wi zaniu kwasu nukleinowego do w ókien szklanych. Proteaza i chaotropowy bufor do lizy/wi cy uwalnia kwasy nukleinowe i chroni uwolniony DNA przed DNazami. W dalszej kolejno ci do mieszaniny, w której dokonano lizy, dodaje si izopropanol, po czym mieszanin wiruje si i przepuszcza przez kolumn z wk adem filtruj cym, zawieraj cym w ókna szklane. W trakcie wirowania DNA ulega zwi zaniu na powierzchni w ókien szklanych filtra. Substancje niezwi zane, takie jak sole, bia ka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, zostaj usuni te w wyniku wirowania. Zaadsorbowane kwasy nukleinowe s przemywane i poddane elucji roztworem wodnym. Nast pnie docelowy DNA amplifikuje si i poddaje detekcji w analizatorze cobas z 480 z u yciem odczynników do amplifikacji i detekcji, dostarczanych wraz z zestawem cobas® EGFR Mutation Test v2. Amplifikacja PCR Wybór sekwencji docelowej W te cie cobas® EGFR wykorzystuje si primery okre laj ce specyficzne sekwencje par zasad ka dej z mutacji docelowych. W przypadku mutacji substytucji G719X w eksonie 18. docelowe s sekwencje licz ce od 104 do 106 par zasad; w przypadku mutacji delecji w eksonie 19. docelowe s sekwencje licz ce od 125 do 141 par zasad; w przypadku mutacji substytucji S768I w eksonie 20. docelowa jest sekwencja licz ca 133 pary zasad; w przypadku mutacji substytucji T790M w eksonie 20. docelowa jest sekwencja licz ca 118 par zasad; w przypadku mutacji insercji w eksonie 20. docelowe s sekwencje licz ce od 125 do 143 par zasad; w przypadku mutacji substytucji L858R w eksonie 21. docelowa jest sekwencja licz ca 138 par zasad; w przypadku mutacji substytucji L861Q w eksonie 21. docelowa jest sekwencja licz ca 129 par zasad. Amplifikacja zachodzi jedynie w regionach genu koduj cego EGFR mi dzy primerami; ca genu koduj cego EGFR nie ulega amplifikacji. Amplifikacja sekwencji docelowej Do amplifikacji sekwencji docelowej wykorzystuje si polimeraz DNA Z05-AS1 pochodz z gatunku Thermus. Mieszanina PCR jest najpierw podgrzewana w celu denaturacji genomowego DNA oraz ods oni cia sekwencji docelowych primerów. W miar och adzania si mieszaniny primery sensowne oraz antysensowne hybrydyzuj z docelowymi sekwencjami DNA. Polimeraza DNA Z05 w obecno ci kationu dwuwarto ciowego metalu oraz nadmiaru dezoksyrybonukleotydów (dNTP) wyd a ka dy przy czony w wyniku hybrydyzacji primer i w ten sposób nast puje synteza drugiej nici DNA. Proces ten ko czy pierwszy cykl PCR, dostarczaj c dwuniciowej kopii DNA, zawieraj cej regiony genu koduj cego EGFR z docelowymi sekwencjami par zasad. Proces ten powtarza si wielokrotnie, przy czym w ka dym z cykli ilo docelowego DNA (amplikonu) ulega podwojeniu. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 7 ® cobas EGFR Mutation Test v2 Zautomatyzowana detekcja mutacji w czasie rzeczywistym Test cobas® EGFR wykorzystuje technologi PCR w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR). W tej reakcji ka da swoista dla sekwencji docelowej sonda oligonukleotydowa jest znakowana barwnikiem fluorescencyjnym, s cym jako reporter, a tak e cz steczk pe ni funkcj wygaszacza absorbuj cego (wygaszaj cego) emisj fluorescencji pochodz z barwnika reporterowego w nienaruszonej sondzie. W trakcie ka dego cyklu amplifikacji sonda komplementarna do sekwencji jednoniciowego DNA w amplikonie wi e si z nim, a nast pnie ulega rozszczepieniu pod wp ywem polimerazy DNA Z05-AS1, wykazuj cej aktywno nukleazy w kierunku od ko ca 5' do ko ca 3' cucha. Po oddzieleniu si barwnika reporterowego od wygaszacza wskutek aktywno ci nukleazy mo na zmierzy promieniowanie fluorescencyjne o charakterystycznej d ugo ci fali po wzbudzeniu barwnika reporterowego odpowiednim widmem wiat a. Do znakowania mutacji docelowych dla tego testu u yto czterech ró nych barwników reporterowych. Produkty amplifikacji docelowych siedmiu sekwencji wchodz cych w sk ad genu koduj cego EGFR s wykrywane niezale nie w toku trzech reakcji przez pomiar fluorescencji o czterech charakterystycznych d ugo ciach fal w wydzielonych kana ach optycznych. Amplifikacja wybiórcza Amplifikacja wybiórcza docelowego kwasu nukleinowego z próbki jest osi gana w te cie cobas® EGFR dzi ki yciu enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylaza) i trifosforanu dezoksyurydyny (dUTP)7. Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawieraj cych dezoksyurydyn , ale nie DNA zawieraj cego tymidyn . Dezoksyurydyna nie wchodzi w sk ad wyst puj cego w naturze DNA, jest natomiast zawsze obecna w amplikonie wskutek u ycia dUTP zamiast trójfosforanu dezoksytymidyny jako jednego z trójfosforanów nukleotydów w odczynnikach Master Mix; dlatego wy cznie amplikon zawiera dezoksyurydyn . Dezoksyurydyna powoduje wra liwo zanieczyszczaj cego amplikonu na rozk ad przez enzym AmpErase przed amplifikacj docelowego DNA. Enzym AmpErase zawarty w odczynnikach Master Mix katalizuje rozk ad DNA zawieraj cego dezoksyurydyn w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie cucha dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym przy warto ciach pH oznaczaj cych rodowisko zasadowe cuch amplikonu DNA p ka w miejscu, w którym znajduje si dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczaj c dalsz amplifikacj DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny w temperaturach powy ej 55°C, tj. w czasie trwania ca ego cyklu termicznego, dlatego te nie niszczy on amplikonu docelowego. Wykazano, e test cobas® EGFR inaktywuje zmutowany amplikon EGFR zawieraj cy dezoksyurydyn . 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 8 CZ A: Do stosowania z próbkami tkanek ® cobas EGFR Mutation Test v2 W PRZYPADKU PRÓBEK TKANKI NALE Y POST POWA ZGODNIE Z INSTRUKCJAMI W CZ CI A. W PRZYPADKU PRÓBEK OSOCZA NALE Y POST POWA ZGODNIE Z INSTRUKCJAMI W CZ CI B. CZ A: DO STOSOWANIA Z PRÓBKAMI TKANKI Przygotowanie próbek Próbki FFPET s przetwarzane w celu izolowania genomowego DNA przy u yciu zestawu cobas® DNA Sample Preparation Kit, manualnego przygotowywania próbek opartego na wi zaniu kwasu nukleinowego do ókien szklanych. Pozbawiony parafiny skrawek próbki FFPET o grubo ci 5 mikronów zostaje poddany lizie przez inkubacj w podwy szonej temperaturze z proteaz i chaotropowym buforem do lizy/wi cym, który uwalnia kwasy nukleinowe i chroni uwolniony genomowy DNA przed DNazami. W dalszej kolejno ci do mieszaniny, w której dokonano lizy, dodaje si izopropanol, po czym mieszanin wiruje si i przepuszcza przez kolumn z wk adem filtruj cym, zawieraj cym w ókna szklane. W trakcie wirowania genomowy DNA ulega zwi zaniu na powierzchni w ókien szklanych filtra. Substancje niezwi zane, takie jak sole, bia ka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, zostaj usuni te w wyniku wirowania. Zaadsorbowane kwasy nukleinowe s przemywane i poddane elucji roztworem wodnym. Ilo genomowego DNA okre la si spektrofotometrycznie i dostosowuje do ustalonego st enia dodawanego do mieszaniny do amplifikacji/detekcji. Nast pnie docelowy DNA amplifikuje si i poddaje detekcji w analizatorze cobas z 480 z u yciem odczynników do amplifikacji i detekcji, dostarczanych wraz z zestawem cobas® EGFR Mutation Test v2. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 9 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 Materia y i odczynniki Dostarczane materia y i odczynniki Zestaw/kasety ® cobas DNA Sample Preparation Kit 24 testy (P/N: 05985536190) 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 Elementy i sk adniki odczynników Ilo na test DNA TLB (DNA Bufor do lizy tkanek) (P/N: 05517613001) Bufor Tris-HCl Chlorek potasu 0,04% EDTA 0,1% Triton X-100 0,09% azydku sodu 1 x 10 ml PK (Proteinaza K) (P/N: 05860695102) Proteinaza K, liofilizowana 1 x 100 mg DNA PBB (DNA Bufor wi cy parafin ) (P/N: 05517621001) Bufor Tris-HCl 49,6% chlorowodorku guanidyny 0,05% mocznika 17,3% Triton X-100 WB I (DNA Bufor p ucz cy I) (P/N: 05517656001) Bufor Tris-HCl 64% chlorowodorku guanidyny WB II (DNA Bufor p ucz cy II) (P/N: 05517664001) Bufor Tris-HCl Chlorek sodu DNA EB (DNA bufor do elucji) (P/N: 05517630001) Bufor Tris-HCl 0,09% azydku sodu 1 x 10 ml 1 x 25 ml 1 x 12,5 ml 1 x 6 ml FT (Probówki z filtrem i z zatyczkami) (P/N: 05089506102) 1 x 25 sztuk CT (Probówki zbiorcze) (P/N: 05880513001) 3 x 25 sztuk a Symbol bezpiecze stwa i ostrze enie Niebezpiecze stwo H302 + H332: Dzia a szkodliwie po po kni ciu i w nast pstwie wdychania. H315: Dzia a dra ni co na skór . H317: Mo e powodowa reakcj alergiczn skóry. H318: Powoduje powa ne uszkodzenie oczu. H334: Mo e powodowa objawy alergii lub astmy lub trudno ci w oddychaniu w nast pstwie wdychania. H335: Mo e powodowa podra nienie dróg oddechowych. P261: Unika wdychania py u/dymu/gazu/ mg y/par/rozpylonej cieczy. P280: Stosowa r kawice ochronne/ochron oczu/ochron twarzy. P284: Stosowa indywidualne rodki ochrony dróg oddechowych. P305 + P351 + P338 + P310: W PRZYPADKU DOSTANIA SI DO OCZU: Ostro nie p uka wod przez kilka minut. Wyj soczewki kontaktowe, je eli s i mo na je atwo usun . Nadal p uka . Natychmiast skontaktowa si z O RODKIEM ZATRU lub lekarzem. P342 + P311: W przypadku wyst pienia objawów ze strony uk adu oddechowego: Skontaktowa si z O RODKIEM ZATRU lub lekarzem. P362 + P364: Zanieczyszczon odzie zdj i wypra przed ponownym u yciem. 10 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek Zestaw/kasety ® cobas EGFR Mutation Test v2 24 testy (P/N: 07248563190) 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 Elementy i sk adniki odczynników cobas EGFR Mutation Test v2 Ilo na test EGFR MMX-1 (EGFR Master Mix 1) (P/N 06471366001) Bufor Tris Chlorek potasu Glicerol EDTA Tween 20 3,13% dimetylosulfotlenku 0,09% azydku sodu 2 x 0,48 ml < 0,10% dNTP < 0,01% polimerazy DNA Z05-AS1 (bakteryjnej) < 0,01% enzymu AmpErase (uracyloN-glikozylazy) (bakteryjnej) < 0,01% aptameru < 0,01% primerów sensownych i antysensownych EGFR < 0,01% sond EGFR znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym EGFR MMX-2 (EGFR Master Mix 2) (P/N 06471382001) Bufor Tris Chlorek potasu Glicerol EDTA Tween 20 3,13% dimetylosulfotlenku 0,09% azydku sodu 2 x 0,48 ml < 0,10% dNTP < 0,01% polimerazy DNA Z05-AS1 (bakteryjnej) < 0,01% enzymu AmpErase (uracyloN-glikozylazy) (bakteryjnej) < 0,01% aptameru < 0,01% primerów sensownych i antysensownych EGFR < 0,01% sond EGFR znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym EGFR MMX-3 v2 (EGFR Master Mix 3) (P/N 07248610001) Bufor Tris Chlorek potasu Glicerol EDTA Tween 20 3,13% dimetylosulfotlenku 0,09% azydku sodu 2 x 0,48 ml < 0,10% dNTP < 0,01% polimerazy DNA Z05-AS1 (bakteryjnej) < 0,01% enzymu AmpErase (uracyloN-glikozylazy) (bakteryjnej) < 0,01% aptameru < 0,01% primerów sensownych i antysensownych EGFR < 0,01% sond EGFR znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym a Symbol bezpiecze stwa i ostrze enie Nie dotyczy Nie dotyczy Nie dotyczy 11 CZ Zestaw/kasety cobas EGFR Mutation Test v2 Elementy i sk adniki odczynników MGAC (Octan magnezu) (P/N 05854326001) Octan magnezu 0,09% azydku sodu EGFR MC (EGFR Kontrola mutacji) (P/N 06471455001) Bufor Tris EDTA Poli-rA RNA (syntetyczny) 0,05% azydku sodu < 0,1% plazmidowego DNA (bakteryjnego) zawieraj cego sekwencje eksonów: 18., 19., 20. i 21. genu koduj cego EGFR < 0,1% naturalnie wyst puj cego DNA genu koduj cego EGFR (z hodowli komórkowej) DNA SD (DNA Rozcie czalnik próbki) (P/N 05854474001) Bufor Tris-HCl 0,09% azydku sodu ® cobas EGFR Mutation Test v2 24 testy (P/N: 07248563190) a ® A: Do stosowania z próbkami tkanek Ilo na test a Symbol bezpiecze stwa i ostrze enie Nie dotyczy 6 x 0,2 ml Nie dotyczy 6 x 0,1 ml Nie dotyczy 2 x 3,5 ml Oznakowanie bezpiecze stwa produktu jest zasadniczo zgodne z wytycznymi GHS UE. Przechowywanie i u ytkowanie odczynników Odczynnik ® cobas DNA Sample Preparation Kit* ® cobas EGFR Mutation Test v2** Uwaga: Nie wolno zamra Temperatura przechowywania Czas przechowywania od 15°C do 30°C Po otwarciu zachowuj stabilno do 8-krotnego ycia w ci gu 90 dni lub do podanej daty wa no ci, w zale no ci od tego, który termin wypada wcze niej. od 2°C do 8°C Po otwarciu zachowuj stabilno do 4-krotnego ycia w ci gu 90 dni lub do podanej daty wa no ci, w zale no ci od tego, który termin wypada wcze niej. odczynników z wyj tkiem odczynnika PK. * Po dodaniu ja owej wody wolnej od nukleaz do odczynnika PK, niezu yty, rozpuszczony odczynnik PK nale y przechowywa w porcjach o równych obj to ciach po 450 µl w temperaturze -20°C. Po rozpuszczeniu odczynnik PK trzeba zu w ci gu 90 dni albo do daty wa no ci, zale nie od tego, który termin wypada wcze niej. Po dodaniu etanolu bezwodnego odczynniki WB I i WB II nale y przechowywa w temperaturze od 15°C do 30°C. Wymienione roztwory robocze zachowuj stabilno przez 90 dni albo do daty wa no ci, w zale no ci od tego, który termin wypada wcze niej. ** Odczynniki EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2 oraz roboczy odczynnik MMX (przygotowany przez dodanie odczynnika MGAC do EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 v2) nale y chroni przed d ugotrwa ekspozycj na wiat o. Roboczy odczynnik MMX trzeba przechowywa w zaciemnionym miejscu w temperaturze od 2°C do 8°C. Przygotowane próbki i kontrole nale y doda do roboczego odczynnika MMX w ci gu 1 godziny od jego przygotowania. Amplifikacj nale y rozpocz w ci gu 1 godziny od chwili dodania przygotowanych próbek badanych i kontrolnych do roboczego odczynnika MMX. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 12 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 Wymagane materia y dodatkowe Materia y Ksylen (ACS, P/N 98,5% ksylenów) Dowolny dostawca Etanol bezwodny (200 proof, do biologii molekularnej) Sigma, nr kat. E7023 lub Fisher Scientific, nr kat. BP2818-500 albo odpowiednik Izopropanol (ACS, >99,5%) Sigma, nr kat. 190764 lub Fisher Scientific, nr kat. A451-1 albo odpowiednik Ja owa woda wolna od nukleazy (do biologii molekularnej) Applied Biosystems (Ambion) AM9937 lub TM GE Healthcare Hyclone SH3053801 albo odpowiednik Wybielacz Dowolny dostawca 70% etanol Dowolny dostawca Ja owe, jednorazowe, serologiczne pipety 5 i 25 ml Dowolny dostawca ® ytki z mikrodo kami systemu cobas 4800 (p ytki AD) i folie do Roche 05232724001 zaklejania ® Aplikator folii do zaklejania systemu cobas 4800 (dostarczany ® wraz z instalacj systemu cobas 4800) Roche 04900383001 Pipetory regulowane* (mog ce pipetowa 5–1000 µl) Dowolny dostawca Wolne od DNaz ko cówki z os on aerozolow lub wyrzutnikiem Dowolny dostawca TM Pipet-Aid * Drummond 4-000-100 albo odpowiednik Mikrowirówka laboratoryjna* (umo liwiaj ca wirowanie przy 20 000 x g) Eppendorf 5430 lub 5430R albo odpowiednik Dwa suche bloki grzejne, umo liwiaj ce ogrzewanie probówek do mikrowirówki do temperatury 56°C i 90°C* Dowolny dostawca TM Probówki do mikrowirówki Safe-Lock (ja owe o pojemno ci 1,5 ml, wolne od RNaz/DNaz, o czysto ci do PCR) Eppendorf 022363204 albo odpowiednik Statywy do probówek do mikrowirówki Dowolny dostawca Spektrofotometr do pomiaru st Dowolny dostawca enia DNA* Mieszad o wibracyjne* kawiczki jednorazowe, bezpudrowe Kalibrowane termometry do suchego bloku grzejnego* nia wodna*, umo liwiaj ca utrzymywanie temperatury 37°C Skalpel z jednostronnym ostrzem lub podobne narz dzie Dowolny dostawca Dowolny dostawca Dowolny dostawca Dowolny dostawca Dowolny dostawca * Ca e wyposa enie powinno by konserwowane zgodnie z instrukcjami producenta. W celu uzyskania dodatkowych informacji dotycz cych materia ów sprzedawanych oddzielnie prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 13 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 Urz dzenia i oprogramowanie wymagane, lecz niedostarczane Urz dzenia i oprogramowanie wymagane, lecz niedostarczane Analizator cobas z 480 ® Jednostka steruj ca systemu cobas 4800 z oprogramowaniem systemowym w wersji 2.1 lub nowszej Pakiet oprogramowania EGFR Tissue Analysis Package Software w wersji 1.0 lub nowszy Zewn trzny czytnik kodów kreskowych, pod czany do portu USB Drukarka (np. HP P2055d) W celu uzyskania dodatkowych informacji dotycz cych materia ów sprzedawanych oddzielnie prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche. Wymagania dotycz ce rodków ostro no ci i u ytkowania Ostrze enia i rodki ostro no ci Podobnie jak w przypadku ka dej procedury testowej, dla prawid owego przeprowadzenia badania kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Do stosowania wy cznie w diagnostyce in vitro. Karty charakterystyki (Safety Data Sheet, SDS) s dost pne na przedstawicielstwie firmy Roche. danie w miejscowym Niniejszy test jest przeznaczony do badania próbek FFPET NSCLC. Z próbkami nale y obchodzi si tak, jak z materia em zaka nym, stosuj c laboratoryjne procedury bezpiecze stwa, takie jak okre lone w dokumentach Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories8 oraz w dokumencie M29-A4 CLSI9. Odczynniki DNA PBB i DNA TLB zawieraj Triton X-100, rodek dra ni cy b ony luzowe. Nale y unika kontaktu tych odczynników z oczami, skór i b onami luzowymi. Ksylen to niebezpieczny zwi zek chemiczny i podczas u ywania go nale y korzysta z wyci gu chroni cego przed chemikaliami. Nale y go wyrzuca wraz z odpadami chemicznymi zgodnie z przepisami lokalnymi, stanowymi i federalnymi. Zaleca si u ywanie ja owych, jednorazowych pipet oraz ko cówek pipetorów wolnych od DNaz. Dobra praktyka laboratoryjna Nie nale y pipetowa za pomoc ust. Nie wolno je , pi ani pali w obszarach roboczych laboratorium. Po pracy z próbkami i zestawami odczynników nale y dok adnie umy r ce. Podczas pracy z jakimikolwiek odczynnikami nale y u ywa os on na oczy oraz fartuchów laboratoryjnych i r kawic jednorazowych. Nale y unika kontaktu wymienionych materia ów ze skór , oczami i b onami luzowymi. Je eli dojdzie do kontaktu, miejsce jego wyst pienia nale y natychmiast sp uka du ilo ci wody. Je eli nie zostan podj te odpowiednie dzia ania lecznicze, mo e doj do oparze . W razie rozlania przed wytarciem nale y rozcie czy wod . Dok adnie oczy ci i odkazi wszystkie laboratoryjne powierzchnie robocze wie o przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie destylowanej lub dejonizowanej (rozcie czy domowy wybielacz w stosunku 1:10). Nast pnie nale y przetrze powierzchni 70% etanolem. