doctransformacja roślin za pośrednictwem agrobacterium rhizogenes
download 
Reklamacja Transkrypt
transformacja roślin za pośrednictwem agrobacterium rhizogenes
TRANSFORMACJA ROLIN ZA POREDNICTWEM AGROBACTERIUM RHIZOGENES POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI 189 TOM 36, 2009 SUPLEMENT NR 25 (189200) Rola komórek dendrytycznych w odpowiedzi transplantacyjnej* The role of dendritic cells in transplantation Maja Budziszewska1, Anna Korecka-Polak1, Gra¿yna Korczak-Kowalska1,2 1Zak³ad Immunologii, Wydzia³ Biologii, Uniwersytet Warszawski 2 Instytut Transplantologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny *Dofinansowanie z grantu MNiSzW nr N N402 268036 Streszczenie: Komórki dendrytyczne (DC) s¹ najwa¿niejszymi komórkami prezentuj¹cymi antygen (APC) limfocytom T. Stopieñ dojrza³oci komórki DC ma TRANSFORMACJA ROLIN ZA POREDNICTWEM kluczowe znaczenie dla rodzaju odpowiedzi limfocytów T. Niedojrza³a komórka DC AGROBACTERIUM RHIZOGENES* indukuje stan tolerancji, podczas gdy dojrza³a komórka DC - pe³n¹ odpowied immunologiczn¹. Ma to ogromne znaczenie w transplantologii, a zw³aszcza w AGROBACTERIUM RHIZOGENES-MEDIATED reakcjach odrzucania przeszczepu po transplantacjach narz¹du. Komórka DC dawcy prezentuje antygen w TRANSFORMATION sposób bezporedni, natomiast komórka DC biorcy drog¹ OF PLANTS poredni¹. Komórki DC niedojrza³e lub o w³aciwociach tolerogennych mog¹ 1 Takie oddzia³ywanie wyd³u¿yæ prze¿ycie przeszczepu allogenicznego. Katarzyna HNATUSZKO-KONKA , Piotr £UCHNIAK1, na funkcjê 2 1 in vivo lub komórek DC,Aneta aby WIKTOREK-SMAGUR by³y one niewra¿liwe na sygna³y dojrzewania , Aneta GERSZBERG , 1 1 aktywowanieTomasz komórek DC charakteryzuj¹cych trwa³ymi w³aciwociami , Andrzej K. siê KONONOWICZ KOWALCZYK tolerogennymi mo¿e poprawiæ tolerancjê przeszczepu. W tym celu wykorzystuje siê 1 Katedra GenetykiwOgólnej, Biologiiwarunkach, Molekularnej i Biotechnologii Rolin, oraz hodowle prowadzone specyficznych leczenie farmakologiczne Uniwersytet £ódzki oraz 2Instytut Medycyny Pracy, £ód in¿ynieriê genetyczn¹. S³owa kluczowe: Komórka dendrytyczna, transplantacja, tolerancja przeszczepu. Summary: most ostatnich important cellsi (APCs) areprocedur dendritic cells Streszczenie: Na The przestrzeni lat antigen-presenting opracowano wiele prostych skutecznych transformacji rolin za porednictwem Agrobacterium rhizogenes. Ten of glebowy patogenof rolin wywo³uje po(DCs), which present antigen to T cells. The state maturation DCs is crucial wstawanie korzeni w³onikowatych w miejscach zranienia tkanki. Podobnie jak A. tumefaciens jest zdolfor induction of a T-cell lymphocyte response. The immature DCs induce tolerance, ny do transferu fragmentu swojego megaplazmidu Ri do komórek rolinnych, gdzie ulega on stabilnej the mature DCs - Podczas immunity. is important in transplantology, especially in graft integracji i ekspresji. gdy This indukcja transgenicznych korzeni w wyniku infekcji A. rhizogenes rejectionw after organkrótkim transplantation. Donor DCs act via thezadirect, while recipient zachodzi stosunkowo czasie, uzyskanie rolin transgenicznych porednictwem A. tumefaciens minimum 4 do pathways 6 miesiêcy. Co ka¿da wi¹zka korzeni transformowanych pojawiaj¹ca DCszajmuje via the indirect ofwiêcej, allorecognition. Immature DCs or DCs with siê w wyniku transformacji za porednictwem A. rhizogenes stanowi niezale¿ny transformant, co potolerogenic properties may prolong allograft survival. Manipulating DCs function zwala na uzyskanie i analizê du¿ej liczby niezale¿nych linii transgenicznych. Niniejsza praca prezentuje to bewybrane insensitive to badañ maturation signals orczêstotliwoci activate DCs with tolerogenic