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 14 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 Uwaga: Dost pny w handlu p ynny wybielacz przeznaczony do zastosowa domowych zazwyczaj zawiera podchloryn sodu o st eniu 5,25%. Rozcie czenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 daje 0,5% roztwór podchlorynu sodu. Zanieczyszczenie W celu zapobie enia zanieczyszczeniu konieczne jest noszenie r kawic i ich zmiana pomi dzy prac z próbkami a odczynnikami testu cobas® EGFR. Podczas pracy z próbkami nale y unika zanieczyszczenia r kawiczek. kawiczki nale y cz sto zmienia , aby ograniczy mo liwo zanieczyszczenia. kawiczki nale y zmienia przed opuszczeniem obszarów izolacji DNA lub w przypadku podejrzenia kontaktu z roztworami lub próbk . Nale y unika zanieczyszczenia odczynników przez rybonukleazy i mikrobiologicznego. Przed przygotowaniem roboczego MMX nale y dok adnie oczy ci obszar roboczy amplifikacji i detekcji. Materia y i urz dzenia powinny by przeznaczone do ka dego z dzia ; nie mog by stosowane w innych dzia aniach lub przenoszone pomi dzy obszarami. Na przyk ad pipetory i materia y przeznaczone do izolacji DNA nie mog by stosowane do przygotowywania odczynników do amplifikacji i detekcji. Zdecydowanie zaleca si , aby przebieg pracy w laboratorium by jednokierunkowy i polega na zako czeniu jednej czynno ci przed przej ciem do kolejnej. Na przyk ad izolacj DNA nale y zako czy przed rozpocz ciem amplifikacji i detekcji. Izolacja DNA powinna by prowadzona w obszarze oddzielonym od amplifikacji i detekcji. Aby unikn zanieczyszczenia odczynnika roboczego Master Mix próbkami DNA, obszar roboczy amplifikacji i detekcji powinien by dok adnie oczyszczony przed przygotowaniem odczynnika roboczego Master Mix. Integralno Nie wolno u ywa zestawów po up ywie daty wa no ci. Nie nale y zlewa odczynników pochodz cych z ró nych zestawów lub serii. Nie wolno u ywa przedmiotów jednorazowego u ytku po up ywie daty wa no ci. Wszystkie przedmioty jednorazowego u ytku s przeznaczone do jednokrotnego u ycia. Nie wykorzystywa ponownie. Ca e wyposa enie powinno by odpowiednio konserwowane, zgodnie z instrukcjami producenta. Utylizacja Odczynniki DNA TLB, DNA EB, MGAC, EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2, EGFR MC i DNA SD zawieraj azydek sodu. Azydek sodu mo e reagowa z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z o owiu lub miedzi, tworz c silnie wybuchowe azydki metali. Usuwaj c roztwory zawieraj ce azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, nale y sp uka rury du ilo ci zimnej wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków. Nale y wyrzuci wszystkie nieu yte odczynniki, post puj c zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 15 CZ A: Do stosowania z próbkami tkanek ® cobas EGFR Mutation Test v2 Rozlanie p ynów i czyszczenie Odczynniki DNA PBB i WB I zawieraj chlorowodorek guanidyny. Je li p yn zawieraj cy wspomniany bufor ulegnie rozlaniu, do czyszczenia nale y u ywa odpowiedniego detergentu laboratoryjnego i wody. W przypadku rozlania p ynu zawieraj cego potencjalne czynniki zaka ne do czyszczenia nale y u ywa najpierw detergentu laboratoryjnego i wody, a nast pnie 0,5% roztworu podchlorynu sodu. Je li do rozlania p ynu dojdzie na powierzchni aparatu cobas® 4800, nale y post powa zgodnie z instrukcjami zamieszczonymi w odpowiednim Podr czniku u ytkownika systemu cobas® 4800 w celu przeprowadzenia czyszczenia. Do czyszczenia analizatora cobas z 480 nie wolno u ywa roztworu podchlorynu sodu (wybielacza). Czyszczenie analizatora cobas z 480 nale y przeprowadza zgodnie z procedurami opisanymi w Podr czniku u ytkownika systemu cobas® 4800. Dodatkowe ostrze enia, rodki ostro no ci i procedury maj ce na celu zmniejszenie ryzyka zanieczyszczenia analizatora cobas z 480 zamieszczono w Instrukcji obs ugi analizatora cobas z 480. Pobieranie, transport i przechowywanie próbek Uwaga: Ze wszystkimi próbkami nale y obchodzi si jak z materia em potencjalnie zaka nym. Pobieranie próbek Próbki NSCLC FFPET zosta y zatwierdzone do wykorzystania w te cie cobas® EGFR. Przechowywanie i trwa próbek podczas transportu Próbki FFPET NSCLC mo na transportowa w temperaturze od 15°C do 30°C. Próbki FFPET musz by transportowane zgodnie z krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi przepisami dotycz cymi transportu czynników etiologicznych10. Stabilno próbek FFPET przechowywanych w temperaturze od 15°C do 30°C potwierdzono przez okres do 12 miesi cy od daty pobrania. Skrawki o grubo ci pi ciu mikronów, osadzone na szkie kach, mo na przechowywa w temperaturze od 15°C do 30°C do 60 dni. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 16 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek Przechowywanie i stabilno cobas EGFR Mutation Test v2 próbki przetworzonej Próbki przetworzone (wyizolowany DNA) s stabilne przez: Temperatura przechowywania wyizolowanego DNA Od -15°C do -25°C Od 2°C do 8°C Od 15°C do 30°C Czas przechowywania Do 3 cykli rozmra ania przez 60 dni Do 14 dni Do 1 dnia Wyizolowany DNA powinien by u ywany w zalecanych okresach przechowywania lub przed up ywem daty wa no ci zestawu cobas® DNA Sample Preparation Kit u ytego do izolacji DNA, w zale no ci od tego, co nast pi wcze niej. Procedura testowa Wykonywanie oznaczenia Ryc. 1 ® ® Przebieg pracy z testem cobas EGFR Mutation Test v2 i zestawem cobas DNA Sample Preparation Kit 1 Uruchomienie systemu. 2 Wykonanie czynno ci konserwacyjnych dla aparatu. 3 Wyj cie próbek i odczynników z miejsca przechowywania. 4 Pozbawienie próbek parafiny. 5 Przeprowadzenie izolacji DNA. 6 Elucja DNA 7 Utworzenie zlecenia pracy i wydrukowanie uk adu p ytki. 8 Przygotowanie odczynników do amplifikacji. 9 Umieszczenie odczynników do amplifikacji na p ytce z mikrodo kami. 10 Umieszczenie próbki na p ytce z mikrodo kami. 11 Uszczelnienie p ytki z mikrodo kami. 12 Umieszczenie p ytki z mikrodo kami w analizatorze cobas z 480. 13 Rozpocz cie przebiegu. 14 Przeanalizowanie wyników. 15 W przypadku korzystania z systemu LIS: przes anie wyników do systemu LIS. 16 Wyj cie p ytki z analizatora. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 17 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 Instrukcja u ytkowania Uwaga: Do badania za pomoc testu cobas® EGFR mo na u ywa wy cznie skrawków próbki FFPET NSCLC o grubo ci 5 mikronów, zawieraj cych co najmniej 10% tkanki guza z danego obszaru. Ka próbk zawieraj mniej ni 10% tkanki guza z danego obszaru nale y po pozbawieniu jej parafiny przeci makroskopowo. Uwaga: Szczegó owe wskazówki dotycz ce obs ugi analizatora cobas z 480 zamieszczono w Instrukcji obs ugi analizatora cobas z 480. Uwaga: Suche bloki grzejne, umo liwiaj ce ogrzewanie probówek do mikrowirówki Safe-LockTM, nale y czy i nastawi na temperatury 56°C i 90°C. Wielko przebiegu Pojedynczy przebieg testowy mo e obejmowa od 1 do 30 próbek (plus kontrole) w ka dej p ytce z 96 mikrodo kami. Przy przeprowadzaniu przebiegu testowego obejmuj cego wi cej ni 24 próbki trzeba b dzie u wielu zestawów testu cobas® EGFR. Test cobas® EGFR zawiera ilo odczynników wystarczaj do wykonania 8 przebiegów testowych po 3 próbki (plus kontrole), czyli maksymalnie na 24 próbki na zestaw. Przygotowanie odczynników Przed u yciem zestawu po raz pierwszy przygotowa odczynniki robocze zgodnie z tabel poni ej. Do dozowania wody u pipety serologicznej 5 ml. Do dozowania etanolu u pipet serologicznych 25 ml. Je li proteinaza K zosta a ju rozpuszczona i zamro ona, rozmrozi liczb równych obj to ci odczynnika, wystarczaj do przetworzenia liczby próbek przeznaczonych do danego przebiegu testowego. Odczynniki Rozpuszczenie / Przygotowanie Proteinaza K (PK) Rozpu ci proteinaz K (PK) przez dodanie do fiolki 4,5 ml ja owej wody niezawieraj cej nukleazy (o stopniu czysto ci odpowiednim do PCR) za pomoc ja owej, jednorazowej pipety serologicznej o pojemno ci 5 ml. Wymiesza zawarto , odwracaj c fiolk do góry dnem od 5 do 10 razy. Przenie porcje 450 µl rozpuszczonej PK do probówek do mikrowirówki TM Safe-Lock o pojemno ci 1,5 ml i przechowywa w temperaturze -20°C przez maksymalnie 90 dni lub do daty wa no ci, w zale no ci od tego, co nast pi wcze niej. Je li proteinaza K zosta a ju rozpuszczona i zamro ona, przed pozbawieniem próbek parafiny rozmrozi liczb równych obj to ci odczynnika, wystarczaj do przetworzenia liczby próbek przeznaczonych do danego przebiegu testowego (ka da próbka wymaga 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK). Bufor do p ucz cy I (WB I) Przygotowa roboczy odczynnik WB I dodaj c 15 ml alkoholu bezwodnego do butelki WB I. Wymiesza odwracaj c butelk od 5 do 10 razy. Zapisa na butelce, e dodano etanol, i wpisa dat . Przechowywa odczynnik WB I w temperaturze od 15°C do 30°C przez maksymalnie 90 dni lub do daty wa no ci, w zale no ci od tego, co nast pi wcze niej. Bufor do p ucz cy II (WB II) Przygotowa roboczy odczynnik WB II przez dodanie do butelki z odczynnikiem WB II 50 ml etanolu bezwodnego. Wymiesza zawarto , odwracaj c butelk do góry dnem od 5 do 10 razy. Zapisa na butelce, e dodano etanol, i wpisa dat . Przechowywa odczynnik WB II w temperaturze od 15°C do 30°C przez maksymalnie 90 dni lub do daty wa no ci, w zale no ci od tego, co nast pi wcze niej. Wszystkie roztwory przechowywane w temperaturze od 15°C do 30°C powinny by klarowne. Je eli w którymkolwiek odczynniku obecny jest osad, ogrza roztwór w ni wodnej o temperaturze 37°C a do rozpuszczenia si osadu. Nie wolno u ywa odczynnika do czasu rozpuszczenia si ca ego osadu. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 18 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 Pozbawienie parafiny skrawków FFPET osadzonych na szkie kach Uwaga: Ksylen to niebezpieczny zwi zek chemiczny. Wszystkie etapy pozbawiania próbek parafiny nale y wykonywa pod wyci giem chroni cym przed chemikaliami. Patrz rozdzia Ostrze enia i rodki ostro no ci. Uwaga: Je eli próbka zawiera poni ej 10% tkanki guza z danego obszaru, skrawek nale y przeci makroskopowo. 1. W szkie ko z osadzonym skrawkiem FFPET o grubo ci 5 mikronów do pojemnika zawieraj cego ksylen w ilo ci wystarczaj cej do przykrycia tkanki; pozostawi do nasi kni cia przez 5 minut. 2. Przenie szkie ko do pojemnika z etanolem bezwodnym w ilo ci wystarczaj cej do przykrycia tkanki; pozostawi do nasi kni cia przez 5 minut. 3. Wyj szkie ko z etanolu i odczeka , a skrawek ca kowicie wyschnie na powietrzu (od 5 do 10 minut). 4. Je li próbka zawiera mniej ni 10% tkanki guza z danego obszaru, nale y przeci 5. Oznakowa jedn probówk do mikrowirówki Safe-Lock informacjami umo liwiaj cymi zidentyfikowanie próbki. TM j makroskopowo. o pojemno ci 1,5 ml na ka próbk 6. Doda 180 µl odczynnika DNA TLB do probówki do mikrowirówki Safe-LockTM o pojemno ci 1,5 ml. 7. Doda 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK do probówki do mikrowirówki Safe-LockTM zawieraj cej odczynnik DNA TLB. 8. Zeskroba tkank ze szkie ka do probówki do mikrowirówki Safe-LockTM. Zanurzy tkank w mieszaninie odczynników DNA TLB/PK. 9. Kontynuowa post powanie od punktu 1 procedury izolacji DNA. Pozbawienie parafiny skrawków FFPET nieosadzonych na szkie kach Uwaga: Ksylen to niebezpieczny zwi zek chemiczny. Wszystkie etapy pozbawiania próbek parafiny nale y wykonywa pod wyci giem chroni cym przed chemikaliami. Patrz rozdzia Ostrze enia i rodki ostro no ci. Uwaga: Je li próbka zawiera mniej ni 10% tkanki guza z danego obszaru, nale y osadzi skrawek na szkie ku w celu makroskopowego przeci cia, a nast pnie post powa zgodnie z procedur omówion w rozdziale „Pozbawienie parafiny skrawków FFPET osadzonych na szkie kach”. 1. W jeden skrawek FFPET o grubo ci 5 mikronów do probówki do mikrowirówki Safe-LockTM o pojemno ci 1,5 ml oznakowanej informacjami umo liwiaj cymi zidentyfikowanie ka dej próbki. 2. Doda 500 µl ksylenu do probówki do mikrowirówki Safe-LockTM, zawieraj cej skrawek FFPET. 3. Miesza dok adnie na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund. 4. Odstawi probówk na 5 minut w temperaturze od 15°C do 30°C. 5. Doda 500 µl etanolu bezwodnego i miesza na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund. 6. Odstawi probówk na 5 minut w temperaturze od 15°C do 30°C. 7. Wirowa z przyspieszeniem od 16 000 x g do 20 000 x g przez 2 minuty. Usun uszkodzenia peletki. Wyrzuci supernatant do odpadów chemicznych. supernatant bez 8. Doda 1 ml etanolu bezwodnego i miesza na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund. 9. Wirowa z przyspieszeniem od 16 000 x g do 20 000 x g przez 2 minuty. Usun uszkodzenia peletki. Wyrzuci supernatant do odpadów chemicznych. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 supernatant bez 19 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 10. Je li peletka unosi si w pozosta ym supernatancie, ponownie wirowa przez 1 minut z przyspieszeniem od 16 000 x g do 20 000 x g. Usun pozosta y supernatant. 11. Suszy peletk tkanki przez 10 minut w bloku grzejnym o temperaturze 56 C w otwartej probówce. 12. Przed przej ciem do nast pnego etapu nale y upewni si , e etanol zosta ca kowicie odparowany i peletka jest sucha. 13. W razie potrzeby suche peletki mo na przechowywa do 24 godzin w temperaturze od 2°C do 8°C. 14. Wytworzy z peletki tkanki ponownie zawiesin w 180 µl odczynnika DNA bufor do lizy tkanek (DNA TLB). 15. Doda 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK. 16. Kontynuowa post powanie od punktu 1 procedury izolacji DNA. Procedura izolacji DNA Uwaga: Jednocze nie z próbk (-ami) nale y przeprowadzi przetwarzanie kontroli ujemnej. Przygotowa kontrol ujemn przez po czenie 180 µl odczynnika DNA Bufor do lizy tkanek (DNA TLB) i 70 µl roztworu odczynnika PK w probówce do mikrowirówki Safe-LockTM o pojemno ci 1,5 ml, oznakowanej napisem NEG. Przetwarzanie kontroli ujemnej powinno przebiega wed ug takiej samej procedury, jak przetwarzanie próbek. 1. Miesza na mieszadle wibracyjnym przez 30 sekund probówki zawieraj ce mieszanin DNA TLB/PK i mieszanin kontroli ujemnej (NEG). próbka/ Uwaga: Tkanka musi by ca kowicie zanurzona w mieszaninie DNA TLB/PK. 2. Umie ci probówki w suchym bloku grzejnym o temperaturze 56°C i inkubowa przez 60 minut. 3. Miesza probówki na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund. Uwaga: Tkanka musi by ca kowicie zanurzona w mieszaninie DNA TLB/PK. 4. Umie ci probówki w suchym bloku grzejnym o temperaturze 90°C i inkubowa przez 60 minut. Uwaga: Podczas inkubacji nale y przygotowa wymagan liczb probówek z filtrem (FT) z zawiasowymi zatyczkami, umieszczaj c ka FT na probówce zbiorczej (CT) i oznakowuj c zatyczk ka dej FT odpowiednimi informacjami identyfikuj cymi próbk lub kontrol . Uwaga: Na ka próbk b potrzebne: 1 FT, 3 CT i 1 probówka do elucji (probówka do mikrowirówki Safe-LockTM o pojemno ci 1,5 ml). Uwaga: Podczas inkubacji nale y oznakowa wymagan liczb probówek do elucji (probówek do mikrowirówki o pojemno ci 1,5 ml) odpowiednimi informacjami identyfikuj cymi próbk lub kontrol . 5. Pozostawi probówki do sch odzenia do temperatury od 15°C do 30°C. Po sch odzeniu odwirowa pulsacyjnie, aby zgromadzi p yn z zatyczek. 6. Doda do ka dej probówki po 200 µl odczynnika DNA PBB i wymiesza pobranie mieszaniny pipet i jej wypuszczenie. zawarto przez trzykrotne 7. Inkubowa probówki w temperaturze od 15°C do 30°C przez 10 minut. 8. Doda do ka dej probówki 100 µl izopropanolu i 3 razy wymiesza i wypuszczanie. 9. Przenie ka dy lizat do w lizat przez nabieranie pipet ciwie oznakowanej jednostki FT/CT. 10. Wirowa jednostki FT/CT z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minut . 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 20 CZ A: Do stosowania z próbkami tkanek 11. Umie ci ka probówk FT na nowej probówce CT. Wyrzuci zawarto odpadów chemicznych i w odpowiedni sposób usun zu yt probówk CT. ® cobas EGFR Mutation Test v2 ze starej probówki CT do 12. Doda 500 µl roboczego odczynnika WB I do ka dej probówki FT. Uwaga: Przygotowanie roboczego odczynnika WB I opisano w rozdziale „Przygotowanie odczynników”. 13. Wirowa jednostki FT/CT z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minut . 14. Wyrzuci zawarto ka dej probówki CT do odpadów chemicznych. Umie ci probówk FT z powrotem na tej samej probówce CT. 15. Doda 500 µl roboczego odczynnika WB II do ka dej probówki FT. Uwaga: Przygotowanie roboczego odczynnika WB II opisano w rozdziale „Przygotowanie odczynników”. 16. Wirowa jednostki FT/CT z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minut . 17. Umie ci ka probówk FT na nowej probówce CT. Wyrzuci zawarto odpadów chemicznych i w odpowiedni sposób usun zu yt probówk CT. ze starej probówki CT do 18. Wirowa jednostki FT/CT z przyspieszeniem od 16 000 do 20 000 x g przez 1 minut , aby osuszy membrany filtrów. 19. Umie ci ka FT w probówce do elucji (probówce do mikrowirówki o pojemno ci 1,5 ml), oznakowanej uprzednio informacjami identyfikuj cymi próbk lub kontrol . Wyrzuci zawarto ze zu ytej probówki CT do odpadów chemicznych i w odpowiedni sposób usun zu yt probówk CT. 20. Doda po 100 µl odczynnika DNA EB na rodek membrany ka dej probówki FT bez dotykania membrany probówki FT. 21. Inkubowa probówk FT z probówk do elucji w temperaturze od 15°C do 30°C przez 5 minut. 22. Wirowa probówk FT z probówk do elucji z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minut , aby zebra eluat do probówki do elucji. Usun w odpowiedni sposób zu yt probówk FT. 23. Zamkn zatyczk na probówce do elucji. Probówka do elucji zawiera roztwór podstawowy DNA. Przej do punktu 1 w rozdziale Ocena ilo ciowa st enia DNA. Uwaga: Pomiar st enia DNA nale y przeprowadza natychmiast po zako czeniu procedury izolacji DNA i przed od eniem materia u do przechowywania. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 21 CZ A: Do stosowania z próbkami tkanek Ocena ilo ciowa st ® cobas EGFR Mutation Test v2 enia DNA 1. Wymiesza ka dy roztwór podstawowy DNA na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund. 2. Przeprowadzi ocen ilo ciow st enia DNA za pomoc spektrofotometru zgodnie z protoko em post powania, podanym przez producenta urz dzenia. Do wyzerowania urz dzenia u odczynnika DNA EB. Nale y obliczy redni z dwóch zgodnych odczytów. Wyniki dwóch pomiarów powinny mie ci si w granicach ± 10% ka dego z nich przy odczytach st enia DNA > 20,0 ng/µl. W przypadku odczytów st enia DNA < 20,0 ng/µl wyniki dwóch pomiarów powinny mie ci si w granicach ± 2 ng/µl. Je eli wyniki dwóch pomiarów nie mieszcz si w granicach ± 10% ka dego z nich przy odczytach st enia DNA > 20,0 ng/µl lub w granicach ± 2 ng/µl przy odczytach st enia DNA < 20,0 ng/µl, nale y uzyska dodatkowe 2 odczyty, aby wymogi badania zosta y spe nione. Wówczas nale y obliczy redni z dwóch nowych wyników pomiarów. Uwaga: Nie ma potrzeby wykonywania pomiarów w przypadku roztworu podstawowego DNA, pochodz cego z przetworzonej kontroli ujemnej (NEG CT). 3. St enie roztworu podstawowego DNA, pochodz cego z próbek, musi by > 2 ng/µl, aby mo na by o wykona test cobas® EGFR. Ka próbk poddaje si trzykrotnej amplifikacji/detekcji z u yciem w ka dej amplifikacji/detekcji 25 µl rozcie czonego roztworu podstawowego DNA o st eniu 2 ng/µl (co daje ogó em 50 ng DNA). Uwaga: Aby mo na by o przeprowadzi test cobas® EGFR, ka dy roztwór podstawowy DNA musi mie minimalne st enie 2 ng/µl. Je eli st enie roztworu podstawowego DNA jest < 2 ng/µl, nale y powtórzy procedury: pozbawiania próbek parafiny, izolacji DNA i oceny ilo ciowej st enia DNA z u yciem dwóch skrawków FFPET tej próbki o grubo ci 5 µm. W przypadku próbek osadzonych na szkie kach po pozbawieniu ich parafiny nale y po czy tkank z obu skrawków w jednej probówce, zanurzy tkank w odczynnikach DNA TLB + PK i przeprowadzi izolacj oraz ocen ilo ciow st enia DNA w sposób opisany powy ej. W przypadku próbek nieosadzonych na szkie kach nale y po czy oba skrawki w jednej probówce i zanurzy tkank w odczynnikach DNA TLB + PK, po czym przeprowadzi izolacj oraz ocen ilo ciow st enia DNA w sposób opisany powy ej. Je eli st enie roztworu podstawowego DNA nadal jest < 2 ng/µl, nale y zwróci si do o rodka klinicznego, zlecaj cego wykonanie badania, o przys anie kolejnej próbki FFPET. Uwaga: Przetwarzane próbki (wyizolowane DNA) s stabilne maksymalnie przez 24 godziny w temperaturze od 15°C do 30°C, maksymalnie przez 14 dni w temperaturze od 2°C do 8°C, maksymalnie przez 60 dni w temperaturze od -15°C do -25°C lub po przej ciu 3 cykli zamra ania i rozmra ania przy przechowywaniu w temperaturze od -15°C do -25°C. Wyizolowane DNA powinno zosta poddane amplifikacji podczas okresu przechowywania zalecanego w danych warunkach lub przed up yni ciem daty wa no ci zestawu cobas® DNA Sample Preparation Kit u ytego do wyizolowania DNA w zale no ci od tego, co nast pi wcze niej. Amplifikacja i detekcja Uwaga: Aby zapobiec zanieczyszczeniu roboczego odczynnika MMX próbkami DNA, nale y przeprowadza amplifikacj i detekcj w miejscu oddzielonym od obszaru wykonywania izolacji DNA. Przed przygotowaniem roboczego MMX nale y dok adnie oczy ci obszar roboczy amplifikacji i detekcji. W celu w ciwego oczyszczenia nale y dok adnie przetrze wszystkie powierzchnie, w cznie ze statywami i pipetorami, 0,5% roztworem podchlorynu sodu, a nast pnie 70% roztworem etanolu. Dost pny w handlu p ynny wybielacz przeznaczony do zastosowa domowych zazwyczaj zawiera podchloryn sodu o st eniu 5,25%. Rozcie czenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 daje 0,5% roztwór podchlorynu sodu. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 22 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 Konfigurowanie aparatu Szczegó owe wskazówki dotycz ce konfigurowania analizatora cobas z 480 zamieszczono w Instrukcji obs ugi analizatora cobas z 480. Konfiguracja zlecenia testu Szczegó owe instrukcje dotycz ce etapów przebiegu EGFR zamieszczono w Instrukcji obs ugi analizatora cobas® 4800 System cobas z 480 oraz podr czniku operatora oprogramowania cobas® EGFR Mutation Test v2. Wygenerowa map p ytki z pozycjami wszystkich próbek i kontroli do przebiegu. Kontrola mutacji jest umieszczona w pozycjach A01–A03 p ytki. Kontrola ujemna jest umieszczona w pozycjach B01–B03 p ytki. Nast pnie rozcie czone próbki s dodawane w zestawach po 3 kolumny pocz wszy od C01–C03 do H09– H12 jak przedstawia to Ryc. 2. Ryc. 2 Rz d/ kolumna ® Uk ad p ytki dla testu cobas EGFR Mutation Test v2 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 A MC MMX 1 MC MMX 2 MC MMX 3 v2 S7 MMX 1 S7 MMX 2 S7 MMX 3 v2 S15 MMX 1 S15 MMX 2 S15 MMX 3 v2 S23 MMX 1 S23 MMX 2 S23 MMX 3 v2 B NEG MMX 1 NEG MMX 2 S8 MMX 1 S8 MMX 2 S8 MMX 3 v2 S16 MMX 1 S16 MMX 2 S24 MMX 2 S24 MMX 3 v2 S1 MMX 1 S1 MMX 2 S9 MMX 1 S9 MMX 2 S9 MMX 3 v2 S17 MMX 1 S17 MMX 2 S16 MMX 3 v2 S17 MMX 3 v2 S24 MMX 1 C NEG MMX 3 v2 S1 MMX 3 v2 S25 MMX 1 S25 MMX 2 S25 MMX 3 v2 D S2 MMX 1 S2 MMX 2 S10 MMX 1 S10 MMX 2 S10 MMX 3 v2 S18 MMX 1 S18 MMX 2 S26 MMX 2 S26 MMX 3 v2 S3 MMX 1 S3 MMX 2 S11 MMX 1 S11 MMX 2 S11 MMX 3 v2 S19 MMX 1 S19 MMX 2 S18 MMX 3 v2 S19 MMX 3 v2 S26 MMX 1 E S2 MMX 3 v2 S3 MMX 3 v2 S27 MMX 1 S27 MMX 2 S27 MMX 3 v2 F S4 MMX 1 S4 MMX 2 S4 MMX 3 v2 S12 MMX 1 S12 MMX 2 S12 MMX 3 v2 S20 MMX 1 S20 MMX 2 S20 MMX 3 v2 S28 MMX 1 S28 MMX 2 S28 MMX 3 v2 G S5 MMX 1 S5 MMX 2 S13 MMX 1 S13 MMX 2 S13 MMX 3 v2 S21 MMX 1 S21 MMX 2 S29 MMX 2 S29 MMX 3 v2 S6 MMX 1 S6 MMX 2 S14 MMX 1 S14 MMX 2 S14 MMX 3 v2 S22 MMX 1 S22 MMX 2 S21 MMX 3 v2 S22 MMX 3 v2 S29 MMX 1 H S5 MMX 3 v2 S6 MMX 3 v2 S30 MMX 1 S30 MMX 2 S30 MMX 3 v2 Gdzie: MC = kontrola mutacji, NEG = kontrola ujemna, S# = identyfikator próbki, a MMX-# odpowiada odczynnikowi Master Mix 1, 2 lub 3 v2. Uwaga: Ka da próbka musi rozci ga si przez trzy kolejne kolumny w jednym rz dzie, aby mo liwe by o utworzenie wyniku. Uwaga: Odczynnik roboczy Master Mix 1 musi by umieszczony w kolumnie 01, 04, 07 i 10 na p ytce. Odczynnik roboczy Master Mix 2 musi by umieszczony w kolumnie 02, 05, 08 i 11 na p ytce. Odczynnik roboczy Master Mix 3 v2 musi by umieszczony w kolumnie 03, 06, 09 i 12 na ytce. Uwaga: Na jednej p ytce mo na umie ci do 30 próbek. Je eli do przetworzenia wszystkich próbek na ytce potrzebny jest wi cej ni jeden zestaw odczynnika, wszystkie zestawy musz pochodzi z tej samej serii. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 23 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 Konfigurowanie aparatu 1. W czy analizator cobas z 480. Zanim b dzie mo na rozpocz minut rozgrzewa si . 2. W czy jednostk steruj przebieg, instrument b dzie przez kilka . Jednostka steruj ca automatycznie zaloguje si do systemu Windows. 3. Klikn dwukrotnie ikon oprogramowania cobas® 4800 i zalogowa si , aby przeprowadzi przebieg ywaj c okre lonego identyfikatora u ytkownika laboratorium i has a. 4. Klikn w menu ikon „New Run”. 5. Zostanie wy wietlone okno wyskakuj ce „Select Test”. Wybra „EGFR Tissue Test” i klikn „OK”. przycisk 6. Po wy wietleniu ekranu „Work Place” wpisa lub zeskanowa kod kreskowy MWP w polu „Microwell Plate ID”. Zeskanowa w odpowiednich polach kody kreskowe identyfikatora zestawu do izolacji DNA oraz identyfikator zestawu cobas® EGFR Mutation Test Reagent. W polu „Sample” wprowadzi „24” dla pierwszego i „6” dla drugiego zestawu (je eli planowany jest przebieg dla pe nej p ytki 30 próbek). Je eli planowany jest przebieg dla mniej ni 24 próbek, nale y wprowadzi odpowiedni liczb w pole próbki w pierwszym wierszu. 7. Pole „Sample ID” jest wype niane automatycznie w pozycjach kontroli. Wpisa lub zeskanowa unikatowy identyfikator próbki dla ka dej próbki w kolumnie „Sample ID”. 8. Po zako czeniu wprowadzania identyfikatorów próbek wybra przycisk „Save” znajduj cy si w lewym dolnym rogu ekranu. 9. Zapisa plik pod domy ln nazw przypisan przez oprogramowanie. 10. Wygenerowa uk ad p ytki z pozycjami wszystkich próbek i kontroli w serii klikaj c przycisk Print i wybieraj c File -> Print w oknie Preview. Zawsze wype nia p ytk kolumnami zaczynaj c od EGFR MC w pozycjach A01–A03 i EGFR NEG w pozycjach B01–B03. Mapowa próbki zaczynaj c od pozycji C01– C03 i kontynuowa w dó do H01–H03, nast pnie przechodzi do pozycji A04–A06 w dó do H04–H06, a zostan zmapowane wszystkie próbki (Ryc. 2). Obliczanie rozcie czenia roztworu podstawowego DNA, pochodz cego z próbki Obliczanie rozcie czenia roztworu podstawowego DNA w przypadku st od 2 ng/µl do 36 ng/µl Uwaga: Roztwory podstawowe DNA, pochodz ce z próbek, nale y rozcie cza bezpo rednio przed amplifikacj i detekcj . Uwaga: Ka próbk poddaje si trzykrotnej amplifikacji/detekcji, co wymaga obj to ci rozcie czonego roztworu podstawowego DNA o st eniu 2 ng/µl, wynosz cej ogó em 75 µl (po 25 µl na ka z trzech reakcji) (ogó em 150 ng DNA). 1. Obliczy dla ka dej próbki potrzebn obj to (µl) roztworu podstawowego DNA: ilo µl roztworu podstawowego DNA = (90 µl x 2 ng/µl) ÷ st enie roztworu podstawowego DNA [ng/µl] 2. Obliczy dla ka dej próbki potrzebn obj to ilo µl odczynnika DNA SD = 90 µl – ilo (µl) rozcie czalnika próbki DNA (DNA SD): µl roztworu podstawowego DNA Przyk ad: st enie roztworu podstawowego DNA = 6,5 ng/µl 1. Liczba µl roztworu podstawowego DNA = (90 µl x 2 ng/µl) ÷ 6,5 ng/µl = 27,7 µl 2. Ilo µl odczynnika DNA SD = (90 µl – 27,7 µl) = 62,3 µl 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 24 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 Obliczanie rozcie czenia roztworu podstawowego DNA w przypadku st > 36 ng/µl Uwaga: Roztwory podstawowe DNA, pochodz ce z próbek, nale y rozcie cza bezpo rednio przed amplifikacj i detekcj . Uwaga: Ka próbk poddaje si trzykrotnej amplifikacji/detekcji, co wymaga obj to ci rozcie czonego roztworu podstawowego DNA o st eniu 2 ng/µl, wynosz cej ogó em 75 µl (po 25 µl na ka z trzech reakcji) (ogó em 150 ng DNA). 1. W przypadku st roztworu podstawowego DNA > 36 ng/µl do obliczania ilo ci odczynnika DNA Rozcie czalnik próbki (DNA SD), wymaganej do przygotowania co najmniej 90 µl rozcie czonego roztworu podstawowego DNA, nale y u zamieszczonego poni ej wzoru. Ma to na celu zapewnienie, e do badania ka dej próbki zostanie u yta obj to co najmniej 5 µl roztworu podstawowego DNA. 2. Obliczy dla ka dej próbki obj to (µl) odczynnika DNA SD, potrzebn do rozcie czenia 5 µl roztworu podstawowego DNA do st enia 2 ng/µl: Wymagana obj. DNA SD w µl = [(5 µl roztworu podstawowego DNA x st podstawowego DNA w ng/µl) / 2 ng/µl] – 5 µl enie roztworu Przyk ad: St enie roztworu podstawowego DNA = 100 ng/µl 1. Wymagana obj. DNA SD w µl = [(5 µl x 100 ng/µl) / 2 ng/µl] – 5 µl = 245 µl 2. U obliczonej obj to ci odczynnika DNA SD do rozcie czenia 5 µl roztworu podstawowego DNA. Rozcie czenie próbki 1. Przygotowa stosown liczb probówek do mikrowirówki Safe-LockTM o pojemno ci 1,5 ml na rozcie czenia DNA, oznakowuj c je odpowiednimi informacjami identyfikuj cymi próbk . 2. U ywaj c pipetora z ko cówk zabezpieczon przed powstawaniem aerozolu, przenie pipet obliczone obj to ci odczynnika DNA SD do odpowiednio oznakowanych probówek. Przenie pipet 45 µl odczynnika DNA SD do probówki do mikrowirówki Safe-LockTM oznakowanej napisem NEG. 3. Miesza ka dy roztwór podstawowy DNA i kontrol ujemn na mieszadle wibracyjnym od 5 do 10 sekund. 4. U ywaj c pipetora z ko cówk zabezpieczon przed powstawaniem aerozolu (nowa ko cówka do przenoszenia ka dej próbki), delikatnie przenie pipet obliczon obj to ka dego roztworu podstawowego DNA do odpowiedniej probówki zawieraj cej odczynnik DNA SD. Przenie pipet 45 µl kontroli ujemnej (wyizolowanego eluatu) do probówki z napisem NEG. 5. Zamkn probówki zatyczkami i miesza zawarto 10 sekund. ka dej z nich na mieszadle wibracyjnym od 5 do 6. Zmieni r kawiczki. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 25 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 Konfiguracja reakcji Przygotowanie roboczych odczynników Master Mix (MMX-1, MMX-2 i MMX-3 v2) Uwaga: Odczynniki EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2 oraz roboczy odczynnik MMX s wra liwe na wiat o i nale y je chroni przed d ugotrwa ekspozycj na wiat o. Uwaga: Ze wzgl du na lepko odczynników EGFR MIX oraz roboczego odczynnika MMX przenoszenie pipet nale y wykonywa powoli, aby zagwarantowa podanie z ko cówki ca ej obj to ci mieszaniny. Uwaga: Odczynniki EGFR MMX-1, EGFR MMX-2 i EGFR MMX-3 v2 mog przybiera zabarwienie jasnoniebieskie lub zbli one do purpury. Nie wp ywa to na dzia anie odczynnika. Przygotowa w oddzielnych probówkach do mikrowirówki Safe-LockTM o pojemno ci 1,5 ml trzy wi ksze porcje odczynników potrzebnych do sporz dzenia roboczych odczynników MMX: jedn odczynnika EGFR MMX-1, jedn odczynnika EGFR MMX-2 i jedn odczynnika EGFR MMX-3 v2. 1. Obliczy obj to odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 v2 wymagan do sporz dzenia ka dego z odczynników roboczych MMX wed ug nast puj cego wzoru: Wymagana obj to odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 v2 = (liczba próbek + 2 kontrole +1) x 20 µl 2. Obliczy obj to odczynnika MGAC, wymagan do sporz dzenia ka dego z odczynników roboczych MMX, wed ug nast puj cego wzoru: Wymagana obj to odczynnika MGAC = (liczba próbek + 2 kontrole +1) x 5 µl Pos uguj c si Tabela 2 okre li obj to ka dego odczynnika, potrzebn do przygotowania roboczego odczynnika MMX, na podstawie liczby próbek w czonych do przebiegu testowego. Tabela 2 Obj to ci odczynników, potrzebne do sporz dzenia roboczego odczynnika MMX-1, roboczego odczynnika MMX-2 i roboczego odczynnika MMX-3 v2 Liczba próbek* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MMX 20 µl 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 MGAC 5 µl 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 Ca kowita obj. ka dego roboczego odczynnika MMX (µl) * Obj to ci odpowiadaj ce liczbie próbek obliczono na podstawie sumy: liczba próbek + 2 kontrole + 1 3. Wyj odpowiedni liczb fiolek z odczynnikami EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2 i MGAC z miejsca, w którym by y przechowywane w temperaturze od 2°C do 8°C. Przed u yciem ka dego odczynnika miesza go przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym, po czym zgromadzi p yn na dnie probówki. Oznakowa ja ow probówk do mikrowirówki, przeznaczon na roboczy odczynnik MMX-1, roboczy odczynnik MMX-2 i roboczy odczynnik MMX-3 v2. 4. Doda obliczon obj to odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 v2 do odpowiedniej probówki przeznaczonej na roboczy odczynnik MMX. 5. Doda obliczon obj to 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 odczynnika MGAC do probówek przeznaczonych na robocze odczynniki MMX. 26 CZ A: Do stosowania z próbkami tkanek ® cobas EGFR Mutation Test v2 6. Miesza zawarto probówek na mieszadle wibracyjnym od 3 do 5 sekund, aby zapewni dostateczne wymieszanie odczynnika. Uwaga: Próbki i kontrole nale y doda do p ytki z mikrodo kami (p ytki AD) w ci gu 1 godziny od przygotowania roboczych odczynników MMX. Uwaga: Nale y u ywa wy cznie p ytki z mikrodo kami (p ytki AD) systemu cobas® 4800 oraz odpowiedniej folii do zaklejania. Przygotowanie p ytki 1. Przenie pipet 25 µl roboczego odczynnika MMX do ka dego do ka reakcyjnego p ytki z mikrodo kami (p ytki AD), potrzebnego do przeprowadzenia przebiegu testowego. Nie dopu ci do tego, aby ko cówka pipetora dotkn a p ytki poza obr bem do ka. Doda roboczego odczynnika MMX-1 (zawieraj cego odczynnik EGFR MMX-1) do do ków p ytki z mikrodo kami (p ytki AD) w kolumnach 01, 04, 07 i 10, zgodnie z potrzeb . Doda roboczego odczynnika MMX-2 (zawieraj cego odczynnik EGFR MMX-2) do do ków p ytki z mikrodo kami (p ytki AD) w kolumnach 02, 05, 08 i 11, zgodnie z potrzeb . Doda roboczego odczynnika MMX-3 v2 (zawieraj cego odczynnik EGFR MMX-3 v2) do do ków ytki z mikrodo kami (p ytki AD) w kolumnach 03, 06, 09 i 12, zgodnie z potrzeb . 2. Przenie pipet 25 µl odczynnika EGFR MC do do ków A01, A02 i A03 ytki z mikrodo kami (p ytki AD); dok adnie wymiesza , aspiruj c pipet zawarto i podaj c j z powrotem, co najmniej dwukrotnie w obr bie danego do ka. 3. U ywaj c nowej ko cówki pipetora, przenie pipet 25 µl roztworu NEG do do ków B01, B02 i B03 p ytki z mikrodo kami (p ytki AD); dok adnie wymiesza , aspiruj c pipet zawarto i podaj c j z powrotem, co najmniej dwukrotnie w obr bie danego do ka. Uwaga: Ka dy przebieg testowy musi zawiera kontrol dodatni (odczynnik EGFR MC) w do kach A01, A02 i A03 oraz kontrol ujemn (roztwór NEG) w do kach B01, B02 i B03; w przeciwnym razie przebieg testowy zostanie odrzucony jako niewa ny przez analizator cobas z 480. Uwaga: Nale y zmienia r kawice zgodnie z potrzebami, aby chroni próbki przed wzajemnym zanieczyszczeniem zawartym w nich materia em oraz chroni probówki do reakcji PCR przed zanieczyszczeniem na ich zewn trznych powierzchniach. 4. U ywaj c nowych ko cówek pipetora do ka dej rozcie czonej próbki DNA, doda 25 µl pierwszej próbki DNA do do ków: C01, C02 i C03 p ytki z mikrodo kami (p ytki AD); u ywaj c nowej ko cówki do dodawania próbki DNA do ka dego do ka; dok adnie wymiesza zawarto ka dego do ka, aspiruj c pipet zawarto i podaj c j z powrotem, przynajmniej dwukrotnie w obr bie danego do ka. Powtórzy t procedur dla DNA z ka dej próbki i post powa wed ug szablonu przedstawionego na Ryc. 2, dopóki rozcie czone roztwory DNA ze wszystkich próbek nie zostan umieszczone na p ytce z mikrodo kami (p ytce AD). Upewni si , e ca y p yn zebra si na dnie do ków. 5. Przykry p ytk z mikrodo kami (p ytk AD) foli do zaklejania (dostarczone wraz z p ytkami). U aplikatora folii uszczelniaj cej do szczelnego przytwierdzenia folii do p ytki z mikrodo kami (p ytki AD). 