properties m.in. rezultaty nad zwiêkszeniem transformacji. are the promising means of improving allograft tolerance. There are three approaches S³owa kluczowe: transformacja genetyczna rolin, Agrobacterium rhizogenes, korzenie w³onikowate. to achieve these aims: specific cell culture conditions, pharmacological treatment Summary: In recent years, simple and efficient procedures for obtaining transformed roots have been and genetic engineering. developed. Much like Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, a causative agent of hairy Keywords: Dendritic cell, transplantation, graft tolerance, graft rejection. root disease in plants, transfers T-DNA fragment from its root-inducing (Ri) plasmid to plant cells, where it isWstêp steadily integrated and expressed. It has to be emphasized, that while it usually takes a relatively short Wraz z przeszczepianym narz¹dem do organizmu biorcy dostaj¹ siê period of time to produce transformed roots following A. rhizogenes-mediated transformation, at least 46 months are required to regenerate transgenic plants whenwA. antygeny tumefaciens carrying Ti plasmid is used. ró¿norodne komórki mi¹¿szowe wyposa¿one zgodnoci tkankowej Moreover, since each transgenic root represents an independent transformation event, a large number of (MHC) oraz grupa komórek okrelanych jako "leukocyty pasa¿erskie", transformed root lines can be produced and analyzed in only a few weeks. Here, we present the results of odpowiedzialna przeszczepu. selected research onza thereakcjê increase odrzucania in transformation frequency. S¹ to m.in. komórki dendrytyczne (DC), które w pewnych warunkach zamiast prowadziæ do odrzucenia przeszczepu Key words: genetic transformation of plants, Agrobacterium rhizogenes, hairy roots. mog¹ sprzyjaæ jego akceptacji [5,16]. Precyzyjne okrelenie roli komórek dendrytycznych w odpowiedzi transplantacyjnej i opracowanie metod modyfikowania ich funkcji mo¿ez grantów przyczyniæ do poprawienia *Praca finansowana U£ nrsiê 505/0397 i 506/0996. rezultatów osi¹ganych w transplantologii. 1. Charakterystyka komórek dendrytycznych Komórki dendrytyczne s¹ profesjonalnymi komórkami prezentuj¹cymi antygen (APC), obecnymi w centralnych (grasica i szpik) i we wtórnych (wêz³y limfatyczne, kêpki Peyer'a i ledziona) narz¹dach limfatycznych [2]. Posiadaj¹ zdolnoæ do 190 K. HNATUSZKO-KONKA, P. £UCHNIAK, A. WIKTOREK-SMAGUR, A. GERSZBERG, T. KOWALCZYK, A. K. KONONOWICZ WSTÊP W przypadku systemów rolinnych u pod³o¿a wprowadzania obcych genów le¿y z³o¿ony proces transformacji genetycznej. Wykorzystuje on konstrukcje genowe zdolne do integracji z genomem gospodarza i nadaj¹ce mu okrelone nowe cechy. Obecnie, nie ma w¹tpliwoci, ¿e problem transformacji, stabilnej integracji transgenów z genomem roliny i ich ekspresji zosta³ rozwi¹zany i stanowi cenione i obiecuj¹ce narzêdzie alternatywnej biosyntezy. Wspó³czesne metody transformacji mo¿na podzieliæ na dwie g³ówne grupy: wektorowe i bezwektorowe. Transformacja bezwektorowa obejmuje sposoby niewykorzystuj¹ce porednictwa organizmów bakteryjnych (transformacja protoplastów przy u¿yciu czynników fizycznych elektroporacja lub chemicznych za pomoc¹ glikolu polietylenowego PEG oraz mikrowstrzeliwanie) [31, 32]. Grupa druga natomiast to metody wykorzystuj¹ce porednictwo bakterii, a jej jedynym reprezentantem by³a do niedawna transformacja za porednictwem Agrobacterium. Obecnie wiadomo jednak, ¿e obok przedstawicieli rodzaju Agrobacterium, naukowcom uda³o siê ujarzmiæ kilka innych gatunków bakterii, które po odpowiedniej modyfikacji s¹ zdolne do transferu genów. Badania prowadzone na organizmach rolinnych ujawni³y, ¿e gatunki, takie