6. Przed rozpocz ciem reakcji PCR potwierdzi , e ca y p yn zebra si na dnie ka dego z do ków. Uwaga: Amplifikacja i detekcja powinny rozpocz si w ci gu 1 godziny od dodania rozcie czonego roztworu DNA z pierwszej próbki do roboczego odczynnika MMX. Rozpocz cie reakcji PCR Szczegó owe wskazówki dotycz ce etapów przebiegu pracy przy wykonywaniu bada genu koduj cego EGFR zamieszczono w Podr czniku u ytkownika testu cobas® EGFR. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 27 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 Wyniki Interpretacja wyników Uwaga: Walidacj przebiegu pracy oraz próbek przeprowadza oprogramowanie cobas® 4800. Uwaga: Wa ny przebieg testowy mo e obejmowa zarówno wa ne, jak i niewa ne wyniki badania próbek. W przypadku wa nego przebiegu wyniki badania próbek interpretuje si w sposób, który przedstawia Tabela 3. Tabela 3 ® Interpretacja wyniku testu cobas EGFR Wynik testu Wynik badania mutacji Interpretacja Ex19Del S768I L858R Mutation Detected T790M L861Q G719X Wykryto mutacj w okre lonym regionie docelowym genu koduj cego EGFR. Ex20Ins (mo e by obecna wi ksza liczba mutacji ni jedna) No Mutation Nie dotyczy Detected (NMD)* Nie wykryto mutacji w regionach docelowych genu koduj cego EGFR. Invalid Nie dotyczy Wynik badania próbki jest niewa ny. Powtórzy test próbek z niewa nymi wynikami, post puj c zgodnie z instrukcj przedstawion poni ej w rozdziale Ponowny test próbek z niewa nymi wynikami. Failed Nie dotyczy Przebieg testowy nie powiód si wskutek awarii sprz tu lub oprogramowania. Skontaktowa si z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej. * Wynik „No Mutation Detected” nie wyklucza obecno ci mutacji w regionach docelowych genu koduj cego EGFR, poniewa wyniki zale od procentu zmutowanych sekwencji, dostatecznej integralno ci próbki, braku inhibitorów i wystarczaj cej do wykrycia ilo ci DNA. Ponowny test próbek z niewa nymi wynikami 1. Powtórzy rozcie czanie roztworu podstawowego DNA z próbki, która da a wynik niewa ny, rozpoczynaj c od procedur: Obliczanie rozcie czenia roztworu podstawowego DNA, pochodz cego z próbki i Rozcie czanie próbki w rozdziale Amplifikacja i detekcja. 2. Po rozcie czeniu roztworu podstawowego DNA do st enia 2 ng/µl, co opisano w rozdziale „Rozcie czanie próbki”, kontynuowa wykonywanie czynno ci opisanych w rozdziale „Przygotowanie roboczych odczynników Master Mix (MMX-1, MMX-2 i MMX-3 v2” oraz pozosta ych czynno ci nale cych do procedury amplifikacji i detekcji. Uwaga: Je eli po ponownym przeprowadzeniu testu wynik badania próbki nadal jest niewa ny lub je li nie by o dostatecznej ilo ci roztworu podstawowego DNA do przygotowania kolejnego rozcie czenia zgodnie z opisem w punkcie A rozdzia u Ponowny test próbek z niewa nymi wynikami, nale y powtórzy ca procedur testu dla tej próbki od etapu pozbawienia parafiny i izolacji DNA, u ywaj c nowego skrawka FFPET guza o grubo ci 5 mikronów. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 28 CZ A: Do stosowania z próbkami tkanek Kontrola jako ci i wa no ® cobas EGFR Mutation Test v2 wyników Ka dy przebieg testowy, licz cy do 30 próbek, zawiera jeden zestaw kontroli mutacji do testu cobas® EGFR (EGFR MC) (do ki A01, A02 i A03) i kontroli ujemnej (NEG) (do ki B01, B02 i B03) dla odczynników roboczych MMX-1, MMX-2 i MMX-3 v2. Przebieg jest wa ny, je eli wa ne s : kontrola mutacji do testu EGFR (EGFR MC) i kontrola ujemna (NEG). Je eli kontrola mutacji do testu EGFR (EGFR MC) lub kontrola ujemna (NEG) jest niewa na, ca y przebieg wymaga powtórzenia. Nale y wówczas przygotowa wie e rozcie czenie roztworu podstawowego DNA, wyizolowanego uprzednio z próbki, aby skonfigurowa now ytk z mikrodo kami (p ytk AD) wraz z kontrolami w celu przeprowadzenia amplifikacji i detekcji. Kontrola mutacji Wynik kontroli mutacji do testu EGFR (EGFR MC) musi nosi okre lenie „Valid”. Je eli wyniki oznaczenia EGFR MC stale s niewa ne, nale y skontaktowa si z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej. Kontrola ujemna Wynik kontroli ujemnej (NEG) musi nosi okre lenie „Valid”. Je eli wyniki oznaczenia NEG stale s niewa ne, nale y skontaktowa si z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej. Ograniczenia metody 1. Do bada nale y u ywa wy cznie okre lonych rodzajów próbek. Test cobas® EGFR Mutation Test v2 zosta zatwierdzony wy cznie do badania próbek NSCLC FFPET guza. 2. Test cobas® EGFR Mutation Test v2 zosta zatwierdzony do u ytku wy cznie z zestawem cobas® DNA Sample Preparation Kit (Roche P/N: 05985536190). 3. Detekcja mutacji zale y od liczby kopii obecnych w próbce, na któr wp ywa mo e integralno ilo wyizolowanego DNA i obecno substancji zak ócaj cych detekcj . próbki, 4. Wiarygodno wyników zale y od dostatecznego utrwalenia próbki, jej transportu, przechowywania i przetwarzania. Nale y przestrzega procedur opisanych w niniejszej ulotce do czonej do opakowania testu oraz w Podr czniku u ytkownika cobas® EGFR Test. 5. Wp yw innych mo liwych zmiennych, takich jak te zwi zane z utrwaleniem próbki, nie zosta zbadany. 6. Dodanie do odczynnika Master Mix testu cobas® EGFR Test enzymu AmpErase umo liwia selektywn amplifikacj docelowego DNA; jednak dla unikni cia zanieczyszczenia odczynników konieczne jest stosowanie dobrej praktyki laboratoryjnej i dok adne przestrzeganie procedur wyszczególnionych w niniejszej ulotce do czonej do opakowania testu. 7. Tego produktu mog u ywa wy cznie osoby przeszkolone w zakresie technik PCR i u ywania systemu cobas® 4800. 8. Do u ycia z tym produktem zosta zatwierdzony wy cznie analizator cobas z 480. Z tym produktem nie wolno u ywa adnego innego termocyklera z systemem optycznym do detekcji w czasie rzeczywistym. 9. Obecno inhibitorów PCR mo e prowadzi do uzyskiwania wyników fa szywie ujemnych lub niewa nych. 10. Mutacje w obr bie regionów genomowego DNA tworz cego gen koduj cy EGFR, z którymi wi primery i/lub sondy u ywane w te cie cobas® EGFR Test, chocia rzadkie, mog spowodowa niewykrycie obecno ci mutacji w eksonach 18., 19., 20., 21. (wyniki „No Mutation Detected”). si 11. Test cobas® EGFR wykazuje reaktywno krzy ow (wyniki „Mutation Detected”) z mutacj L747S w eksonie 19., rzadk mutacj nabyt , która mo e odpowiada za oporno na leczenie TKI11. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 29 CZ A: Do stosowania z próbkami tkanek ® cobas EGFR Mutation Test v2 12. Test cobas® EGFR zosta zatwierdzony do zastosowania w ka dym do ku reakcyjnym DNA w ilo ci 50 ng. Nie zaleca si stosowania pocz tkowych ilo ci DNA na poziomie ni szym ni 50 ng w ka dym do ku reakcyjnym. 13. Test cobas® EGFR jest testem jako ciowym. Test nie jest przeznaczony do ilo ciowych pomiarów odsetka mutacji. 14. Próbki NSCLC FFPET zawieraj ce zdegradowany DNA mog wp ywa na zdolno mutacji w genie EGFR. testu do wykrycia 15. Próbki z wynikami oznaczonymi jako „No Mutation Detected” mog zawiera mutacje w genie EGFR niewykrywane przez to oznaczenie. 16. Test cobas® EGFR wykrywa mutacje EGFR u pacjentów z przerzutami NSCLC, których guzy maj substytucje eksonu 18. (G719X), delecje eksonu 19., insercje i substytucje eksonu 20. (T790M, S768I) oraz substytucje eksonu 21. (L858R, L861Q), ale nie jakiekolwiek inne mutacje EGFR. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 30 CZ A: Do stosowania z próbkami tkanek ® cobas EGFR Mutation Test v2 Ocena skuteczno ci w badaniach nieklinicznych Uwaga: Poni sze opisy bada zawieraj dane zbiorcze przeprowadzone z wersjami v1 oraz v2 testu cobas® EGFR. W przypadku ni ej opisanych bada nieklinicznych, odsetek guza by oceniany przy zastosowaniu badania patologicznego. Do wybrania próbek do bada zastosowano dwukierunkowe sekwencjonowanie metod Sangera oraz sekwencjonowanie nowej generacji (NGS). Odsetek mutacji w próbce NSCLC FFPET okre lano metod NGS. Czu analityczna — granica próby lepej W celu oceny wydajno ci testu cobas® EGFR przy braku matrycy i zapewnienia, e próbka lepa nie generuje sygna u analitycznego, który mo e wskazywa na niskie st enie mutacji, oceniano próbki bez matrycy i próbki NSCLC FFPET EGFR typu dzikiego. Wykorzystuj c analiz zalecon w wytycznych EP17-A2E CLSI12, granic próby lepej okre lono jako zero dla wszystkich klas mutacji. Granica wykrywalno ci przy u yciu mieszanek próbek FFPET Trzy izolaty DNA próbki FFPET dla mutacji delecji eksonu 19., cztery izolaty DNA próbki FFPET dla mutacji L858R, dwa izolaty DNA próbki FFPET podwójnego mutanta dla mutacji L858R i T790M, dwa izolaty DNA próbki FFPET dla mutacji G719A, jeden izolat DNA próbki FFPET podwójnego mutanta dla mutacji T790M i G719A, jeden izolat DNA próbki FFPET podwójnego mutanta dla mutacji G719C i S768I, jeden izolat DNA próbki FFPET podwójnego mutanta dla mutacji S768I i G719S, trzy izolaty DNA próbki FFPET dla mutacji insercji eksonu 20. i trzy izolaty DNA próbki FFPET dla mutacji L861Q wymieszano z izolatami próbki FFPET EGFR typu dzikiego w celu uzyskania mieszanin z próbkami celuj cymi w poziom mutacji 10, 5,0, 2,5 oraz 1,25%, co okre lono metod sekwencjonowania nowej generacji (NGS), która jest zatwierdzona do stosowania w wykrywaniu mutacji EGFR w eksonach 18., 19., 20. i 21. Dla ka dej mieszaniny próbek przygotowano seryjne rozcie czenia i przetworzono osiem powtórze ka dego elementu panelu z wykorzystaniem ka dej z trzech serii zestawów cobas® EGFR Test (n=24/element panelu). Granic czu ci ka dej próbki okre lono na podstawie najmniejszej ilo ci DNA, która da a odsetek wyników „Mutation Detected”, dla mutacji docelowej genu koduj cego EGFR, wynosz cy co najmniej 95%; wyniki przedstawia Tabela 4. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 31 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek Tabela 4 cobas EGFR Mutation Test v2 ® Granica wykrywalno ci testu cobas EGFR przy u yciu mieszanek próbek FFPET Ekson genu koduj cego EGFR Sekwencja kwasu nukleinowego genu koduj cego EGFR Odsetek mutacji w elemencie panelu konieczny do uzyskania odsetka 95% wyników „Mutation Detected” przy pocz tkowym poziomie DNA w ilo ci 50 ng w ka dym do ku reakcyjnym (n = 24 powtórzenia) Identyfikator 6 COSMIC 2155 G>T 2155 G>A 2156 G>C 2156 G>C 2235_2249del15 2236_2250del15 2238_2252del15 2239_2248>C 2240_2254del15 2240_2257del18 2237_2253>TTGCT* 2237_2255>T* 2239_2256del18* 2238_2252del15* 2239_2257>GT* 2369 C>T 2369 C>T 2369 C>T 2303 G>T 2303 G>T 2307_2308insGCCAGCGTG 2310_2311insGGT 2319_2320insCAC 2573 T>G 2573 T>G 2573 T>G 2573 T>G 2573 T>G 2582T>A 2582T>A 2582T>A 5,6 3,2 4,7 2,5 1,4 2,5 # 2,4 2,2 7,2 13,4** 6,32 4,08 4,74 # 5,45 6,02 2,4 3,0 2,0 2,4 1,3 6,8 1,3 2,1 4,0 4,2 4,3 4,3 5,3 2,1 2,2 3,4 6253 6252 6239 6239 6223 6225 23571 12382 12369 12370 12416 12384 6255 23571 Nie stwierdzono 6240 6240 6240 6241 6241 12376 12378 12377 6224 6224 6224 6224 6224 6213 6213 6213 Grupa mutacji EGFR 18 G719X 19 Delecja w eksonie 19. T790M 20 S768I Insercja w eksonie 20. L858R + P 21 L861Q * Dla tych niedominuj cych delecji w eksonie 19. wyst puj cych w kohorcie badania EURTAC przebadano jedynie pojedynczy poziom sekwencji docelowych zawieraj cych oko o 5% mutacji. Mieszaniny próbek DNA zosta y przebadane w 3 o rodkach bior cych udzia w badaniu. ® ** Granica wykrywalno ci testu cobas EGFR dla tej mutacji jest wi ksza ni 10% poziom mutacji z zastosowaniem standardowej pocz tkowej ilo ci 50 ng w ka dym do ku reakcyjnym. # Przebadano dwie niezale ne próbki dla delecji w eksonie 19. (2238_2252del15). + Przebadano pi niezale nych próbek dla mutacji L858R. Wyniki tego badania wskazuj , e test cobas® EGFR umo liwia wykrywanie mutacji w eksonach 18., 19., 20. i 21. genu koduj cego EGFR przy poziomie mutacji o warto ci co najmniej 5% z zastosowaniem standardowej pocz tkowej ilo ci 50 ng w ka dym do ku reakcyjnym. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 32 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek Minimalna zawarto cobas EGFR Mutation Test v2 tkanki guza Przebadano cznie 66 niezale nych próbek z mutacjami genu EGFR (tj. 35 próbek mutantów delecji w eksonie 19. i 31 próbek mutantów L858R w eksonie 21.) o zawarto ci tkanki guza mieszcz cej si w przedziale 25–99% w celu okre lenia minimalnej zawarto ci tkanki guza wymaganej do wykrycia mutacji w genie EGFR w próbkach NSCLC. W adnej z przebadanych próbek nie stwierdzono jednoczesnego wyst powania delecji w eksonie 19. i mutacji L858R w eksonie 21. Ka próbk przebadano bez wykonania przeci cia makroskopowego (w stanie niezmienionym) oraz po przeci ciu makroskopowym. Obserwowane warto ci CtR dla próbek niezmienionych i poddanych przeci ciu makroskopowemu przeanalizowano z u yciem regresji Deminga oraz wykresu Blanda-Altmana (ró nice w funkcji warto ci redniej). Wyniki potwierdzaj zasadno stosowania próbek z zawarto ci tkanki guza przekraczaj 25% bez przeci cia makroskopowego. Dodatkowe 10 próbek NSCLC EGFR typu dzikiego (zawarto tkanki guza 1–90%) i 10 próbek mutantów EGFR (zawarto tkanki guza 8–95%) testowano w celu okre lenia, czy makroskopowe przeci cie próbki tkanki o niskiej zawarto ci guza NSCLC poprawia wykrywalno testu cobas® EGFR. Ka próbk przebadano bez wykonania przeci cia makroskopowego (w stanie niezmienionym) oraz po przeci ciu makroskopowym. Wszystkie wyniki po makroskopowym rozci ciu by y zgodne z wynikami bez makroskopowego rozci cia i oczekiwane wyniki mutacji oraz typu dzikiego obserwowano dla wszystkich 20 próbek. W badaniu fazy III EURTAC dotycz cym stosowania erlotynibu w porównaniu z chemioterapi opart na cisplatynie próbki NSCLC FFPET z zawarto ci tkanki guza poni ej 10% zosta y przeci te makroskopowo przed analiz mutacji w genie EGFR. Podgrupa próbek przebadanych przesiewowo w badaniu EURTAC zosta a oceniona pod k tem statusu mutacji w genie EGFR z u yciem testu cobas® EGFR oraz sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Tabela 5 i Tabela 6 zawieraj próbki NSCLC z wa nymi sparowanymi wynikami mutacji eksonu 19. lub L858R EGFR po czonymi dla testu cobas® EGFR oraz sekwencjonowania NGS. Podczas korzystania z sekwencjonowania NGS jako metody referencyjnej wyniki wykaza y, e w przypadku próbek NSCLC FFPET po przeci ciu makroskopowym z zawarto ci tkanek guza poni ej 10% uzyskano porównywaln dok adno analityczn jak w przypadku próbek NSCLC FFPET nieprzeci tych makroskopowo. Razem te badania potwierdzaj , e przed przeprowadzeniem testu cobas® EGFR wymagane jest przeci cie makroskopowe w przypadku próbek NSCLC FFPET o zawarto ci tkanki guza poni ej 10%. Tabela 5 ® Skuteczno testu cobas EGFR w przypadku próbek NSCLC FFPET z zawarto ci tkanki guza 10% (przeci tych makroskopowo) Miara zgodno ci Procent zgodno ci (N) 95% CI Zgodno procentowa wyników dodatnich (PPA) 97,2% (35/36) 85,8–99,5% Zgodno procentowa wyników ujemnych (NPA) 94,5% (52/55) 85,1–98,1% 95,6% (87/91) 89,2–98,3% Procentowa zgodno Tabela 6 ogó em (OPA) ® Skuteczno testu cobas EGFR w przypadku próbek NSCLC FFPET z zawarto ci tkanki guza >10% (nieprzeci tych makroskopowo) Miara zgodno ci Procent zgodno ci (N) 95% CI Zgodno procentowa wyników dodatnich (PPA) 93,0% (107/115) 86,9%, 96,4% Zgodno procentowa wyników ujemnych (NPA) 98,5% (199/202) 95,7%, 99,5% 96,5% (306/317) 93,9%, 98,1% Procentowa zgodno 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 ogó em (OPA) 33 CZ A: Do stosowania z próbkami tkanek Swoisto ® cobas EGFR Mutation Test v2 — mikroorganizmy i homologi EGFR Swoisto testu cobas® EGFR by a oceniana przez badanie mikroorganizmów zwi zanych z p ucami oraz plazmidów homologów EGFR tj. plazmidów zawieraj cych sekwencje dla ka dego obszaru genetycznego HER2, HER3 i HER4 analogiczne do sekwencji eksonów 18., 19., 20. i 21. EGFR amplifikowanych za pomoc testu cobas® EGFR. Mikroorganizmy zwi zane z p ucami Stwierdzono, e jednostki tworz ce kolonie Streptococcus pneumoniae i Haemophilus influenzae w ilo ci 4 x 105 CFU nie wykazuj reaktywno ci krzy owej ani nie zak ócaj dzia ania testu cobas® EGFR po dodaniu podczas etapu lizy tkanki do próbek zawieraj cych naturalnie wyst puj ce oraz zmutowane sekwencje genu koduj cego EGFR. Plazmidy homologów EGFR Wykazano, e powi zane strukturalnie sekwencje analogów bia ka receptora naskórkowego o aktywno ci kinazy tyrozynowej (EGFR/HER1, HER2, HER3 i HER4) nie reaguj krzy owo w te cie cobas® EGFR w przypadku dodania przed procedur amplifikacji/detekcji do roztworu podstawowego wyizolowanego DNA sekwencji potencjalnie reaguj cej krzy owo w liczbie kopii genomowych równowa nej 50 ng na reakcj PCR. Uwzgl dniono warunki kontrolne bez dodatku DNA plazmidowego. Wyniki wykaza y, e obserwowane mutacje dla wszystkich 20 przebadanych próbek FFPET by y zgodne z oczekiwanymi mutacjami okre lonymi w drodze sekwencjonowania zarówno w obecno ci, jak i przy braku dodanego DNA plazmidowego genu HER. Dodatkowo pod k tem reaktywno ci krzy owej przebadano mutacj L747S w eksonie 19. genu EGFR. Wyniki wykaza y, e test cobas® EGFR reaguje krzy owo z mutacj L747S w eksonie 19. genu EGFR. Substancje wp ywaj ce na wynik testu Wykazano, e triglicerydy (37 mM, granica podwy szonego st enia zalecana przez CLSI13) i hemoglobina (2 mg/ml, granica podwy szonego st enia zalecana przez CLSI13) nie zak ócaj dzia ania testu cobas® EGFR w przypadku dodania potencjalnej substancji zak ócaj cej podczas procedury przygotowania próbki na etapie lizy. Wykazano, e leki albuterol (Ventolin), ipratropium (Atrovent), flutykazon (Flonase), ceftazydym (Fortaz), Imipenem-cylastyna (Primaxin), Piperacillin-tazobaktam, Cilastin (cylastatyna sodu), Betadine oraz lidokaina nie zak ócaj dzia ania testu cobas® EGFR w przypadku dodania podczas procedury przygotowania próbki na etapie lizy. Tkanka martwicza Wykazano, e próbki FFPET NSCLC z zawarto ci tkanki martwiczej do 60% w przypadku próbek mutanta EGFR oraz do 85% w przypadku próbek typu dzikiego nie zak ócaj rozpozna wyników przy u yciu testu cobas® EGFR. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 34 CZ A: Do stosowania z próbkami tkanek ® cobas EGFR Mutation Test v2 Powtarzalno Powtarzalno testu cobas® EGFR oceniano przy u yciu sze ciu próbek FFPET obejmuj cych: dwie próbki EGFR typu dzikiego; cztery próbki mutantów EGFR, po jednej delecji w eksonie 19., S768I i G719X, T790M i L858R oraz insercji w eksonie 20. Próbki te bada o dwukrotnie dwóch operatorów, u ywaj c dwóch ró nych serii odczynników i dwóch analizatorów cobas z 480 w ci gu czterech dni. cznie oceniano 32 powtórzenia na próbk . Odsetek prawid owych rozpozna testu cobas® EGFR wyniós 96,9% (186/192). Powtarzalno testu cobas® EGFR oceniano tak e w drugim badaniu wykorzystuj cym cztery próbki FFPET obejmuj ce: jedn próbk EGFR typu dzikiego; trzy próbki mutantów FFPET EGFR po jednej spo ród nast puj cych mutacji: L861Q, G719X i insercja w eksonie 20. Próbki bada o dwukrotnie dwóch operatorów, ywaj c dwóch ró nych serii odczynników i dwóch analizatorów cobas z 480 w ci gu wielu dni. Test cobas® EGFR mia dok adno prawid owych rozpozna 99,2% (127/128) dla wszystkich po czonych powtórze próbek, operatorów, serii odczynników i instrumentów. Odtwarzalno przygotowywania próbek Odtwarzalno dzia ania zestawu do przygotowywania próbek cobas® DNA Sample Preparation Kit przebadano z u yciem skrawków uzyskanych z trzech bloków z próbkami FFPET — jednego zawieraj cego delecj w eksonie 19., jednego z mutacj L858R oraz jednego z sekwencj wyst puj naturalnie. Ka próbk badano w dwóch powtórzeniach w ka dym o rodku ka dego dnia. Skrawki danej próbki zosta y poddane randomizacji i przebadane w ci gu sze ciu dni w trzech o rodkach przez jednego operatora w ka dym o rodku, z u yciem jednego analizatora cobas z 480 w ka dym o rodku, trzech serii zestawu cobas® DNA Sample Preparation Kit oraz jednej serii testu cobas® EGFR. Ka dego dnia ka dy operator prowadzi izolacj i analiz DNA pochodz cego z dwóch skrawków NSCLC FFPET w przypadku ka dej próbki z u yciem testu cobas® EGFR. W ci gu sze ciu dni prowadzenia testów dla wszystkich próbek uzyskano wa ne i prawid owe wyniki. Dla po aczonych wszystkich próbek i operatorów odsetek prawid owych rozpozna testu cobas® EGFR wyniós 100% (108/108). 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 35 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 Ocena klinicznej skuteczno ci testu Badanie odtwarzalno ci klinicznej Przeprowadzono badanie zewn trzne w celu oceny odtwarzalno ci testu cobas® EGFR z udzia em 3 zewn trznych o rodków badawczych (2 operatorów na o rodek) i u yciem 3 serii odczynników przez 5 niekolejnych dni badania z 13-elementowym panelem próbek DNA uzyskanych ze skrawków FFPET próbek NSCLC z naturalnie wyst puj sekwencj (ang. wild type, WT) oraz obarczonych mutacj (ang. mutant type, MT). Ten panel obejmowa mutacj L858R w eksonie 21. oraz pi ró nych mutacji w eksonie 19. W postaci delecji. Na 92 cykle pracy 90 (97,8%) by o prawid owych. Ogó em dla ka dego z 13 cz onów panelu w 90 wa nych cyklach pracy wykonano 2340 testów; wszystkie wyniki testu by y wa ne. Stwierdzono wyniki „No Mutation Detected” w 180 wa nych testach dla elementów panelu WT, co skutkowa o 100% zgodno ci . W przypadku 10 spo ród 12 elementów panelu MT uzyskano zgodno rz du 100%. Dla elementu panelu EX19_2240_2257del18 — 5% mutacji, zgodno wynios a 62,8% (67 ze 180 wyników testu stanowi y wyniki „Mutation Not Detected”). Dla elementu panelu EX19_2240_2257del18 — 10% mutacji, zgodno wynios a 99,4% (1 ze 180 wyników testu by wynikiem „Mutation Not Detected”). Wyniki wed ug ogólnej zgodno ci przedstawia Tabela 7. Wspó czynnik zmienno ci (CV) wyniós <6% w przypadku wszystkich elementów panelu mutacji. W przypadku ka dego elementu panelu warto CV wynios a <3,5%. Dla kontroli zewn trznej ogólna warto CV wynios a <1,3%. Warto procentowa CV wynios a <0,5% mi dzy seriami i <1,2% w ramach serii. Tabela 7 ® Ogólne oszacowania zgodno ci wed ug elementów panelu w badaniu odtwarzalno ci testu cobas EGFR Cz on panelu Naturalnie wyst puj ca Liczba wa nych testów Zgodno (n) % zgodno ci a (95% CI) P 180 180 100 (98,0; 100,0) EX19_ 2235_2249del15 — 5% mutacji 180 180 100 (98,0; 100,0) EX19_ 2235_2249del15 — <10% mutacji 180 180 100 (98,0; 100,0) EX19_2236_2250del15 — 5% mutacji 180 180 100 (98,0; 100,0) EX19_2236_2250del15 — <10% mutacji 180 180 100 (98,0; 100,0) EX19_2239_2248>C — 5% mutacji 180 180 100 (98,0; 100,0) EX19_2239_2248>C — <10% mutacji 180 180 100 (98,0; 100,0) EX19_2240_2254del15 — 5% mutacji 180 180 100 (98,0; 100,0) EX19_2240_2254del15 — <10% mutacji 180 180 100 (98,0; 100,0) EX19_2240_2257del18 — 5% mutacji 180 113 62,8 (55,3; 69,9)* EX19_2240_2257del18 — <10% mutacji 180 179 99,4 (96,9; 100,0)* EX21_ 2573T>G=L858R — 5% mutacji 180 180 100 (98,0; 100,0) EX21_ 2573T>G=L858R — <10% mutacji 180 180 100 (98,0; 100,0) Uwaga: Wyniki uznawano za zgodne, gdy dla elementu panelu mutacji uzyskano wa ny wynik „Mutation Detected” lub gdy dla elementu panelu sekwencji wyst puj cych naturalnie uzyskano wa ny wynik „Mutation Not Detected”. a 95% CI = 95% przedzia ufno ci na podstawie dok adnej metody dwumianowej. ® * Czu analityczna testu cobas EGFR w przypadku detekcji tej mutacji jest wi ksza ni 10% z zastosowaniem standardowej pocz tkowej ilo ci 50 ng w ka dym do ku reakcyjnym. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 36 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 Korelacja z metod referencyjn wykorzystuj próbki fazy III z badania EURTAC Skuteczno kliniczna testu cobas® EGFR by a oceniana przez porównanie go z dwoma metodami referencyjnymi — 2x dwukierunkowym sekwencjonowaniem metod Sangera oraz ilo ciowym sekwencjonowaniem nowej generacji (NGS) — wykorzystuj c 487 utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie próbek guza p uca od pacjentów z zaawansowanym NSCLC, których badano przesiewowo w fazie 3. badania EURTAC erlotynibu w porównaniu z chemioterapi opart na cisplatynie14,15. Charakterystyka kliniczna i demograficzna pacjentów, których próbki by y dost pne do tego badania retrospektywnego by y porównywalne z kwalifikuj cymi si w innym przypadku pacjentami (557), których próbki nie by y dost pne do ponownego badania. W ramach badania EURTAC badaniu przesiewowemu z u yciem skojarzenia testów opracowanych laboratoryjnie, okre lanych wspólnie mianem oznaczenia badania klinicznego (ang. clinical trial assay, CTA) poddano cznie 1276 pacjentów. Po wykluczeniu pacjentów niespe niaj cych kryteriów badania oraz bez wyników oznaczenia CTA do badania potencjalnie kwalifikowa o si 1044 pacjentów. W grupie 1044 pacjentów kwalifikuj cych si do badania próbki 225 z nich uzyska y dodatni wynik dla mutacji w oznaczeniu CTA, próbki 792 pacjentów da y wynik naturalnie wyst puj cej sekwencji w badaniu CTA, a 27 próbek mia o niejednoznaczny wynik w badaniu CTA. W przypadku 487 spo ród 1044 pacjentów potencjalnie kwalifikuj cych si do badania dost pne by y próbki do przeprowadzenia ponownego badania z u yciem testu cobas® EGFR. Wszystkie 487 próbek przebadano metod lepej próby z u yciem testu cobas® EGFR oraz sekwencjonowania metod Sangera. Spo ród nich w przypadku 406 próbek uzyskano wa ne wyniki w te cie cobas® EGFR i sekwencjonowaniu metod Sangera, 38 próbek da o wynik niewa ny w te cie cobas® EGFR i sekwencjonowaniu metod Sangera, a w przypadku 38 i 5 próbek uzyskano niewa ne wyniki odpowiednio tylko w sekwencjonowaniu metod Sangera oraz tylko w te cie cobas® EGFR. Spo ród 487 próbek dost pnych do ponownego badania z u yciem testu cobas® EGFR, 444 próbki da y wa ny wynik w te cie cobas® EGFR i zosta y równie przebadane z u yciem sekwencjonowania NGS. Spo ród nich uzyskano 36 niewa nych wyników w drodze sekwencjonowania NGS; z tego powodu 408 próbek uzyska o wa ne wyniki w te cie cobas® EGFR i sekwencjonowaniu NGS. Dok adno analityczna testu cobas® EGFR w porównaniu z ka metod referencyjn zosta a oceniona poprzez oszacowanie odsetka zgodno ci wyników dodatnich (ang. positive percentage agreement, PPA), odsetka zgodno ci wyników ujemnych (ang. negative percentage agreement, NPA) oraz procentowej zgodno ci ogó em (ang. overall percentage agreement, OPA), a tak e odpowiednich 95% przedzia ów ufno ci dla mutacji w postaci delecji w eksonie 19. i L858R cznie. W kohorcie badania EURTAC test cobas® EGFR umo liwi wykrycie nast puj cych mutacji w eksonie 19. genu EGFR (Tabela 8). Tabela 8 ® Mutacje wykrywane w kohorcie EURTAC w te cie cobas EGFR Ekson 19 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 6 Mutacja Zmiana aminokwasu COSMIC ID 2234_2251>AAT K745_T751>K Nie stwierdzono 2236_2244del9 E746_R748>E Nie stwierdzono 2236_2252>AT E746_T751>I 26680 2236_2263>GAAGCAT E746_A755>E Nie stwierdzono 2237_2251>AAC E746_751T>E Nie stwierdzono 2239_2253>CAA L747_T751>Q 51527 2237_2257>TCT E746_P753>VS 18427 2239_2251>C L747_T751>P 12383 P 37 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 W analizie zgodno ci uwzgl dniono cznie 406 próbek z wa nymi wynikami testu cobas® EGFR i sekwencjonowania metod Sangera. PPA mi dzy testem cobas® EGFR i sekwencjonowaniem metod Sangera wynosi a 96,6% (95% CI: od 91,5% do 98,7%), a NPA wynosi a 88,3% (95% CI: od 84,1% do 91,5%) podczas detekcji delecji w eksonie 19. i mutacji L858R cznie tak jak to przedstawia Tabela 9. Warto OPA wynios a 90,6% z doln granic 95% przedzia u ufno ci przekraczaj 87%. Tabela 9 ® Porównanie testu cobas EGFR z sekwencjonowaniem metod Sangera w celu wykrywania mutacji delecji w eksonie 19. oraz L858R EGFR Miara zgodno ci Procent zgodno ci (N) 95% CI Zgodno procentowa wyników dodatnich (PPA) 96,6% (112/116) 91,5%, 98,7% Zgodno procentowa wyników ujemnych (NPA) 88,3% (256/290) 84,1%, 91,5% 90,6% (368/406) 87,4%, 93,1% Procentowa zgodno ogó em (OPA) W analizie zgodno ci uwzgl dniono cznie 408 próbek z wa nymi wynikami testu cobas® EGFR i sekwencjonowania metod NGS. Po porównaniu pomi dzy cznymi wynikami testu cobas® EGFR i sekwencjonowania NGS w przypadku detekcji delecji w eksonie 19. i mutacji punktowej L858R warto ci PPA oraz NPA wynios y odpowiednio 94,0% (95% CI: od 89,1% do 96,8%) i 97,7% (95% CI: od 95,0% do 98,9%) jak przedstawia to Tabela 10. Warto OPA wynios a 96,3% z doln granic 95% przedzia u ufno ci wynosz 94,0%. ® Tabela 10 Porównanie testu cobas EGFR z sekwencjonowaniem metod NGS w celu wykrywania mutacji delecji w eksonie 19. oraz L858R EGFR cznie Miara zgodno ci Procent zgodno ci (N) 95% CI Zgodno procentowa wyników dodatnich (PPA) 94,0% (142/151) 89,1%, 96,8% Zgodno procentowa wyników ujemnych (NPA) 97,7% (251/257) 95,0%, 98,9% 96,3% (393/408) 94,0%, 97,8% Procentowa zgodno ogó em (OPA) Dane dotycz ce wyniku klinicznego EURTAC Badanie EURTAC to wieloo rodkowe, randomizowane badanie III fazy, prowadzone metod otwartej próby w celu porównania stosowania produktu leczniczego Tarceva® (erlotynib) ze standardow chemioterapi dwulekow zwi zkami platyny jako leczenia pierwszego rzutu u pacjentów z zaawansowanym NSCLC, u których nie stosowano chemioterapii i którzy s obarczeni mutacjami w postaci delecji w eksonie 19. lub substytucji w eksonie 21. (L858R) genu EGFR ocenionych z u yciem oznaczenia badania klinicznego (CTA). Badanie by o sponsorowane przez hiszpa ski zespó bada nad rakiem p uca (Spanish Lung Cancer Group, SLCG). Do udzia u w badaniu zakwalifikowano cznie 174 pacjentów. Wyniki badania wykaza y, e w przypadku pacjentów otrzymuj cych produkt leczniczy Tarceva® stwierdzono statystycznie istotn ró nic w d ugo ci okresu prze ycia bez progresji choroby (PFS) (mediana warto ci PFS 10,4 miesi ca w por. z 5,1 miesi ca) w porównaniu z pacjentami leczonymi chemioterapi ze wspó czynnikiem ryzyka wynosz cym 0,34 (p <0,0001, 95% CI [0,23; 0,49]). Odsetek odpowiedzi na leczenie w przypadku grupy pacjentów otrzymuj cych produkt leczniczy Tarceva® by wy szy ni u pacjentów leczonych z u yciem chemioterapii (odpowiednio 65,1% i 16,1%). Nie zaobserwowano istotnej ró nicy w ca kowitym czasie prze ycia (ang. overall survival, OS) w obu grupach, gdy 76% pacjentów otrzymuj cych standardow chemioterapi przeniesiono do grupy leczonej z u yciem produktu leczniczego Tarceva®. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 38 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 Spo ród 174 pacjentów w czonych do udzia u w badaniu EURTAC 134 przypadki (77% populacji badanej, w tym 69 pacjentów z grupy otrzymuj cej erlotynib oraz 65 pacjentów z grupy leczonej z u yciem chemioterapii) by y dost pne do ponownego badania i zosta y przebadane retrospektywnie z u yciem testu cobas® EGFR. Spo ród 134 przypadków przebadanych ponownie z u yciem testu cobas® EGFR dla 116 pacjentów (59 pacjentów z grupy otrzymuj cej erlotynib oraz 57 pacjentów z grupy leczonej z u yciem chemioterapii) uzyskano wynik „Mutation Detected” w te cie cobas® EGFR. Analiza podgrupy 116 pacjentów wykaza a, e osoby leczone z u yciem produktu leczniczego Tarceva® cechowa o istotne wyd enie czasu PFS (mediana warto ci PFS 10,4 miesi ca w porównaniu z 5,4 miesi ca) i mniejsze prawdopodobie stwo wyst pienia zdarzenia progresji choroby lub zgonu (Wspó czynnik ryzyka = 0,34; 95% CI [0,21; 0,54], p <0,0001) ni w przypadku pacjentów leczonych z u yciem chemioterapii (Ryc. 3). Cz sto odpowiedzi na leczenie w grupie leczonej produktem leczniczym Tarceva® by a wi ksza w porównaniu z grup otrzymuj chemioterapi (odpowiednio 59,3% i 14,0%). Nie zaobserwowano istotnej ró nicy w warto ci OS pomi dzy dwiema grupami. Obserwowana korzy kliniczna w podgrupie pacjentów przebadanych z u yciem testu cobas® EGFR by a porównywalna ze stwierdzon w ca ej populacji badania (Tabela 11). Przeprowadzono dodatkow analiz skuteczno ci w celu uwzgl dnienia pacjentów, dla których uzyskano dodatni wynik w te cie cobas® EGFR i ujemny lub niewa ny wynik w oznaczeniu CTA. Dane uzyskane w najgorszym scenariuszu (przy za eniu wspó czynnika ryzyka wynosz cego 1 dla pacjentów z dodatnim wynikiem w te cie cobas® EGFR i ujemnym wynikiem oznaczenia CTA) wykaza y wspó czynnik ryzyka wynosz cy 0,42 (95% CI [0,26; 0,57]). Wykres Kaplana-Meiera dla warto ci PFS wed ug metody leczenia w przypadku pacjentów z mutacj wykryt ® w te cie cobas EGFR Test (ocena badacza) Prawdopodobie stwo prze ycia Ryc. 3 Wspó czynnik ryzyka: 0,34 P <0,0001 Erlotynib (n = 59) Mediana: 10,4 miesi ca Chemioterapia (n = 57) Mediana: 5,4 miesi ca Miesi ce od zako czenia leczenia 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 39 CZ ® A: Do stosowania z próbkami tkanek cobas EGFR Mutation Test v2 ® Tabela 11 Korzy ci kliniczne w przypadku pacjentów przebadanych z u yciem testu cobas EGFR s porównywalne z obserwowanymi w populacji badania EURTAC Populacja dodatnia w te cie cobas Parametr ® EURTAC n = 116 n = 173* Chemioterapia Erlotynib Chemioterapia Erlotynib n = 57 n = 59 n = 87 n = 86 5,4 10,4 5,1 10,4 PFS Mediana (miesi ce) Wspó czynnik ryzyka 95% przedzia ufno ci wspó czynnika hazardu Warto P (test log rank) 0,34 0,34 [0,21; 0,54] [0,23; 0,49] <0,0001 <0,0001 *Uwaga: Jeden pacjent wycofa zgod po zako czeniu badania EURTAC, co skutkowa o zestawem danych o wielko ci n = 173. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 40 CZ CZ B: Do stosowania z próbkami osocza ® cobas EGFR Mutation Test v2 B: DO STOSOWANIA Z PRÓBKAMI OSOCZA Przygotowanie próbek Próbki osocza s przetwarzane w celu izolowania kr cego bezkomórkowego DNA (ang. cell-free DNA, cfDNA) przy u yciu zestawu cobas® cfDNA Sample Preparation Kit, ogólnego manualnego przygotowywania próbek opartego na wi zaniu kwasu nukleinowego do w ókien szklanych. Dwa mililitry (ml) osocza s przetwarzane za pomoc proteazy i chaotropowego buforu wi cego, który chroni cfDNA przed DNazami. W dalszej kolejno ci do mieszaniny, w której dokonano wi zania, dodaje si izopropanol, po czym mieszanin wiruje si i przepuszcza przez kolumn z wk adem filtruj cym, zawieraj cym w ókna szklane. W trakcie wirowania cfDNA ulega zwi zaniu na powierzchni w ókien szklanych filtra. Substancje niezwi zane, takie jak sole, bia ka i inne zanieczyszczenia, zostaj usuni te w wyniku wirowania. Zaadsorbowane kwasy nukleinowe przemywane i poddane elucji roztworem wodnym. Nast pnie docelowy DNA amplifikuje si i poddaje detekcji w analizatorze cobas z 480 z u yciem odczynników do amplifikacji i detekcji, dostarczanych wraz z zestawem cobas® EGFR Mutation Test v2. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 41 CZ ® B: Do stosowania z próbkami osocza cobas EGFR Mutation Test v2 Materia y i odczynniki Dostarczane materia y i odczynniki Zestaw/kasety Elementy i sk adniki odczynników PK (Proteinaza K) (P/N: 05860695102) Proteinaza K, liofilizowana DNA PBB b (DNA Bufor wi cy parafin ) (P/N: 05517621001) Bufor Tris-HCl 49,6% chlorowodorku guanidyny 0,05% mocznika 17,3% Triton X-100 WB I (DNA Bufor p ucz cy I) (P/N: 05517656001) Bufor Tris-HCl ® cobas cfDNA Sample 64% chlorowodorku guanidyny WB II Preparation Kit (DNA Bufor p ucz cy II) 24 testy (P/N: 05517664001) (P/N: 07247737190) Bufor Tris-HCl Chlorek sodu DNA EB (DNA bufor do elucji) (P/N: 05517630001) Bufor Tris-HCl 0,09% azydku sodu HPEA FT (Modu jednostki przed aj cej o wysokiej czysto ci) (P/N: 07323204102) Probówki z filtrem i z zatyczkami CT (Probówki zbiorcze) (P/N: 05880513001) 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 Ilo na test a Symbol bezpiecze stwa i ostrze enie 2 x 100 mg 8 x 10 ml 1 x 25 ml 1 x 12,5 ml 1 x 6 ml 5 x 5 sztuk Niebezpiecze stwo H302 + H332: Dzia a szkodliwie po po kni ciu i w nast pstwie wdychania. H315: Dzia a dra ni co na skór . H317: Mo e powodowa reakcj alergiczn skóry. H318: Powoduje powa ne uszkodzenie oczu. H334: Mo e powodowa objawy alergii lub astmy lub trudno ci w oddychaniu w nast pstwie wdychania. H335: Mo e powodowa podra nienie dróg oddechowych. P261: Unika wdychania py u/dymu/gazu/mg y/ par/rozpylonej cieczy. P280: Stosowa r kawice ochronne/ ochron oczu/ochron twarzy. P284: Stosowa indywidualne rodki ochrony dróg oddechowych. P305 + P351 + P338 + P310: W PRZYPADKU DOSTANIA SI DO OCZU: Ostro nie p uka wod przez kilka minut. Wyj soczewki kontaktowe, je eli s i mo na je atwo usun . Nadal p uka . Natychmiast skontaktowa si z O RODKIEM ZATRU lub lekarzem. P342 + P311: W przypadku wyst pienia objawów ze strony uk adu oddechowego: Skontaktowa si z O RODKIEM ZATRU lub lekarzem. P362 + P364: Zanieczyszczon odzie zdj i wypra przed ponownym u yciem. 