jak: Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizobium meliloti czy Mesorhizobium loti mog¹ byæ równie przydatne do tych celów w rolinnej biotechnologii. Warunkiem ich wykorzystania jest wprowadzenie do komórek bakteryjnych sekwencji niezbêdnych dla procesu transformacji: genów wirulencji pochodz¹cych z Agrobacterium oraz plazmidu binarnego nios¹cego region T-DNA [5, 8]. Bior¹c pod uwagê, ¿e wszystkie wymienione powy¿ej metody maj¹ swoje ograniczenia, opracowano klika alternatywnych procedur transformacji. Do tej grupy nale¿¹ miêdzy innymi: elektroforeza niedojrza³ych zarodków, elektroporacja komórek i tkanek, wprowadzanie DNA zamkniêtego w liposomach, wytrz¹sanie zawiesiny komórek z mikrow³ókienkami szklanymi, mikroiniekcja czy transformacja poprzez ³agiewkê py³kow¹. Ze wzglêdu na nisk¹ efektywnoæ transformacji podejcia alternatywne nie znalaz³y szerokiego zastosowania w laboratoriach biotechnologicznych, gdzie jednym z g³ównych narzêdzi transferu genów pozostaje nadal naturalny proces agroinfekcji [31, 32]. W latach osiemdziesi¹tych ubieg³ego wieku, naukowcy opracowali sposób rozbrajania wirulentnych szczepów Agrobacterium pozbawiaj¹c je sekwencji onkogenów oraz bardzo czêsto tak¿e genów syntazy opin. Dziêki temu zainfekowane tkanki mog³y staæ siê ród³em normalnych nieskolonizowanych rolin. Substytucja onkogenów po¿¹danymi transgenami oraz ich ekspresja w komórkach rolin doprowadzi³y do powstania nowych fenotypów. Pocz¹tkowo wprowadzanie obcych genów poprzez T-DNA odbywa³o siê w uk³adzie cis w stosunku do genów vir, jednak¿e opracowanie systemu binarnego znacznie zwiêkszy³o odsetek transformacji rolin za porednictwem Agrobacterium. Bakterie z tego rodzaju sta³y siê natomiast powszechnie znane jako czynnik kontrolowanego horyzontalnego transferu genów, który pe³ni kluczow¹ rolê zarówno w badaniach podstawowych, jak i w agrobiotechnologii [15]. TRANSFORMACJA ROLIN ZA POREDNICTWEM AGROBACTERIUM RHIZOGENES 191 Agrobacterium rhizogenes Patogenny charakter przedstawicieli rodzaju Agrobacterium rozpoznany zosta³ w pocz¹tkach ubieg³ego wieku. Naukowcy szybko odkryli, ¿e, obok gatunków awirulentnych (np. A. radiobacter), te glebowe, gramujemne pa³eczki stanowi¹ bezporedni¹ przyczynê nowotworowych chorób rolin dwuliciennych, wywo³uj¹c przyrost tkanki guzowatoæ szyjki korzeniowej (A. tumefaciens, A. vitis) lub guzowatoæ trzciny (A. rubi), b¹d zorganizowan¹ proliferacjê zainfekowanych komórek objawiaj¹c¹ siê rozwojem i wzrostem korzeni w³onikowatych [15]. Drobnoustrój odpowiedzialny za to ostatnie zjawisko zosta³ w 1930 roku nazwany przez Rikera Agrobacterium rhizogenes (od ang. rhizogenic reaction) [38]. Naukowcy s³usznie dopatrywali siê podobieñstw pomiêdzy mechanizmem dzia³ania A. tumefaciens a genez¹ tworzenia korzeni tumorowych. Udowodniono, ¿e patogenicznoæ A. rhizogenes wi¹¿e siê z wystêpowaniem plazmidu cechuj¹cego siê funkcjonalnym podobieñstwem do pTi A. tumefaciens [40, 41]. Obecnie wiadomo, ¿e podobnie jak w przypadku tumorogenezy u pod³o¿a ryzogenezy le¿y obecnoæ w komórkach patogena plazmidu wirulencji Ri (ang. Root inducing) oraz aktywny transfer do komórek roliny-gospodarza tzw. transferowego DNA T-DNA (ang. Transferred-DNA) i ekspresja zlokalizowanych w nim genów [22]. Jest to jedyny znany przyk³ad tego rodzaju transferu kwasu nukleinowego miêdzy przedstawicielami dwóch królestw [9]. Zasadniczymi, z punktu widzenia transformacji, elementami megaplazmidu Ri (oko³o 200 kpz) jest niemobilny region wirulencji obejmuj¹cy operony vir oraz sekwencja T-DNA [32]. Ponadto pRi jest nonikiem genów odpowiedzialnych za jego koniugacyjny transfer, replikacjê DNA plazmidu, cechê niezgodnoci oraz genów warunkuj¹cych katabolizm opin [17]. Opiny