3 x 25 sztuk 42 CZ ® B: Do stosowania z próbkami osocza Zestaw/kasety ® Zestaw cobas EGFR Mutation Test v2 24 testy (P/N: 07248563190) 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 Elementy i sk adniki odczynników cobas EGFR Mutation Test v2 Ilo na test EGFR MMX-1 (EGFR Master Mix 1) (P/N: 06471366001) Bufor Tris Chlorek potasu Glicerol EDTA Tween 20 3,13% dimetylosulfotlenku 0,09% azydku sodu 2 x 0,48 ml < 0,10% dNTP < 0,01% polimerazy DNA Z05-AS1 (bakteryjnej) < 0,01% enzymu AmpErase (uracyloN-glikozylazy) (bakteryjnej) < 0,01% aptameru < 0,01% primerów sensownych i antysensownych EGFR < 0,01% sond EGFR znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym EGFR MMX-2 (EGFR Master Mix 2) (P/N: 06471382001) Bufor Tris Chlorek potasu Glicerol EDTA Tween 20 3,13% dimetylosulfotlenku 0,09% azydku sodu 2 x 0,48 ml < 0,10% dNTP < 0,01% polimerazy DNA Z05-AS1 (bakteryjnej) < 0,01% enzymu AmpErase (uracyloN-glikozylazy) (bakteryjnej) < 0,01% aptameru < 0,01% primerów sensownych i antysensownych EGFR < 0,01% sond EGFR znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym EGFR MMX-3 v2 (EGFR Master Mix 3) (P/N: 07248601001) Bufor Tris Chlorek potasu Glicerol EDTA Tween 20 3,13% dimetylosulfotlenku 0,09% azydku sodu 2 x 0,48 ml < 0,10% dNTP < 0,01% polimerazy DNA Z05-AS1 (bakteryjnej) < 0,01% enzymu AmpErase (uracyloN-glikozylazy) (bakteryjnej) < 0,01% aptameru < 0,01% primerów sensownych i antysensownych EGFR < 0,01% sond EGFR znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym a Symbol bezpiecze stwa i ostrze enie Nie dotyczy Nie dotyczy Nie dotyczy 43 CZ ® B: Do stosowania z próbkami osocza Zestaw/kasety Elementy i sk adniki odczynników cobas EGFR Mutation Test v2 Ilo na test a Symbol bezpiecze stwa i ostrze enie Nie dotyczy MGAC (Octan magnezu) (P/N: 05854326001) Octan magnezu 0,09% azydku sodu 6 x 0,2 ml Nie dotyczy EGFR MC (EGFR Kontrola mutacji) ® Zestaw cobas EGFR Mutation Test v2 24 testy (P/N: 07248563190) (P/N: 06471455001) Bufor Tris EDTA Poli-rA RNA (syntetyczny) 0,05% azydku sodu < 0,1% plazmidowego DNA (bakteryjnego) zawieraj cego sekwencje eksonów: 18., 19., 20. i 21. genu koduj cego EGFR < 0,1% naturalnie wyst puj cego DNA genu koduj cego EGFR (z hodowli komórkowej) 6 x 0,1 ml Nie dotyczy DNA SD (DNA Rozcie czalnik próbki) (P/N: 05854474001) Bufor Tris-HCl 0,09% azydku sodu 2 x 3,5 ml a Oznakowanie bezpiecze stwa produktu jest zasadniczo zgodne z wytycznymi GHS UE. b Bufor wi cy parafin jest stosowany do próbek osocza. Przechowywanie i u ytkowanie odczynników Temperatura przechowywania Odczynnik ® od 15°C do 30°C ® od 2°C do 8°C cobas cfDNA Sample Preparation Kit cobas EGFR Mutation Test v2* Uwaga: Nie wolno zamra Czas przechowywania Po otwarciu i rozpuszczeniu odczynnik PK jest stabilny przez maksymalnie 30 dni lub do up ywu daty wa no ci, w zale no ci od tego, co nast pi wcze niej. Po otwarciu i rozpuszczeniu pozosta e odczynniki zestawu cfDNA Sample Preparation Kit s stabilne przez maksymalnie 90 dni lub do up ywu daty wa no ci, w zale no ci od tego, co nast pi wcze niej. Po otwarciu odczynnika, zestaw zachowuje stabilno do 4-krotnego u ycia w ci gu 90 dni lub do podanej daty wa no ci, w zale no ci od tego, który termin wypada wcze niej. odczynników z wyj tkiem odczynnika PK. *Odczynniki EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2 oraz roboczy odczynnik MMX (przygotowany przez dodanie odczynnika MGAC do EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 v2) nale y chroni przed d ugotrwa ekspozycj na wiat o. Roboczy odczynnik MMX trzeba przechowywa w zaciemnionym miejscu w temperaturze od 2°C do 8°C. Przygotowane próbki i kontrole nale y doda do roboczego odczynnika MMX w ci gu 1 godziny od jego przygotowania. Amplifikacj nale y rozpocz w ci gu 1 godziny od chwili dodania przygotowanych próbek badanych i kontrolnych do roboczego odczynnika MMX. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 44 CZ ® B: Do stosowania z próbkami osocza cobas EGFR Mutation Test v2 Wymagane materia y dodatkowe Materia y P/N Etanol bezwodny (200 proof, do biologii molekularnej) Sigma, nr kat. E7023 lub Fisher Scientific, nr kat. BP2818-500 albo odpowiednik Izopropanol (ACS, >99,5%) Sigma, nr kat. 190764 lub Fisher Scientific, nr kat. A451-1 albo odpowiednik Ja owa woda wolna od nukleazy (do biologii molekularnej) Applied Biosystems (Ambion) AM9937 lub GE Healthcare TM Hyclone SH3053801 albo odpowiednik Wybielacz Dowolny dostawca 70% etanol Dowolny dostawca Ja owe, jednorazowe, serologiczne pipety 5 i 25 ml Dowolny dostawca ® ytki z mikrodo kami systemu cobas 4800 (p ytki AD) i folie do zaklejania Roche 05232724001 ® Aplikator folii do zaklejania systemu cobas 4800 (dostarczany ® wraz z instalacj systemu cobas 4800) Roche 04900383001 Pipetory regulowane* (mog ce pipetowa 5–1000 µl) Dowolny dostawca Wolne od DNaz ko cówki z os on aerozolow lub wyrzutnikiem Dowolny dostawca TM Pipet-Aid * Drummond 4-000-100 albo odpowiednik Wirówka laboratoryjna* (umo liwiaj ca wirowanie przy 6000 x g dla probówek sto kowych o pojemno ci 50 ml w rotorze wychylnym) Eppendorf model 5810 lub odpowiednik Mikrowirówka laboratoryjna* (umo liwiaj ca wirowanie przy 20 000 x g) Eppendorf 5430 lub 5430R albo odpowiednik Ja owe plastikowe probówki sto kowe o pojemno ci 15 ml Dowolny dostawca Probówki do mikrowirówek (wolne od RNaz/DNaz, 1,5 ml/ o czysto ci do PCR) Life Technologies AM12400 lub Eppendorf 022364120 albo odpowiednik Statywy na wirówki sto kowe i do mikrowirówki Dowolny dostawca Mieszad o wibracyjne* Dowolny dostawca kawiczki jednorazowe bezpudrowe Dowolny dostawca * Ca e wyposa enie powinno by odpowiednio konserwowane zgodnie z instrukcjami producenta. W celu uzyskania dodatkowych informacji dotycz cych materia ów sprzedawanych oddzielnie prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche. Urz dzenia i oprogramowanie wymagane, lecz niedostarczane Urz dzenia i oprogramowanie wymagane, lecz niedostarczane Analizator cobas z 480 ® Jednostka steruj ca systemu cobas 4800 z oprogramowaniem systemowym w wersji 2.1 lub nowszej Pakiet oprogramowania EGFR Plasma Analysis Package Software w wersji 1.0 lub nowszy Zewn trzny czytnik kodów kreskowych, pod czany do portu USB Drukarka (np. HP P2055d) W celu uzyskania dodatkowych informacji dotycz cych materia ów sprzedawanych oddzielnie prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 45 CZ B: Do stosowania z próbkami osocza ® cobas EGFR Mutation Test v2 Wymagania dotycz ce rodków ostro no ci i u ytkowania Ostrze enia i rodki ostro no ci Podobnie jak w przypadku ka dej procedury testowej, dla prawid owego przeprowadzenia badania kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Do stosowania wy cznie w diagnostyce in vitro. Karty charakterystyki (Safety Data Sheet, SDS) s dost pne na przedstawicielstwie firmy Roche. danie w miejscowym Z wszystkimi próbkami nale y obchodzi si tak jak z materia em zaka nym, stosuj c laboratoryjne procedury bezpiecze stwa, takie jak okre lone w dokumentach Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories8 oraz CLSI Document M29-A49. Odczynnik DNA PBB zawiera Triton X-100, rodek dra ni cy b ony luzowe. Nale y unika kontaktu tych odczynników z oczami, skór i b onami luzowymi. Zaleca si u ywanie ja owych jednorazowych pipet oraz ko cówek pipet niezawieraj cych DNazy. Dobra praktyka laboratoryjna Nie nale y pipetowa za pomoc ust. Nie wolno je , pi ani pali w obszarach roboczych laboratorium. Po pracy z próbkami i zestawami odczynników nale y dok adnie umy r ce. Podczas pracy z jakimikolwiek odczynnikami nale y u ywa os on na oczy oraz fartuchów laboratoryjnych i r kawic jednorazowych. Nale y unika kontaktu wymienionych materia ów ze skór , oczami i b onami luzowymi. Je eli dojdzie do kontaktu, miejsce jego wyst pienia nale y natychmiast sp uka du ilo ci wody. Je eli nie zostan podj te odpowiednie dzia ania lecznicze, mo e doj do oparze . W razie rozlania przed wytarciem nale y rozcie czy wod . Dok adnie oczy ci i odkazi wszystkie laboratoryjne powierzchnie robocze wie o przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie destylowanej lub dejonizowanej (rozcie czy domowy wybielacz w stosunku 1:10). Nast pnie nale y przetrze powierzchni 70% etanolem. Uwaga: Dost pny w handlu p ynny wybielacz przeznaczony do zastosowa domowych zazwyczaj zawiera podchloryn sodu o st eniu 5,25%. Rozcie czenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 daje 0,5% roztwór podchlorynu sodu. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 46 CZ B: Do stosowania z próbkami osocza ® cobas EGFR Mutation Test v2 Zanieczyszczenie W celu zapobie enia zanieczyszczeniu konieczne jest noszenie r kawic i ich zmiana pomi dzy prac z próbkami a odczynnikami testu cobas® EGFR. Podczas pracy z próbkami nale y unika zanieczyszczenia r kawiczek. kawiczki nale y cz sto zmienia , aby ograniczy mo liwo zanieczyszczenia. kawiczki nale y zmienia przed opuszczeniem obszarów izolacji DNA lub w przypadku podejrzenia kontaktu z roztworami lub próbk . Nale y unika zanieczyszczenia odczynników przez rybonukleazy i mikrobiologicznego. Przed przygotowaniem roboczego MMX nale y dok adnie oczy ci obszar roboczy amplifikacji i detekcji. Materia y i urz dzenia powinny by przeznaczone do ka dego z dzia ; nie mog by stosowane w innych dzia aniach lub przenoszone pomi dzy obszarami. Na przyk ad pipetory i materia y przeznaczone do izolacji DNA nie mog by stosowane do przygotowywania odczynników do amplifikacji i detekcji. Zdecydowanie zaleca si , aby przebieg pracy w laboratorium by jednokierunkowy i polega na zako czeniu jednej czynno ci przed przej ciem do kolejnej. Na przyk ad izolacj DNA nale y zako czy przed rozpocz ciem amplifikacji i detekcji. Izolacja DNA powinna by prowadzona w obszarze oddzielonym od amplifikacji i detekcji. Aby unikn zanieczyszczenia odczynnika roboczego Master Mix próbkami DNA, obszar roboczy amplifikacji i detekcji powinien by dok adnie oczyszczony przed przygotowaniem odczynnika roboczego Master Mix. Integralno Nie wolno u ywa zestawów po up ywie daty wa no ci. Nie nale y zlewa odczynników pochodz cych z ró nych zestawów lub serii. Nie wolno u ywa przedmiotów jednorazowego u ytku po up ywie daty wa no ci. Wszystkie przedmioty jednorazowego u ytku s przeznaczone do jednokrotnego u ycia. Nie wykorzystywa ponownie. Ca e wyposa enie powinno by odpowiednio konserwowane, zgodnie z instrukcjami producenta. Utylizacja Odczynniki DNA EB, MGAC, EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2, EGFR MC i DNA SD zawieraj azydek sodu. Azydek sodu mo e reagowa z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z o owiu lub miedzi, tworz c silnie wybuchowe azydki metali. Usuwaj c roztwory zawieraj ce azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, nale y sp uka rury du ilo ci zimnej wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków. Nale y wyrzuci wszystkie nieu yte odczynniki, post puj c zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 47 CZ ® B: Do stosowania z próbkami osocza cobas EGFR Mutation Test v2 Rozlanie p ynów i czyszczenie Odczynniki DNA PBB i WB I zawieraj chlorowodorek guanidyny. Je li p yn zawieraj cy wspomniany bufor ulegnie rozlaniu, do czyszczenia nale y u ywa odpowiedniego detergentu laboratoryjnego i wody. W przypadku rozlania p ynu zawieraj cego potencjalne czynniki zaka ne do czyszczenia nale y ywa najpierw detergentu laboratoryjnego i wody, a nast pnie 0,5% roztworu podchlorynu sodu. Je li do rozlania p ynu dojdzie na powierzchni aparatu cobas® 4800, nale y post powa zgodnie z instrukcjami zamieszczonymi w odpowiednim Podr czniku u ytkownika systemu cobas® 4800 w celu przeprowadzenia czyszczenia. Do czyszczenia analizatora cobas z 480 nie wolno u ywa roztworu podchlorynu sodu (wybielacza). Czyszczenie analizatora cobas z 480 nale y przeprowadza zgodnie z procedurami opisanymi w Podr czniku u ytkownika systemu cobas® 4800. Dodatkowe ostrze enia, rodki ostro no ci i procedury maj ce na celu zmniejszenie ryzyka zanieczyszczenia analizatora cobas z 480 zamieszczono w Instrukcji obs ugi analizatora cobas z 480. Pobieranie, transport i przechowywanie próbek Uwaga: Ze wszystkimi próbkami nale y obchodzi si jak z materia em potencjalnie zaka nym. Pobieranie próbek i praca z próbkami Zestaw cobas® cfDNA Sample Preparation Kit zosta opracowany do stosowania z próbkami osocza pobranego na K2-EDTA. Osocze powinno by oddzielane od krwi w ci gu 4 godzin od pobrania i przechowywane do momentu badania w temperaturze -70°C. Transport, przechowywanie i stabilno próbek Próbki osocza mog by transportowane w stanie zamro enia. Próbki osocza musz by transportowane zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi, dotycz cymi transportu czynników etiologicznych10. Temperatura przechowywania próbek osocza -70°C Od 2°C do 8°C Czas przechowywania Do 12 miesi cy Do 3 dni Przechowywanie i stabilno próbki przetworzonej Próbka przetworzona (wyizolowany DNA) jest stabilna przez: Temperatura przechowywania wyizolowanego DNA Od -15°C do -25°C Od 2°C do 8°C Od 15°C do 30°C Czas przechowywania Do 1 cyklu rozmra ania przez 60 dni Do 7 dni Do 1 dnia Wyizolowany DNA powinien by u ywany w zalecanych okresach przechowywania lub przed up ywem daty wa no ci zestawu cobas® cfDNA Sample Preparation Kit u ytego do izolacji DNA, w zale no ci od tego, co nast pi wcze niej. Przed u yciem izolowanych, przechowywanych roztworów podstawowych DNA, szybko wytrz sa i odwirowa probówk do elucji zawieraj roztwór podstawowy. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 48 CZ ® B: Do stosowania z próbkami osocza cobas EGFR Mutation Test v2 Procedura testowa Wykonywanie oznaczenia Ryc. 4 ® ® Przebieg pracy z testem cobas EGFR Mutation Test v2 i zestawem cobas cfDNA Sample Preparation Kit 1 Uruchomienie systemu. 2 Wykonanie czynno ci konserwacyjnych dla aparatu. 3 Wyj cie próbek i odczynników z miejsca przechowywania. 4 Przygotowanie próbek do wi zania na kolumnie 5 Przeprowadzenie izolacji DNA. 6 Elucja DNA 7 Utworzenie zlecenia pracy i wydrukowanie uk adu p ytki. 8 Przygotowanie odczynników do amplifikacji. 9 Umieszczenie odczynników do amplifikacji na p ytce z mikrodo kami. 10 Umieszczenie próbki na p ytce z mikrodo kami. 11 Uszczelnienie p ytki z mikrodo kami. 12 Umieszczenie p ytki z mikrodo kami w analizatorze cobas z 480. 13 Rozpocz cie przebiegu. 14 Przeanalizowanie wyników. 15 W przypadku korzystania z systemu LIS: przes anie wyników do systemu LIS. 16 Wyj cie p ytki z analizatora. Instrukcja u ytkowania Uwaga: Z zestawem cobas® EGFR nale y stosowa wy cznie próbki osocza pobranego na K2 EDTA. Uwaga: Szczegó owe wskazówki dotycz ce obs ugi analizatora cobas z 480 zamieszczono w Instrukcji obs ugi analizatora cobas z 480. Wielko przebiegu Pojedynczy przebieg testowy mo e obejmowa od 1 do 30 próbek (plus kontrole) w ka dej p ytce z 96 mikrodo kami. Przy przeprowadzaniu przebiegu testowego obejmuj cego wi cej ni 24 próbki trzeba b dzie u wielu zestawów testu cobas® EGFR. Zestaw cobas® EGFR zawiera ilo odczynników wystarczaj do wykonania 8 przebiegów testowych po 3 próbki (plus kontrole), czyli maksymalnie na 24 próbki na zestaw. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 49 CZ ® B: Do stosowania z próbkami osocza cobas EGFR Mutation Test v2 Przygotowanie i przechowywanie odczynników Przed u yciem zestawu po raz pierwszy przygotowa odczynniki robocze zgodnie z tabel poni ej. Do dozowania wody u pipety serologicznej 5 ml. Do dozowania etanolu u pipet serologicznych 25 ml. Je li proteinaza K zosta a ju rozpuszczona i zamro ona, rozmrozi liczb równych obj to ci odczynnika, wystarczaj do przetworzenia liczby próbek przeznaczonych do danego przebiegu testowego. Odczynniki Rozpuszczenie / Przygotowanie Proteinaza K (PK) Rozpu ci proteinaz PK przez dodanie do fiolki 4,5 ml ja owej wody za pomoc ja owej, jednorazowej pipety serologicznej o pojemno ci 5 ml. Wymiesza zawarto , odwracaj c fiolk do góry dnem od 5 do 10 razy. Przenie porcje po 1,1 ml rozpuszczonej PK do probówek do mikrowirówki o pojemno ci 1,5 ml i przechowywa w temperaturze -20°C przez maksymalnie 30 dni lub do daty wa no ci, w zale no ci od tego, co nast pi wcze niej. Je li PK zosta a ju rozpuszczona i zamro ona, rozmrozi liczb równych obj to ci odczynnika, wystarczaj do przetworzenia liczby próbek przeznaczonych do danego przebiegu testowego (ka da próbka wymaga 250 µl rozpuszczonego odczynnika PK). Bufor do p ucz cy I (WB I) Przygotowa roboczy odczynnik WB I dodaj c 15 ml alkoholu bezwodnego do butelki WB I. Wymiesza odwracaj c butelk od 5 do 10 razy. Zapisa na butelce, e dodano etanol, i wpisa dat . Przechowywa odczynnik WB I w temperaturze od 15°C do 30°C przez maksymalnie 90 dni lub do daty wa no ci, w zale no ci od tego, co nast pi wcze niej. Bufor do p ucz cy II (WB II) Przygotowa roboczy odczynnik WB II przez dodanie do butelki z odczynnikiem WB II 50 ml etanolu bezwodnego. Wymiesza zawarto , odwracaj c butelk do góry dnem od 5 do 10 razy. Zapisa na butelce, e dodano etanol, i wpisa dat . Przechowywa odczynnik WB II w temperaturze od 15°C do 30°C przez maksymalnie 90 dni lub do daty wa no ci, w zale no ci od tego, co nast pi wcze niej. Wszystkie roztwory przechowywane w temperaturze od 15°C do 30°C powinny by klarowne. Je eli w którymkolwiek odczynniku obecny jest osad, ogrza roztwór do temperatury 37°C a do rozpuszczenia si osadu. Nie wolno u ywa odczynnika do czasu rozpuszczenia si ca ego osadu. Procedura izolacji DNA 1. Opisa probówk sto kow o pojemno ci 15 ml dla ka dej próbki osocza i kontroli ujemnej. Ja owa woda mo e s jako kontrola ujemna i mo e by przetwarzana w taki sam sposób jak próbki. 2. Zamiesza w mieszadle wibracyjnym, a nast pnie przenie (woda ja owa) do oddzielnej probówki o pojemno ci 15 ml. 2 ml ka dej próbki osocza lub kontroli ujemnej Uwaga: Do przetwarzania próbki za pomoc zestawu cobas® cfDNA Sample Preparation Kit potrzebne s przynajmniej 2 ml osocza. 3. Doda 250 µl PK do ka dej probówki. 4. Doda 2 ml odczynnika DNA PBB do ka dej probówki. 5. Wymiesza probówki z próbk zawieraj ce odczynniki DNA PBB/PK odwracaj c je od 3 do 5 razy. 6. Inkubowa ka probówk w temperaturze pokojowej (od 15°C do 30°C) przez 30 minut. Uwaga: Podczas inkubacji przygotowa wymagan liczb probówek filtruj cych HPEA FT opisuj c ka probówk filtruj HPEA FT odpowiednimi danymi na korku ka dej probówki filtruj cej HPEA FT. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 50 CZ ® B: Do stosowania z próbkami osocza cobas EGFR Mutation Test v2 Uwaga: Na ka próbk b dzie potrzebna jedna probówka filtruj ca FT HPEA, trzy probówki zbiorcze (CT) i dwie probówki do elucji (probówki do mikrowirówki o pojemno ci 1,5 ml). Uwaga: Podczas inkubacji nale y oznakowa wymagan liczb probówek do elucji (probówek do mikrowirówki o pojemno ci 1,5 ml) informacjami identyfikuj cymi próbk lub kontrol . 7. Doda 500 µl izopropanolu i wymiesza lizat odwracaj c od 3 do 5 razy. 8. Przenie ca lizatu do w ciwie oznakowanej probówki filtruj cej HPEA FT. 9. U ywaj c wirówki laboratoryjnej z rotorem wychylnym, odwirowa probówk filtruj 4000 x g przez 5 minut. HPEA FT przy 10. Po odwirowaniu wyj probówk filtruj HPEA FT ze sto kowej probówki zbiorczej o pojemno ci 50 ml. Umie ci probówk filtruj HPEA FT na probówce CT. Zdj wi kszy zacisk blokuj cy odkr caj c i odci gaj c go od zespo u. 11. Zdj mniejszy zacisk blokuj cy spod korka probówki filtruj cej (FT) popychaj c go do góry, a uszczelka dzie p kni ta po obu stronach korkach, a nast pnie odci gaj c go od zespo u. 12. Zdj probówk filtruj HPEA z probówki FT pochylaj c przed enie z dala od strony korka probówki FT. 13. Wyrzuci zawarto ze starej probówki filtruj cej HPEA FT do odpadów chemicznych i w odpowiedni sposób usun zu yt jednostk . 14. Opisa odpowiednio korek filtra. 15. Doda 500 µl roboczego odczynnika WB I do ka dej probówki FT. Uwaga: Przygotowanie roboczego odczynnika WB I opisano w tabeli w rozdziale „Przygotowanie odczynników”. 16. Do pozosta ej cz ci protoko u u mikrowirówki laboratoryjnej. 17. Odwirowa jednostki FT/CT przy 8000 x g przez 1 minut . 18. Umie ci ka probówk FT na nowej probówce CT. Wyrzuci zawarto odpadów chemicznych i odpowiednio zutylizowa star probówk CT. z ka dej probówki CT do 19. Doda 500 µl roboczego odczynnika WB II do ka dej probówki FT. Uwaga: Przygotowanie roboczego odczynnika WB II opisano w tabeli w rozdziale „Przygotowanie odczynników”. 20. Odwirowa jednostki FT/CT przy 8000 x g przez 1 minut . 21. Umie ci ka probówk FT na nowej probówce CT. Wyrzuci zawarto ze starej probówki CT do odpadów chemicznych i w odpowiedni sposób usun zu yt probówk CT. 22. Odwirowa jednostki FT/CT przy 16 000 x g do 20 000 x g przez 1 minut , aby osuszy membran filtra. 23. Umie ci probówk FT na probówce do elucji (wolnej od RNazy/DNazy probówce do mikrowirówki o pojemno ci 1,5 ml) oznakowanej uprzednio informacjami identyfikuj cymi próbk i na ka dej probówce umie ci znak orientacyjny. Wyrzuci zawarto z ka dej probówki CT do odpadów chemicznych i odpowiednio zutylizowa star probówk CT. 24. Doda 100 µl odczynnika DNA EB na rodek membrany probówki FT bez dotykania membrany probówki FT. 25. Inkubowa ka probówk do elucji FT w temperaturze pokojowej (od 15°C do 30°C) przez 5 minut. 26. Umie ci probówki w wirówce ze znakami orientacyjnymi skierowanymi na zewn trz. Wirowa probówk FT z probówk do elucji z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minut , aby zebra eluat do probówki do elucji (uprzednio oznakowanej wolnej od RNaz/DNaz probówki do mikrowirówki o pojemno ci 1,5 ml). Eluat stanowi roztwór podstawowy DNA. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 51 CZ B: Do stosowania z próbkami osocza ® cobas EGFR Mutation Test v2 27. Odrzuci probówk FT. 28. Powoli usun 80 µl roztworu podstawowego DNA zwracaj c uwag , aby nie naruszy peletki (która mo e nie by widoczna). Przenie roztwór podstawowy DNA do drugiej probówki do elucji (wolnej od RNazy/DNazy probówki do mikrowirówki o pojemno ci 1,5 ml) oznakowanej uprzednio informacjami identyfikuj cymi próbk . Zamkn zatyczki na probówkach do elucji. Roztwór podstawowy DNA jest gotowy do testów PCR. Przechowywa roztwór podstawowy DNA zgodnie z instrukcjami w cz ci Transport, przechowywanie i stabilno próbek. Uwaga: Je eli peletka jest zniszczona, zwróci roztwór podstawowy DNA do pierwotnej probówki do elucji, zamkn probówk , nast pnie szybko wytrz sa probówk i, ze znakiem orientacyjnym skierowanym na zewn trz, odwirowa probówk przy 8000 x g przez 1 minut , aby zebra eluat i powtórzy etap 28 w celu usuni cia 80 µl roztworu podstawowego DNA. Amplifikacja i detekcja Uwaga: Aby zapobiec zanieczyszczeniu roboczego odczynnika MMX próbkami DNA, nale y przeprowadza amplifikacj i detekcj w miejscu oddzielonym od obszaru wykonywania izolacji DNA. Przed przygotowaniem roboczego MMX nale y dok adnie oczy ci obszar roboczy amplifikacji i detekcji. W celu w ciwego oczyszczenia nale y dok adnie przetrze wszystkie powierzchnie, w cznie ze statywami i pipetorami, 0,5% roztworem podchlorynu sodu, a nast pnie 70% roztworem etanolu. Dost pny w handlu p ynny wybielacz przeznaczony do zastosowa domowych zazwyczaj zawiera podchloryn sodu o st eniu 5,25%. Rozcie czenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 daje 0,5% roztwór podchlorynu sodu. Konfigurowanie aparatu Szczegó owe wskazówki dotycz ce konfigurowania analizatora cobas z 480 zamieszczono w Instrukcji obs ugi analizatora cobas z 480. Konfiguracja zlecenia testu Szczegó owe instrukcje dotycz ce etapów przebiegu EGFR zamieszczono w Instrukcji obs ugi analizatora cobas® 4800 System cobas z 480 oraz podr czniku operatora oprogramowania cobas® EGFR Mutation Test v2. Wygenerowa map p ytki z pozycjami wszystkich próbek i kontroli do przebiegu. Kontrola mutacji jest umieszczona w pozycjach A01–A03 p ytki. Kontrola ujemna jest umieszczona w pozycjach B01–B03 p ytki. Nast pnie rozcie czone próbki s dodawane w zestawach po 3 kolumny pocz wszy od C01–C03 do H09–H12 jak przedstawia to Ryc. 5. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 52 CZ ® B: Do stosowania z próbkami osocza Ryc. 5 cobas EGFR Mutation Test v2 ® Uk ad p ytki dla testu cobas EGFR Mutation Test v2 Rz d/kolumna 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 A MC MMX 1 MC MMX 2 MC MMX 3 v2 S7 MMX 1 S7 MMX 2 S7 MMX 3 v2 S15 MMX 1 S15 MMX 2 S15 MMX 3 v2 S23 MMX 1 S23 MMX 2 S23 MMX 3 v2 B NEG MMX 1 NEG MMX 2 S8 MMX 1 S8 MMX 2 S8 MMX 3 v2 S16 MMX 1 S16 MMX 2 S24 MMX 2 S24 MMX 3 v2 S1 MMX 1 S1 MMX 2 S9 MMX 1 S9 MMX 2 S9 MMX 3 v2 S17 MMX 1 S17 MMX 2 S16 MMX 3 v2 S17 MMX 3 v2 S24 MMX 1 C NEG MMX 3 v2 S1 MMX 3 v2 S25 MMX 1 S25 MMX 2 S25 MMX 3 v2 D S2 MMX 1 S2 MMX 2 S2 MMX 3 v2 S10 MMX 1 S10 MMX 2 S10 MMX 3 v2 S18 MMX 1 S18 MMX 2 S18 MMX 3 v2 S26 MMX 1 S26 MMX 2 S26 MMX 3 v2 E S3 MMX 1 S3 MMX 2 S3 MMX 3 v2 S11 MMX 1 S11 MMX 2 S11 MMX 3 v2 S19 MMX 1 S19 MMX 2 S19 MMX 3 v2 S27 MMX 1 S27 MMX 2 S27 MMX 3 v2 F S4 MMX 1 S4 MMX 2 S4 MMX 3 v2 S12 MMX 1 S12 MMX 2 S12 MMX 3 v2 S20 MMX 1 S20 MMX 2 S20 MMX 3 v2 S28 MMX 1 S28 MMX 2 S28 MMX 3 v2 G S5 MMX 1 S5 MMX 2 S13 MMX 1 S13 MMX 2 S21 MMX 2 S29 MMX 2 S6 MMX 2 S14 MMX 1 S14 MMX 2 S22 MMX 1 S22 MMX 2 S21 MMX 3 v2 S22 MMX 3 v2 S29 MMX 1 S6 MMX 1 S13 MMX 3 v2 S14 MMX 3 v2 S21 MMX 1 H S5 MMX 3 v2 S6 MMX 3 v2 S30 MMX 1 S30 MMX 2 S29 MMX 3 v2 S30 MMX 3 v2 Gdzie: MC = kontrola mutacji, NEG = kontrola ujemna, S# = identyfikator próbki, a MMX-# odpowiada odczynnikowi Master Mix 1, 2 lub 3 v2. Uwaga: Ka da próbka musi rozci ga si przez trzy kolejne kolumny w jednym rz dzie, aby mo liwe by o utworzenie wyniku. Uwaga: Odczynnik roboczy Master Mix 1 musi by umieszczony w kolumnie 01, 04, 07 i 10 na p ytce. Odczynnik roboczy Master Mix 2 musi by umieszczony w kolumnie 02, 05, 08 i 11 na p ytce. Odczynnik roboczy Master Mix 3 v2 musi by umieszczony w kolumnie 03, 06, 09 i 12 na ytce. Uwaga: Na jednej p ytce mo na umie ci do 30 próbek. Je eli do przetworzenia wszystkich próbek na ytce potrzebny jest wi cej ni jeden zestaw odczynnika, wszystkie zestawy musz pochodzi z tej samej serii. Konfigurowanie aparatu 1. W czy analizator cobas z 480. Zanim b dzie mo na rozpocz minut rozgrzewa si . 2. W czy jednostk steruj przebieg, instrument b dzie przez kilka . Jednostka steruj ca automatycznie zaloguje si do systemu Windows. 3. Klikn dwukrotnie ikon oprogramowania cobas® 4800 i zalogowa si , aby przeprowadzi przebieg ywaj c okre lonego identyfikatora u ytkownika laboratorium i has a. 4. Klikn w menu ikon „New Run”. 5. Zostanie wy wietlone okno wyskakuj ce „Select Test”. Wybra „EGFR Plasma Test” i klikn przycisk „OK”. 6. Po wy wietleniu ekranu „Work Place” wpisa lub zeskanowa kod kreskowy MWP w polu „Microwell Plate ID”. Zeskanowa w odpowiednich polach kody kreskowe identyfikatora zestawu do izolacji DNA oraz identyfikator zestawu cobas® EGFR Mutation Test Reagent. W polu „Sample” wprowadzi „24” dla pierwszego i „6” dla drugiego zestawu (je eli planowany jest przebieg dla pe nej p ytki 30 próbek). Je eli planowany jest przebieg dla mniej ni 24 próbek, nale y wprowadzi odpowiedni liczb w pole próbki w pierwszym wierszu. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 53 CZ ® B: Do stosowania z próbkami osocza cobas EGFR Mutation Test v2 7. Pole „Sample ID” jest wype niane automatycznie w pozycjach kontroli. Wpisa lub zeskanowa unikatowy identyfikator próbki dla ka dej próbki w kolumnie „Sample ID”. 8. Po zako czeniu wprowadzania identyfikatorów próbek wybra przycisk „Save” znajduj cy si w lewym dolnym rogu ekranu. 9. Zapisa plik pod domy ln nazw przypisan przez oprogramowanie. 10. Wygenerowa uk ad p ytki z pozycjami wszystkich próbek i kontroli w serii klikaj c przycisk Print i wybieraj c File -> Print w oknie Preview. Zawsze wype nia p ytk kolumnami zaczynaj c od EGFR MC w pozycjach A01–A03 i NEG w pozycjach B01–B03. Mapowa próbki zaczynaj c od pozycji C01–C03 i kontynuowa w dó do H01–H03, nast pnie przej do pozycji A04–A06 w dó do H04–H06, a zostan zmapowane wszystkie próbki (Ryc. 5). Konfiguracja reakcji Przygotowanie roboczego odczynnika Master Mix (MMX-1, MMX-2 i MMX-3 v2) Uwaga: Odczynniki EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2 oraz roboczy odczynnik MMX s wra liwe na wiat o i nale y je chroni przed d ugotrwa ekspozycj na wiat o. Uwaga: Ze wzgl du na lepko odczynników EGFR MIX oraz roboczego odczynnika MMX przenoszenie pipet nale y wykonywa powoli, aby zagwarantowa podanie z ko cówki ca ej obj to ci mieszaniny. Uwaga: Odczynniki EGFR MMX-1, EGFR MMX-2 i EGFR MMX-3 v2 mog przybiera zabarwienie jasnoniebieskie lub zbli one do purpury. Nie wp ywa to na dzia anie odczynnika. Przygotowa w oddzielnych probówkach do mikrowirówki o pojemno ci 1,5 ml trzy wi ksze porcje odczynników potrzebnych do sporz dzenia roboczych odczynników MMX: jedn odczynnika EGFR MMX-1, jedn odczynnika EGFR MMX-2 i jedn odczynnika EGFR MMX-3 v2. 1. Obliczy obj to odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 v2 wymagan do sporz dzenia ka dego z odczynników roboczych MMX wed ug nast puj cego wzoru: Wymagana obj to odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 v2 = (liczba próbek + 2 kontrole +1) x 20 µl 2. Obliczy obj to odczynnika MGAC, wymagan do sporz dzenia ka dego z odczynników roboczych MMX, wed ug nast puj cego wzoru: Wymagana obj to odczynnika MGAC = (liczba próbek + 2 kontrole +1) x 5 µl Pos uguj c si Tabela 12 okre li obj to ka dego odczynnika, potrzebn do przygotowania roboczego odczynnika MMX, na podstawie liczby próbek w czonych do przebiegu testowego. Tabela 12 Obj to ci odczynników, potrzebne do sporz dzenia roboczego odczynnika MMX-1, roboczego odczynnika MMX-2 i roboczego odczynnika MMX-3 v2 Liczba próbek* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MMX 20 µl 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 MGAC 5 µl 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 Ca kowita obj. ka dego roboczego odczynnika MMX (µl) * Obj to ci odpowiadaj ce liczbie próbek obliczono na podstawie sumy: liczba próbek + 2 kontrole + 1 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 54 CZ B: Do stosowania z próbkami osocza ® cobas EGFR Mutation Test v2 3. Wyj odpowiedni liczb fiolek z odczynnikami EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2 i MGAC z miejsca, w którym by y przechowywane w temperaturze od 2°C do 8°C. Przed u yciem ka dego odczynnika miesza go przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym, po czym zgromadzi p yn na dnie probówki. Oznakowa ja ow probówk do mikrowirówki, przeznaczon na roboczy odczynnik MMX-1, roboczy odczynnik MMX-2 i roboczy odczynnik MMX-3 v2. 4. Doda obliczon obj to odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 v2 do odpowiedniej probówki przeznaczonej na roboczy odczynnik MMX. 5. Doda obliczon obj to odczynnika MGAC do probówek przeznaczonych na robocze odczynniki MMX. 6. Miesza zawarto probówek na mieszadle wibracyjnym od 3 do 5 sekund, aby zapewni dostateczne wymieszanie odczynnika. Uwaga: Próbki i kontrole nale y doda do p ytki z mikrodo kami (p ytki AD) w ci gu 1 godziny od przygotowania roboczych odczynników MMX. Uwaga: Nale y u ywa wy cznie p ytki z mikrodo kami (p ytki AD) systemu cobas® 4800 oraz odpowiedniej folii do zaklejania. Przygotowanie p ytki Uwaga: W przypadku stosowania przechowywanych roztworów podstawowych DNA, post powa zgodnie z instrukcjami w cz ci Transport, przechowywanie i stabilno próbek. 1. Przenie pipet 25 µl roboczego odczynnika MMX do ka dego do ka reakcyjnego p ytki z mikrodo kami (p ytki AD), potrzebnego do przeprowadzenia przebiegu testowego. Nie dopu ci do tego, aby ko cówka pipetora dotkn a p ytki poza obr bem do ka. Doda roboczego odczynnika MMX-1 (zawieraj cego odczynnik EGFR MMX-1) do do ków p ytki z mikrodo kami (p ytki AD) w kolumnach 01, 04, 07 i 10, zgodnie z potrzeb . Doda roboczego odczynnika MMX-2 (zawieraj cego odczynnik EGFR MMX-2) do do ków p ytki z mikrodo kami (p ytki AD) w kolumnach 02, 05, 08 i 11, zgodnie z potrzeb . Doda roboczego odczynnika MMX-3 v2 (zawieraj cego odczynnik EGFR MMX-3 v2) do do ków ytki z mikrodo kami (p ytki AD) w kolumnach 03, 06, 09 i 12, zgodnie z potrzeb . 2. Przenie pipet 25 µl odczynnika EGFR MC do do ków A01, A02 i A03 ytki z mikrodo kami (p ytki AD); dok adnie wymiesza , aspiruj c pipet zawarto i podaj c j z powrotem, co najmniej dwukrotnie w obr bie danego do ka. 3. U ywaj c nowej ko cówki pipetora, przenie pipet 25 µl roztworu NEG do do ków B01, B02 i B03 p ytki z mikrodo kami (p ytki AD); dok adnie wymiesza , aspiruj c pipet zawarto i podaj c j z powrotem, co najmniej dwukrotnie w obr bie danego do ka. Uwaga: Ka dy przebieg testowy musi zawiera kontrol dodatni (odczynnik EGFR MC) w do kach A01, A02 i A03 oraz kontrol ujemn (roztwór NEG) w do kach B01, B02 i B03; w przeciwnym razie przebieg testowy zostanie odrzucony jako niewa ny przez analizator cobas z 480. Uwaga: Nale y zmienia r kawice zgodnie z potrzebami, aby chroni próbki przed wzajemnym zanieczyszczeniem zawartym w nich materia em oraz chroni probówki do reakcji PCR przed zanieczyszczeniem na ich zewn trznych powierzchniach. 4. U ywaj c nowych ko cówek pipetora do ka dej próbki DNA, doda 25 µl pierwszej próbki DNA do do ków: C01, C02 i C03 p ytki z mikrodo kami (p ytki AD); u ywaj c nowej ko cówki do dodawania próbki DNA do ka dego do ka; dok adnie wymiesza zawarto ka dego do ka, aspiruj c pipet zawarto i podaj c j z powrotem, przynajmniej dwukrotnie w obr bie danego do ka. Powtórzy t procedur dla DNA z ka dej próbki i post powa wed ug szablonu przedstawionego na Ryc. 5, dopóki roztwory DNA ze wszystkich próbek nie zostan umieszczone na p ytce z mikrodo kami (p ytce AD). Upewni si , e ca y p yn zebra si na dnie do ków. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 55 CZ ® B: Do stosowania z próbkami osocza cobas EGFR Mutation Test v2 Uwaga: Przed u yciem przechowywanych roztworów podstawowych DNA, szybko wytrz sa i odwirowa probówk do elucji zawieraj roztwór podstawowy. 5. Przykry p ytk z mikrodo kami (p ytk AD) foli do zaklejania (dostarczone wraz z p ytkami). U aplikatora folii uszczelniaj cej do szczelnego przytwierdzenia folii do p ytki z mikrodo kami (p ytki AD). 6. Przed rozpocz ciem reakcji PCR potwierdzi , e ca y p yn zebra si na dnie ka dego z do ków. Uwaga: Amplifikacja i detekcja powinny rozpocz si w ci gu 1 godziny od dodania rozcie czonego roztworu DNA z pierwszej próbki do roboczego odczynnika MMX. Rozpocz cie reakcji PCR Szczegó owe wskazówki dotycz ce etapów przebiegu pracy przy wykonywaniu bada genu koduj cego EGFR zamieszczono w Podr czniku u ytkownika testu cobas® EGFR. Wyniki Interpretacja wyników Uwaga: Walidacj przebiegu pracy oraz próbek przeprowadza oprogramowanie cobas® 4800. Uwaga: Wa ny przebieg testowy mo e obejmowa zarówno wa ne, jak i niewa ne wyniki badania próbek. W przypadku wa nego przebiegu wyniki badania próbek interpretuje si w sposób, który przedstawia Tabela 13. ® Tabela 13 Interpretacja wyniku testu cobas EGFR Wynik testu Wynik badania mutacji Wynik wska nika pó ilo ciowego (SQI) Ex19Del Ex19Del: SQI S768I S768I: SQI L858R L858R: SQI T790M Mutation Detected L861Q T790M: SQI G719X G719X: SQI Ex20Ins Ex20Ins: SQI (mo e by obecna wi ksza liczba mutacji ni jedna) (mo e by obecna wi ksza liczba mutacji ni jedna) No Mutation Nie dotyczy Detected (NMD)* Invalid Failed Nie dotyczy Nie dotyczy L861Q: SQI Interpretacja Wykryto mutacj w okre lonym regionie docelowym genu koduj cego EGFR. Nie dotyczy Nie wykryto mutacji w regionach docelowych genu koduj cego EGFR. Nie dotyczy Wynik badania próbki jest niewa ny. Powtórzy test próbek z niewa nymi wynikami, post puj c zgodnie z instrukcj przedstawion poni ej w rozdziale Ponowny test próbek z niewa nymi wynikami. Nie dotyczy Przebieg testowy nie powiód si wskutek awarii sprz tu lub oprogramowania. Skontaktowa si z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej. * Wynik „No Mutation Detected” nie wyklucza obecno ci mutacji w regionach docelowych genu koduj cego EGFR, poniewa wyniki zale od st enia zmutowanych sekwencji, dostatecznej integralno ci próbki, braku inhibitorów i wystarczaj cej do wykrycia ilo ci DNA. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 56 CZ B: Do stosowania z próbkami osocza ® cobas EGFR Mutation Test v2 Wska nik pó ilo ciowy (SQI) SQI to pó ilo ciowa miara ilo ci zmutowanego cfDNA w próbce, której mo na u do pomiaru ró nic w obci eniu mutacj w czasie. Wzrost warto ci SQI wskazuje na wzrost ilo ci odpowiadaj cej mutacji docelowej w danej próbce, natomiast zmniejszenie warto ci SQI wskazuje na spadek ca kowitej ilo ci odpowiadaj cej mutacji docelowej w danej próbce. Ponowny test próbek z niewa nymi wynikami 1. Je eli przebieg jest niewa ny, ilo wyizolowanego DNA dla ka dej próbki b dzie niewystarczaj ca, aby powtórzy amplifikacj i detekcj . Powtórzy ca procedur testu dla wszystkich próbek zaczynaj c od izolacji DNA. 2. Je eli przebieg jest wa ny, ale próbka jest niewa na, ilo wyizolowanego DNA dla ka dej próbki b dzie niewystarczaj ca, aby powtórzy amplifikacj i detekcj . Powtórzy ca procedur testu dla próbki niewa nej zaczynaj c od izolacji DNA. Kontrola jako ci i wa no wyników Ka dy przebieg testowy, licz cy do 30 próbek, zawiera jeden zestaw kontroli mutacji do testu cobas® EGFR (EGFR MC) (do ki A01, A02 i A03) i kontroli ujemnej (NEG) (do ki B01, B02 i B03) dla odczynników roboczych MMX-1, MMX-2 i MMX-3 v2. Przebieg jest wa ny, je eli wa ne s : kontrola mutacji do testu EGFR (EGFR MC) i kontrola ujemna (NEG). Je eli kontrola mutacji do testu EGFR (EGFR MC) lub kontrola ujemna (NEG) jest niewa na, ca y przebieg wymaga powtórzenia. Kontrola mutacji Wynik kontroli mutacji do testu EGFR (EGFR MC) musi nosi okre lenie „Valid”. Je eli wyniki oznaczenia EGFR MC stale s niewa ne, nale y skontaktowa si z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej. Kontrola ujemna Wynik kontroli ujemnej (NEG) musi nosi okre lenie „Valid”. Je eli wyniki oznaczenia NEG stale s niewa ne, nale y skontaktowa si z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 57 CZ B: Do stosowania z próbkami osocza ® cobas EGFR Mutation Test v2 Ograniczenia metody 1. Test cobas® EGFR Mutation Test v2 zosta zweryfikowany z próbkami osocza pobranego na K2 EDTA. 2. Skuteczno testu cobas® EGFR Mutation Test v2 by a weryfikowana przy u yciu zestawu cobas® cfDNA Sample Preparation Kit (Roche P/N: 07247737190) z próbkami osocza K2 EDTA. 3. Detekcja mutacji zale y od liczby kopii obecnych w próbce, na któr wp ywa mo e integralno ilo wyizolowanego DNA i obecno substancji zak ócaj cych detekcj . próbki, 4. Wiarygodno wyników zale y od odpowiedniego transportu, przechowywania i przetwarzania. Nale y przestrzega procedur opisanych w niniejszej instrukcji u ytkowania oraz w Podr czniku u ytkownika testu cobas® EGFR. 5. Pipetowanie ze spodu probówki do elucji mo e spowodowa zniszczenie peletki i niekorzystnie wp yn wyniki testu. na 6. Dodanie do odczynnika Master Mix testu cobas® EGFR Mutation Test v2 enzymu AmpErase umo liwia selektywn amplifikacj docelowego DNA; jednak dla unikni cia zanieczyszczenia odczynników konieczne jest stosowanie dobrej praktyki laboratoryjnej i dok adne przestrzeganie procedur wyszczególnionych w niniejszej instrukcji u ytkowania. 7. Tego produktu mog u ywa wy cznie osoby przeszkolone w zakresie technik PCR i u ywania systemu cobas® 4800. 8. Do u ycia z tym produktem zosta zatwierdzony wy cznie analizator cobas z 480. Z tym produktem nie wolno u ywa adnego innego termocyklera z systemem optycznym do detekcji w czasie rzeczywistym. 9. Z uwagi na ró nice pomi dzy technologiami zaleca si , aby przed zmian stosowanych metod u ytkownik przeprowadzi w laboratorium badanie korelacji stosowanych metod w celu okre lenia technologicznych wyst puj cych pomi dzy nimi. 10. Mutacje w obr bie regionów genomowego DNA tworz cego gen koduj cy EGFR, z którymi wi si primery i/lub sondy u ywane w te cie cobas® EGFR, chocia rzadkie, mog spowodowa niewykrycie obecno ci mutacji w eksonach 18., 19., 20. i 21. (wyniki „Mutation Not Detected”). 11. Obecno inhibitorów PCR mo e prowadzi do uzyskiwania wyników fa szywie ujemnych lub niewa nych. 12. Badane próbki poza zakresem liniowym oznaczenia mog generowa wyniki fa szywe. 13. Test cobas® EGFR Mutation Test v2 zosta zatwierdzony do zastosowania 25 µl roztworu podstawowego DNA na do ek reakcyjny. Nie zaleca si stosowania pocz tkowych obj to ci roztworu podstawowego DNA w ilo ci mniejszej ni 25 µl w ka dym do ku reakcyjnym. 14. Opisana wy ej procedura musi by przestrzegana, aby wykrywa K2 EDTA w przypadku mutacji EGFR (Tabela 1). 100 kopii DNA mutanta na ml osocza 15. Próbki z wynikami oznaczonymi jako „No Mutation Detected” mog zawiera mutacje w genie EGFR niewykrywane przez to oznaczenie. 16. Nale y rozwa , czy wynik „No Mutation Detected” dla osocza nale y powtórzy , czy potwierdzi przez badania tkanki. 17. Test cobas® EGFR wykazuje reaktywno krzy ow (wyniki „Mutation Detected”) z mutacj L747S w eksonie 19., rzadk mutacj nabyt , która mo e odpowiada za oporno na leczenie TKI11. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 58 CZ ® B: Do stosowania z próbkami osocza cobas EGFR Mutation Test v2 Ocena skuteczno ci w badaniach nieklinicznych Nast puj ce dane maj wykazywa skuteczno analityczn testu cobas® EGFR. Granica wykrywalno ci przy u yciu DNA linii komórkowych DNA linii komórkowych zawieraj cy ka z siedmiu klas mutacji wykrywanych przez test dodano do osocza K2 EDTA od zdrowego dawcy, tupu dzikiego dla EGFR. Przygotowano seryjne rozcie czenia i zbadano 24 powtórzenia ka dego elementu panelu z u yciem ka dej z trzech serii zestawów cobas® EGFR. Granic wykrywalno ci okre lono dla ka dej z siedmiu klas mutacji wykrywanych przez test jako najni sze st enia DNA, które dawa y wynik EGFR „Mutation Detected” z cz sto ci przynajmniej 95% dla badanej mutacji. Wyniki przedstawia Tabela 14. ® Tabela 14 Granica wykrywalno ci testu cobas EGFR przy u yciu osocza K2 EDTA Ekson genu koduj cego EGFR 18 Mutacja genu koduj cego EGFR G719A 19 Sekwencja docelowa kwasu nukleinowego Granica wykrywalno ci nienaruszonego* DNA (kopii/ml) Granica wykrywalno ci pofragmentowanego** DNA (kopii/ml) 2156G>C 100 100 Ex19Del 2235_2249del15 25 75 20 S768I 2303G>T 20 25 20 T790M 2369C>T 25 100 20 Ex20Ins 2307_2308ins9GCCAGCGTG 80 25 21 L858R 2573T>G 10 100 21 L861Q 2582T>A 30 30 Ró nice w obserwowanej granicy wykrywalno ci wynika y z ró nic DNA t a. *Nienaruszony DNA linii komórkowej mia t o DNA typu dzikiego wynosz ce oko o 10 000 kopii/ml. **DNA linii komórkowych pofragmentowany mechaniczne na fragmenty o redniej wielko ci 200 pz mia t o DNA typu dzikiego wynosz ce oko o 100 000 kopii/ml. Wyniki tego badania wskazuj , e test cobas® EGFR umo liwia wykrywanie mutacji w eksonach 18., 19., 20. i 21. genu koduj cego EGFR przy 100 kopiach DNA mutanta na ml osocza z zastosowaniem standardowej pocz tkowej obj to ci 25 µl podstawowego roztworu DNA na do ek reakcyjny. Korelacja z MiSeq przy u yciu klinicznych próbek osocza K2 EDTA W celu oceny zdolno ci testu do prawid owej identyfikacji mutacji EGFR w osoczu, przeprowadzono badanie porównawcze 74 próbek osocza K2 EDTA od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem p uca (ang. NonSmall Cell Lung Cancer, NSCLC) wykorzystuj c test cobas® EGFR oraz platform do sekwencjonowania Illumina MiSeq (MiSeq) (Tabela 15). ® Tabela 15 Test cobas EGFR Mutation Test v2 w porównaniu z sekwencjonowaniem MiSeq Miara zgodno ci Procent zgodno ci (n) 95% CI Zgodno procentowa wyników dodatnich (PPA) 80,0% (28/35) 70,3–83,7% Zgodno procentowa wyników ujemnych (NPA) 94,9% (37/39) 83,1–98,6% 87,8% (65/74) 81,2–90,7% Procentowa zgodno 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 ogó em (OPA) 59 CZ ® B: Do stosowania z próbkami osocza cobas EGFR Mutation Test v2 Liniowo Badanie liniowo ci testu cobas® EGFR przeprowadzono za pomoc serii rozcie cze przynajmniej 8 elementów panelu obejmuj cych zakres liniowo ci dominuj cej mutacji w ka dej klasie mutacji EGFR raportowanych przez test. Elementy panelu zosta y przygotowane przez rozcie czenie DNA linii komórkowych zawieraj cych ka z dominuj cych mutacji w zdrowym osoczu K2 EDTA, b cym typem dzikim dla EGFR. Ocen przeprowadzono wed ug wytycznych EP06-AE CLSI16. Zbadano dziesi powtórze na element panelu dla ka dej z 2 serii dla st do 1,0E+04 kopii/ml ( cznie 20 powtórze na poziom). Powy ej 1,0E+04 kopii/ml badano jedno powtórzenie na seri . Dla ka dej klasy mutacji testu cobas® EGFR zakres liniowo ci wskazuje Tabela 16 i odpowiednie wykresy dla jednej serii przedstawiaj Ryc. 6 do Ryc. 12. ® Tabela 16 Zakres liniowo ci testu cobas EGFR przy u yciu osocza K2 EDTA Ekson genu koduj cego EGFR 18 Mutacja genu koduj cego EGFR G719A 19 Delecja w eksonie 19. 20 S768I 2303G>T 10 — 1E+05 20 T790M 2369C>T 50 — 1E+05 20 Insercja w eksonie 20. 2307_2308ins9GCCAGCGTG 10 — 1E+05 21 L858R 2573T>G 10 — 1E+05 21 L861Q 2582T>A 10 — 1E+05 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 Sekwencja docelowa kwasu nukleinowego Zakres liniowo ci (kopie/ml) 2156 G>C 50 — 1E+04 2235_2249del15 10 — 1E+05 60 CZ Ryc. 6 ® B: Do stosowania z próbkami osocza Liniowo DNA mutanta w osoczu K2 EDTA: DNA linii komórkowej G719A cobas EGFR Mutation Test v2 Ryc. 7 Liniowo DNA mutanta w osoczu K2 EDTA: DNA linii komórkowej Ex19 Del Log miana (kp/ml) Log miana (kp/ml) SQI = -0,987 + 2,986 * Log kopii na ml 2 R = 0,968 SQI = 7,042 + 3,507 * Log kopii na ml 2 R = 0,981 Ryc. 8 Ryc. 9 Liniowo DNA mutanta w osoczu K2 EDTA: DNA linii komórkowej S768I Log miana (kp/ml) SQI = -0,578 + 3,093 * Log kopii na ml 2 R = 0,912 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 Liniowo DNA mutanta w osoczu K2 EDTA: DNA linii komórkowej T790M Log miana (kp/ml) SQI = 3,593 + 3,352 * Log kopii na ml 2 R = 0,973 61 CZ Ryc. 10 Liniowo DNA mutanta w osoczu K2 EDTA: DNA linii komórkowej Ex20Ins Log miana (kp/ml) SQI = -1,268 + 2,973 * Log kopii na ml 2 R = 0,990 Ryc. 12 ® B: Do stosowania z próbkami osocza cobas EGFR Mutation Test v2 Ryc. 11 Liniowo DNA mutanta w osoczu K2 EDTA: DNA linii komórkowej L858R Log miana (kp/ml) SQI = 2,543 + 3,283 * Log kopii na ml 2 R = 0,933 Liniowo DNA mutanta w osoczu K2 EDTA: DNA linii komórkowej L861Q Log miana (kp/ml) SQI = -1,177 + 3,149 * Log kopii na ml 2 R = 0,980 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 62 CZ ® B: Do stosowania z próbkami osocza cobas EGFR Mutation Test v2 Powtarzalno Powtarzalno testu cobas® EGFR oceniono wykorzystuj c rozcie czenia DNA linii komórkowej mutanta EGFR rozcie czonego w próbkach osocza K2 EDTA od zdrowego dawcy. Dominuj ca mutacja w ka dej klasie raportowanej przez test by a jednocze nie rozcie czana i oceniana przy 3x granicy wykrywalno ci odpowiedniej mutacji (w kopiach/ml), 1,0E+03 kopii/ml i 5,0E+04 kopii/ml. Dodatkowo badano jedn próbk typu dzikiego. Ka z czterech próbek bada o dwukrotnie dwóch operatorów u ywaj c dwóch ró nych serii odczynników i dwóch analizatorów cobas z 480 w ci gu 4 dni. Odsetek prawid owych rozpozna testu cobas® EGFR wyniós 99,2% (381/384). Tabela 17 wymienia redni SQI oraz odchylenie standardowe SQI z badania powtarzalno ci. Tabela 17 Ekson genu koduj cego EGFR redni SQI oraz odchylenie standardowe SQI z badania powtarzalno ci Mutacja genu koduj cego EGFR 18 19 G719A Ex19Del 20 S768I 20 20 T790M Ex20Ins 21 21 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 L858R L861Q Sekwencja docelowa kwasu nukleinowego 2156G>C 2235_2249del15 2303G>T 2369C>T 2307_2308ins9GCCAGCGTG 2573T>G 2582T>A Odchylenie standardowe SQI (n=32) St enie (kopie/ml) rednie SQI 3,00E+02 4,53 0,41 1,00E+03 6,86 0,38 5,00E+04 11,81 0,67 7,50E+01 13,42 0,46 1,00E+03 16,85 0,42 5,00E+04 22,31 0,55 6,00E+01 5,99 0,45 1,00E+03 8,49 0,43 5,00E+04 14,13 0,43 7,50E+01 9,00 1,03 1,00E+03 13,28 0,43 5,00E+04 19,52 0,57 2,40E+02 4,92 0,43 1,00E+03 6,77 0,40 5,00E+04 12,61 0,60 1,20E+02 9,81 0,47 1,00E+03 12,91 0,28 5,00E+04 17,21 0,81 4,50E+01 3,58 0,73 1,00E+03 7,91 0,45 5,00E+04 10,06 0,60 63 CZ ® B: Do stosowania z próbkami osocza cobas EGFR Mutation Test v2 Dodatkowe informacje Oznaczenia Na etykietach produktów diagnostycznych Roche PCR stosuje si nast puj ce oznaczenia. Tabela 18 Oznaczenia stosowane na etykietach produktów diagnostycznych PCR firmy Roche Oprogramowanie pomocnicze Wyrób do diagnostyki in vitro Autoryzowany Przedstawiciel we Wspólnocie Europejskiej Dolna granica przypisanego zakresu Arkusz kodów kreskowych Wytwórca Kod partii Przechowywa z dala od wiat a Zagro enie biologiczne Zawarto Numer katalogowy Przestrzega zakresu temperatury Sprawd w instrukcji obs ugi Plik definicji testów Zawarto Górna granica przypisanego zakresu zestawu wystarczaj ca na <n> testów Dystrybucja Termin wa no ci Wy cznie do oceny dzia ania w badaniach IVD Numer pozycji handlu globalnego Ten produkt spe nia wymogi dyrektywy Wspólnoty Europejskiej 98/79/WE dotycz cej diagnostycznych urz dze medycznych do stosowania in vitro. Linia pomocy technicznej dla klientów w Stanach Zjednoczonych 1-800-526-1247 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 64 CZ ® B: Do stosowania z próbkami osocza cobas EGFR Mutation Test v2 Wytwórca i dystrybutorzy Tabela 19 Wytwórca i dystrybutorzy Wyprodukowano w Stanach Zjednoczonych Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 68305 Mannheim, Germany Roche Diagnostics (Schweiz) AG Industriestrasse 7 6343 Rotkreuz, Switzerland Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 68305 Mannheim, Germany Roche Diagnostics, SL Avda. Generalitat, 171-173 E-08174 Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Roche Diagnostica Brasil Ltda. Av. Engenheiro Billings, 1729 Jaguaré, Building 10 05321-010 São Paulo, SP Brazil Roche Diagnostics 9115 Hague Road Indianapolis, IN 46250-0457 USA (For Technical Assistance call the Roche Response Center toll-free: 1-800-526-1247) Roche Diagnostics 201, boulevard Armand-Frappier H7V 4A2 Laval, Québec, Canada Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877-273-3433) Roche Diagnostics 2, Avenue du Vercors 38240 Meylan, France Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Viale G. B. Stucchi 110 20052 Monza, Milano, Italy Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, 249-1 2720-413 Amadora, Portugal Znaki towarowe i patenty Patrz http://www.roche-diagnostics.us/patents Copyright ©2016 Roche Molecular Systems, Inc. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 65 CZ B: Do stosowania z próbkami osocza ® cobas EGFR Mutation Test v2 Pi miennictwo 1. Sharma SV, Bell DW, Settleman J, Haber DA. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. Nat Rev Cancer. 2007;7:169-181. 2. Pao W, Chmielecki J. Rational, biologically based treatment of EGFR-mutant non-small-cell lung cancer. Nat Rev Cancer. 2010;10:760-774. 3. Zhou C, Wu Y-L, Chen G, et al. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): a multicentre, open-label, randomised, phase 3 study. Lancet Oncol. 2011;12:735-742. 4. Paz-Ares L, Soulières D, Melezínek I, et al. Clinical outcomes in non-small-cell lung cancer patients with EGFR mutations: pooled analysis. J Cell Mol Med. 2010;14:51-69. 5. American Cancer Society. Cancer Facts and Figures, 2012. http://www.cancer.org/research/cancerfactsstatistics/cancerfactsfigures2012. 6. Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC), 2011, v.51. http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic. 7. Longo MC, Berninger MS, Hartley JL. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene. 1990; 93:125-128. 8. Chosewood LC, Wilson DE. Biosafety and microbiological and biomedical laboratories-Fifth Edition. US Department of Health and Human Services Publication. (CDC). 2009;21-1112. 9. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections. Approved Guideline-Fourth Edition. CLSI Document M29-A4: Wayne, PA;CLSI, 2014. 10. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 52nd Edition. 2011. 11. Costa DB, Nguyen KS, Cho BC, Sequist LV, Jackman DM, Riely GJ, Yeap BY, Halmos B, Kim JH, Jänne PA, Huberman MS, Pao W, Tenen DG, Kobayashi S. Effects of erlotinib in EGFR mutated non-small cell lung cancers with resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 2008;14(21):7060-7067. 12. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline - Second Edition. CLSI Document EP17-A2E: Wayne, PA; CLSI, Jun 2012. 13. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Interference testing in clinical chemistry; Approved Guideline–Second Edition. CLSI Document EP7-A2E Appendix D:Wayne, PA; CLSI, 2005. ® 14. Tarceva (erlotinib) Package Insert. 15. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. The Lancet Oncology. 2012;13 v3:239-246. 16. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures: A statistical approach; Approved Guideline. CLSI Document EP06-AE: Wayne, PA; CLSI, Apr 2003. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 66 CZ B: Do stosowania z próbkami osocza ® cobas EGFR Mutation Test v2 Wersja dokumentu Informacje dotycz ce wersji dokumentu Doc Rev. 1.0 08/2015 Pierwsza publikacja. Doc Rev. 2.0 03/2016 Dodano wyja nienie dotycz ce post powania z roztworem podstawowym DNA/eluatem, b bna wirówki oraz adowania próbki na p ytk AD. W razie jakichkolwiek pyta prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche. Doc Rev. 2.0 01/2017 W cz ci Wymagane materia y dodatkowe poprawiono b d t umaczeniowy. W cz ci Procedura izolacji DNA poprawiono b d t umaczeniowy. W razie jakichkolwiek pyta prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche. 07340761001-03PL Doc. Rev. 2.0 67