reprezentuj¹ zró¿nicowane strukturalnie pochodne aminokwasów, które s¹ produkowane przez zainfekowane komórki rolin w nastêpstwie ekspresji genów bakteryjnych. Komórki tkanki tumorowej produkuj¹ jedynie ten rodzaj opin, który jest specyficzny dla infekuj¹cego szczepu. Wydzielaj¹c te substancje rolina tworzy unikalne rodowisko dla Agrobacterium, w którym tylko te bakterie s¹ zdolne do ich utylizacji jako ród³a wêgla i azotu [36, 42]. Zjawisko to nosi miano kolonizacji genetycznej [42]. Sekwencja T-DNA obejmuje dwie klasy genów. Pierwsz¹ tworzy jeden z trzech (lub czterech wed³ug niektórych autorów regulon Ri mo¿e byæ tak¿e nonikiem genu syntazy mikimopiny) w³aciwych A. rhizogenes rodzajów syntaz opin ops (geny koduj¹ce syntazê kukumopin, mannopin, agropin) oraz geny zwi¹zane z ich sekrecj¹ ocs [12, 32]. Druga grupa to onkogeny wywo³uj¹ce niekontrolowany rozwój rolinnej tkanki tumorowej. Kodowane przez nie produkty mog¹ wp³ywaæ na biosyntezê fitohormonów, uwra¿liwiaæ systemy rolinne na stê¿enie endogennych regulatorów wzrostu lub uczestniczyæ w remodelowaniu chromatyny [16, 32]. Warto zaznaczyæ, ¿e szczepy agropinowe charakteryzuj¹ siê wystêpowaniem dwóch fragmentów T-DNA: TL (lewy T-DNA) i TR (prawy T-DNA), których transfer mo¿e zachodziæ niezale¿nie [3, 17, 32, 38]. Kluczowa rola w procesie ryzogenezy przypisywana jest nios¹cemu onkogeny rol (rolA, rolB, rolC, rolD) odcinkowi TL 192 K. HNATUSZKO-KONKA, P. £UCHNIAK, A. WIKTOREK-SMAGUR, A. GERSZBERG, T. KOWALCZYK, A. K. KONONOWICZ ze wzglêdu na wysok¹ homologiê do pojedynczego T-DNA zidentyfikowanego w szczepach mannopinowych i kukumopinowych [3]. Niezale¿nie od budowy, region T po obu stronach jest oflankowany powtarzalnymi sekwencjami o d³ugoci 2425 pz (RB i LB), których obecnoæ zapewnia prawid³owe rozpoznanie T-DNA, jego wyciêcie, transport oraz integracjê z genomem rolinnym [32, 36, 42]. Nale¿y zaznaczyæ, ¿e w przypadku znakomitej wiêkszoci badañ nad mechanizmem agroinfekcji jako patogena modelowego wykorzystywano Agrobacterium tumefaciens. Publikacji na temat przebiegu infekcji A. rhizogenes jest niewspó³miernie mniej, a informacje dotycz¹ce tego rodzaju transformacji zdobywa siê przez wyszukiwanie analogii i homologii z lepiej poznanym patogenem. Jednak, jak mo¿na zauwa¿yæ z powy¿szej charakterystyki wirulentne plazmidy Ti i Ri odznaczaj¹ siê znacznym podobieñstwem. Dotyczy ono przede wszystkim niemal identycznej organizacji regionu vir. Jedyne istotne odstêpstwo stanowi brak w plazmidzie Ri (i w ca³ym genomie bakteryjnym) u A. rhizogenes sekwencji koduj¹cych bia³ka VirE1 i VirE2. W przypadku niektórych szczepów funkcje wymienionych bia³ek przejmuj¹ produkty ekspresji genów GALLS zlokalizowanych na wirulentnym plazmidzie. Warto zauwa¿yæ, ¿e obok funkcjonalnej substytucji, bia³ka GALLS (GALLS-FL i GALLSCT) nie wykazuj¹ homologii sekwencyjnej z produktami operonu virE. Zaobserwowano j¹ natomiast pomiêdzy GALLS a sekwencj¹ aminokwasow¹ helikaz i bia³ek uczestnicz¹cych w koniugacyjnym transferze plazmidów [16, 19, 20, 21]. KONTROLOWANA TRANSFORMACJA Zasiêg infekcji dzikimi typami gatunków Agrobacterium obejmuje niewielk¹ liczbê rolin o znaczeniu ekonomicznym. Tymczasem rekombinowane szczepy tych bakterii sta³y siê unikalnym narzêdziem w rêkach biotechnologów, narzêdziem pozwalaj¹cym na genetyczne modyfikacje szerokiego spektrum organizmów, w tym rolin uprawnych, ozdobnych i drzew [9, 36]. Co wiêcej, mo¿liwoæ tych modyfikacji nie ogranicza siê jedynie do przedstawicieli królestwa rolin. Wykazano bowiem, ¿e Agrobacteria s¹ zdolne do transformacji dro¿d¿y, grzybów, zarodków je¿owców czy nawet komórek ludzkich [26, 27]. Po ponad trzech dekadach wykorzystywania bakteryjnych wektorów, dostêpne jest wiele procedur transferu genów. Mimo ¿e przewa¿aj¹ca czêæ tych protoko³ów zak³ada³a u¿ycie A. tumefaciens, transformacja rolin za porednictwem A. rhizogenes zyskuje coraz wiêcej zwolenników. Fakt, ¿e uzyskanie przewidywalnej i stabilnej ekspresji transgenu nadal pozostaje problematyczne, sk³ania naukowców do modyfikacji stosowanych rozwi¹zañ. Za zaadoptowaniem A. rhizogenes na potrzeby biotechnologii rolin przemawiaj¹ liczne czynniki. Fenotyp korzeni transformowanych charakteryzuje siê szybkim, niezale¿nym od fitohormonów wzrostem, brakiem geotropizmu, genetyczn¹ i biosyntetyczn¹ stabilnoci¹, krótkim czasem podwajania biomasy oraz ³atwoci¹ utrzymywania [1, 17, 18]. Zdolnoæ do syntezy szerokiego spektrum zwi¹zków chemicznych i wysoka produktywnoæ sprawi³y, ¿e korzenie TRANSFORMACJA ROLIN ZA POREDNICTWEM AGROBACTERIUM RHIZOGENES 193 RYCINA 1. Korzenie w³onikowate indukowane na: A) rzodkwi, B) rzodkiewce po reakcji na aktywnoæ GUS, C) rzodkiewniku pospolitym, D) kapucie pekiñskiej FIGURE 1. Hairy roots induced in: A) radish, B) radish after GUS assay, C) Arabidopsis thaliana, D) headed Chinese cabbage w³onikowate indukowano u wielu gatunków rolin dwuliciennych i nagozal¹¿kowych [10, 35]. Nale¿y podkreliæ, ¿e Ri-transformacja cieszy siê du¿ym zainteresowaniem w przypadku modyfikacji rolin, których cykl ¿yciowy jest szczególnie d³ugi [17]. Przyk³adem mog¹ tu byæ roliny drzewiaste, stanowi¹ce cenne ród³o papieru czy tarcicy [15, 32]. Obecnie panuje przekonanie, ¿e Agrobacterium rhizogenes mo¿e byæ z powodzeniem wykorzystywana nie tylko w badaniach nad biologi¹ korzeni (metabolizm, analiza funkcji genów w powi¹zaniu z rozwojem korzeni) czy interakcjami rolina - fitopatogen, ale tak¿e do genetycznych manipulacji rolin do celów produkcji metabolitów wtórnych, fitoremediacji czy funkcjonalnej charakterystyki genów i ich promotorów. Liczni badacze wskazuj¹, ¿e transformacja za porednictwem tego fitopatogena stanowi obiecuj¹c¹ alternatywê dla rolinnej 194 K. HNATUSZKO-KONKA, P. £UCHNIAK, A. WIKTOREK-SMAGUR, A. GERSZBERG, T. KOWALCZYK, A. K. KONONOWICZ in¿ynierii anga¿uj¹cej A. tumefaciens. Wydaje siê, ¿e A. rhizogenes bez przeszkód mo¿e byæ wykorzystywana do produkcji przeciwcia³ czy rekombinowanych bia³ek, stanowi¹c nonik plazmidów binarnych z sekwencj¹ po¿¹danych transgenów [4, 6, 7, 17, 25]. Takie zastosowania Ri-transformacji uzasadniaj¹ regeneracjê z kultur korzeni w³onikowatych ca³ych rolin, które zachowuj¹ genetyczn¹ stabilnoæ w trakcie kolejnych pasa¿y [4, 11, 17]. Co wiêcej, roliny takie uzyskuje siê równie¿ spontanicznie (bezporednio z korzeni, z pominiêciem formowania kalusa), co wyklucza ryzyko wyst¹pienia zmiennoci somaklonalnej [2, 17]. Interesuj¹c¹ metodê uzyskiwania transgenicznych rolin z wykorzystaniem transformacji przy u¿yciu A. rhizogenes przedstawili Crane i wspó³pracownicy [7] regeneruj¹c siewki z korzeni tumorowych tak zwanych rolin z³o¿onych/mieszanych (composite plants) Medicago trunculata. Roliny te z³o¿one z przetransformowanych korzeni w³onikowatych i pêdów dzikich rolin mog¹ byæ uprawiane ex vitro, co znacznie zmniejsza koszty ich hodowli, eliminuj¹c etap kultur tkankowych. Nale¿y podkreliæ, ¿e system composite plants umo¿liwia badanie ekspresji transgenów w korzeniach (ang. in root) w kontekcie ca³ej roliny i mog¹ byæ wykorzystywane w ró¿nych analizach funkcji genu i w badaniach dotycz¹cych interakcji rolina-patogen [7]. Jak widaæ z powy¿szego, stabilnoæ genetyczna korzeni Ri, która znajduje odzwierciedlenie w ich przewidywalnej produktywnoci uzasadnia ¿ywe zainteresowanie naukowców omawianym systemem transformacji. Stanowi on bowiem zarówno efektywne narzêdzie badañ podstawowych, jak i ród³o biologicznie cennych zwi¹zków. Do zalet podejcia wykorzystuj¹cego porednictwo A. rhizogenes zalicza siê, obok w³aciwoci samych korzeni w³onikowatych, ³atwoæ/prostotê techniki transformacji oraz stosunkowo krótki okres otrzymywania transgenicznych korzeni (kilka tygodni w porównaniu z 46 miesi¹cami wyprowadzania transgenicznych rolin po infekcji A. tumefaciens) [7]. Korzenie w³onikowate mog¹ syntetyzowaæ wiêcej ni¿ jeden metabolit, co sprawia, ¿e za Ri-transformacj¹ przemawiaj¹ równie¿ wzglêdy ekonomiczne [17]. Co wiêcej, poniewa¿ ka¿da wi¹zka korzeni pojawiaj¹ca siê w miejscu infekcji stanowi niezale¿ny transformant, z jednego eksplantatu z powodzeniem mo¿na wyprowadziæ du¿¹ liczbê niezale¿nych linii transgenicznych, daj¹cych w efekcie reprezentatywn¹ pulê osobników do dalszych analiz [17, 24]. Ryzogeneza (produkcja transformowanych korzeni przy wykorzystaniu A. rhizogenes) jest technik¹ relatywnie skuteczn¹. Ryzogeneza zosta³a uzyskana u wielu gatunków rolin, w tym tak¿e tych o du¿ym znaczeniu u¿ytkowym, jak np. Phaseolus vulgaris, Phaseolus acutifolius, Glycine max (L.) Merr., Trifolium pratense, Nicotiana tabacum, Pisum sativum, Medicago sativa, Vicia faba czy Lotus japonicus [24]. Powodzenie Ri-modyfikacji rolin zale¿y jednak od wielu czynników. Podobnie jak w przypadku A. tumefaciens, na skuteczny transfer T-DNA maj¹ wp³yw: genotyp rolin, dobór szczepu A. rhizogenes, gêstoæ (OD) inokulatu bakteryjnego, temperatura inokulacji, synteza przez rolinê induktorów fenolowych, wiek roliny donorowej oraz jej zdolnoæ do regeneracji [6, 26]. Nie bez znaczenia jest tak¿e sposób przeprowadzania inokulacji, parametry etapu kokultury czy metoda eliminacji bakterii po infekcji [38]. Warto zatem zauwa¿yæ, ¿e pomimo szerokiego wachlarza TRANSFORMACJA ROLIN ZA POREDNICTWEM AGROBACTERIUM RHIZOGENES 195 gatunków rolin, które mog¹ byæ poddane efektywnej Ri-transformacji, mo¿liwoci modyfikowania procedur w celu skutecznego i wydajnego transferu genów s¹ ograniczone. Poniewa¿ wydajnoæ transformacji w przypadku wielu gatunków rolin jest bardzo niska, prowadzone s¹ liczne badania nad ulepszeniem procedur transformacji, manipuluj¹c zarówno czynnikiem bakteryjnym, jak i gospodarzem rolinnym b¹d modyfikuj¹c parametry kokultury oraz uprawy [26]. ZWIÊKSZAJ¥C WYDAJNOÆ TRANSFORMACJI Obecnie podejmuje siê wiele prób ulepszenia istniej¹cych ju¿ lub opracowania nowych protoko³ów Ri-transformacji. Poni¿ej przedstawiono rezultaty badañ nad efektywnoci¹ indukcji korzeni tumorowych u wybranych gatunków. Nie ma w¹tpliwoci, ¿e jedn¹ z kluczowych kwestii wp³ywaj¹cych na wydajnoæ transferu genów jest dobór optymalnego szczepu A. rhizogenes. Pod wzglêdem wirulencji, szczepy agropinowe wydaj¹ siê przewa¿aæ nad pozosta³ymi typami bakterii tego gatunku. Wed³ug niektórych badaczy agropinowe szczepy 15834, A4 i LBA 9402 uwa¿ane s¹ za najbardziej wirulentne, jednak¿e ich zdolnoæ do transformacji wydaje siê zró¿nicowana w zale¿noci od gatunku infekowanej roliny [1,38]. Zró¿nicowanie pod tym wzglêdem stwierdzono podczas infekcji kilku gatunków Hyoscyamus piêcioma szczepami Agrobacterium: 1724, A4, 2659, 15834 i LBA 9402. Przyk³adowo, tylko w jednym przypadku (Hyoscyamus arachnoideus) szczep 15834 indukowa³ wzrost korzeni tumorowych z najwy¿sz¹ czêstotliwoci¹ [1]. Podobne rezultaty otrzymano transformuj¹c nale¿¹c¹ do tropikalnych rolin str¹czkowych Sesbania rostrata. Sporód czterech testowanych szczepów A. rhizogenes (15834, 2659, 1724, 8196) typ 2659 odznacza³ siê najwy¿szym potencja³em indukcyjnym, podczas gdy szczep 15834 indukowa³ powstawanie kalusa, ale nie korzeni [37]. Powy¿sze wyniki sugeruj¹ zatem: albo koniecznoæ korzystania z opracowanych ju¿ protoko³ów, rekomenduj¹cych dany szczep do transformacji danego gatunku roliny albo eksperymentaln¹ identyfikacjê szczepu o najwy¿szej wirulencji. Korzystaj¹c z wiedzy na temat transformacji rolin za porednictwem A. tumefaciens mo¿na tak¿e staraæ siê zwiêkszyæ wirulencjê A. rhizogenes stosuj¹c induktory chemiczne, takie jak: acetosyringon, kwas synapinowy, wanilinê, kwas wanilinowy czy monocukry (np. arabinoza, glukoza, ksyloza, galaktoza). Zalet¹ takiego podejcia jest jednoczesne poszerzanie spektrum podatnych na transformacjê danym szczepem gatunków rolin. Z przebadanych zwi¹zków fenolowych, do stymulacji procesu transferu genów najczêciej stosowany jest acetosyringon [17, 25, 38]. Wykazano, ¿e wzbogacenie nim po¿ywki dla kultur Alhagi pseudoalhagi piêciokrotnie zwiêkszy³o zdolnoæ transformacji szczepu A4 [38]. Obok Agrobacterium rhizogenes o powodzeniu transformacji decyduje przede wszystkim rolinny gospodarz. Wybór odpowiedniego eksplantatu (tkanki lub organu) w optymalnym stadium rozwojowym jest równie istotny, co dobór infekuj¹cego szczepu. Do transformacji wybiera siê zazwyczaj zdrowe, m³ode tkanki. Mog¹ to 196 K. HNATUSZKO-KONKA, P. £UCHNIAK, A. WIKTOREK-SMAGUR, A. GERSZBERG, T. KOWALCZYK, A. K. KONONOWICZ byæ licie lub ich fragmenty, siewki, pêdy, korzenie lub protoplasty, przy czym stosunkowo rzadko zdarza siê, ¿e tylko konkretna czêæ roliny jest podatna na transformacjê [38]. Badania prowadzone przez Fu i wsp. [13] wykaza³y, ¿e transformacja nale¿¹cej do rodziny astrowatych Saussurea involucrata z najwy¿sz¹ czêstotliwoci¹ zachodzi w tkankach korzeni w porównaniu z infekcj¹ blaszek i ogonków liciowych. Podobny wysoki potencja³ ryzogenezy (76,5%) zaobserwowano w eksplantatach korzeni Taraxacum platycarpum transformowanego szczepem 15834 A. rhizogenes, podczas gdy transformacja tkanek ³odygi i licieni zachodzi³a ze znacznie ni¿sz¹ czêstotliwoci¹, odpowiednio (32,7%) i (16,2%). Czynnikiem maj¹cym równie silny wp³yw na indukcjê wzrostu korzeni w³onikowatych jest zastosowane pod³o¿e. W przypadku niektórych rolin, po¿ywki zawieraj¹ce wysokie stê¿enia soli, jak np. MS (Murashige-Skoog) czy LS (Linsmaier-Skoog) wspomagaj¹ formowanie siê korzeni tumorowych [28, 30]. Dla odmiany, niska zawartoæ soli (np.w po¿ywce B5) faworyzuje wzrost bakterii, co utrudnia ich póniejsz¹ eliminacjê [14]. Co wiêcej, nadmierna proliferacja bakterii mo¿e hamowaæ indukcjê korzeni poprzez tzw. konkurencjê inhibicyjn¹ patogenów [17]. Wp³yw sk³adu po¿ywki na wzrost tumorowy mo¿e byæ zró¿nicowany. Przyk³adowo, Akramian i wsp. [1] indukcjê proliferacji prowadzili na dwóch pod³o¿ach (MS i B5). W ¿adnym z badanych przypadków nie odnotowali oni ró¿nic w indukcji korzeni w³onikowatych Hyoscyamus zale¿nych od u¿ytej po¿ywki [1]. Trzeba jednak podkreliæ, ¿e wp³yw sk³adu pod³o¿a niekoniecznie musi dotyczyæ indukcji korzeni w³onikowatych, ale ich póniejszego namna¿ania i wzrostu. Rutynowo u¿ywane po¿ywki zosta³y przetestowane pod k¹tem optymalizacji warunków wzrostu korzeni i skrócenia ich czasu podwajania biomasy (ang. biomass doubling time). Przyk³adowo, w badania nad Solanum tuberosum stwierdzono, ¿e media B5 i SH (SchenkHildebrandt), obok badanych MS i WM (White) najsilniej wspomagaj¹ namna¿anie korzeni tumorowych, a stosowanie po¿ywki B5 zapewnia podwojenie biomasy kultury tkankowej w ci¹gu 2,32 dnia [33, 34, 39]. Ponadto, opracowano liczne modyfikacje standardowych po¿ywek, wzbogacaj¹c je o ró¿ne zwi¹zki. Wród nich najczêciej stosowane s¹ ró¿ne stê¿enia sacharozy i azotu [17, 29]. Dla przyk³adu, w 2002 roku Lourenco i wsp. [29] opublikowali wyniki swoich badañ nad wp³ywem koncentracji wymienionych zwi¹zków na wzrost korzeni w³onikowatych Centaurea calcitrapa. Testowane w pod³o¿u SH stê¿enia sacharozy wynosi³y: 10, 30, 50, 70 i 100 g/L. Dokonane po piêtnastu dniach kultury pomiary uzyskanej biomasy wykaza³y stê¿enia sacharozy w przedziale 3050 g/L jako optymalne dla namna¿ania korzeni tumorowych. Podobnie analizowano wp³yw obecnoci szeregu stê¿eñ jonów amonowych i azotanów jako ród³a azotu (podstawowa po¿ywka SH powinna zawieraæ je w stê¿eniach: odpowiednio 2,6 i 24,7 mM). Zaobserwowany przyrost biomasy sugerowa³, ¿e najwy¿sz¹ przyswajalnoæ azotu uzyskuje siê wprowadzaj¹c do po¿ywki wy³¹cznie jony azotowe w koncentracji 24,7 mM [29]. Odmienn¹ kombinacjê sk³adników od¿ywczych zastosowali Alpizar i wsp. [2] w swoich badaniach nad proliferacj¹ korzeni Coffea arabica. Do standardowej po¿ywki MS wzbogaconej o cysteinê, pirydoksynê, tiaminê, glicynê oraz kwas nikotynowy wprowadzali w TRANSFORMACJA ROLIN ZA POREDNICTWEM AGROBACTERIUM RHIZOGENES 197 ró¿nych stê¿eniach auksyny (IBA, IAA i NAA) oraz sacharozê. Koncentracje sacharozy, pozwalaj¹ce na maksymalny przyrost biomasy korzeni ustalono na 12%. W przypadku egzogennych regulatorów wzrostu stwierdzono, ¿e ich obecnoæ jest jednym z podstawowych czynników warunkuj¹cych wzrost korzeni w³onikowatych (przy ich braku przyrost biomasy jest bardzo niski), a najbardziej po¿¹danym fitohormonem jest IBA w stê¿eniu 0,5 µM [2]. Powy¿sze przyk³ady jedynie sygnalizuj¹ zakres i rodzaj badañ prowadzonych nad wp³ywem ró¿nych czynników na efektywnoæ transformacji rolin za porednictwem A. rhizogenes. Nale¿y pamiêtaæ, ¿e warunki transferu genów zoptymalizowane dla danego gatunku nie musz¹ daæ pozytywnych wyników w przypadku innych, nawet blisko spokrewnionych gatunków (a nawet odmian). Dostêpnych jest jednak coraz wiêcej protoko³ów transformacji konkretnych gatunków, które mog¹ stanowiæ punkt wyjcia do opracowania procedur indukcji ryzosekrecji rolin pokrewnych. Przyk³adem mo¿e byæ opracowana przez Tao i wsp. [35] procedura transformacji Torenia fournieri z wykorzystaniem A. rhizogenes. Transformacjê przeprowadzono poprzez zanurzenie eksplantatów liciowych w zawiesinie bakteryjnej i kokultywacjê na pod³o¿u MS. Analizie poddany zosta³ wp³yw na indukcjê i proliferacjê korzeni takich czynników, jak: szczep Agrobacterium (oznaczano wirulencjê A4, R1000, R1601, R1205), czas infekcji (w przedziale od 5 do 20 minut), gêstoæ inokulum (testowany zakres od 0,5 do 1 przy OD600), czas kokultywacji (od 2 do 4 dni), obecnoæ lub brak acetosyringonu (w stê¿eniach 0, 10, 20, 30 i 40 µM/L), stê¿enie azotanu srebra (stê¿enia w zakresie 0,5 do 10 mg/L) oraz pH po¿ywki (testowane wartoci: 4,5; 5,5; 6,5; 7,5). Na podstawie czêstoci indukcji korzeni w³onikowatych ustalono optymaln¹ kombinacjê analizowanych parametrów, przy których czêstotliwoæ transformacji wynios³a 90% (rekomendowany szczep R1000, 15 minutowy czas infekcji, gêstoæ optyczna oko³o 1, 3-dniowy okres kokultywacji, acetosyringon w stê¿eniu 30 µM/L, po¿ywka MS o pH 6,5 z dodatkiem azotanu srebra w stê¿eniu 4 mg/L) [35]. Podobne badania przeprowadzone zosta³y dla Glycine max (L.) Merr. [6, 24]. Identyfikacja kluczowych dla transformacji soi parametrów jest szczególnie istotna, bior¹c pod uwagê fakt, ¿e reprezentuje ona trzeci¹ co do wielkoci rodzinê rolin wy¿szych Fabaceae. Nale¿y równie¿ podkreliæ, ¿e przedstawiciele tej rodziny zajmuj¹ drugie, za rolinami zbo¿owymi, miejsce na licie najwa¿niejszych rolin uprawnych [24]. Oczywiste jest zatem, ¿e opracowanie protoko³u otrzymywania rolin z³o¿onych (ang. composite plants) Glycine max (L.) Merr. wzbudzi³o szerokie zainteresowanie zarówno naukowców, jak i praktyków. Podobnie jak w przypadku Torenia fournieri, optymalna procedura transformacji soi jest wynikiem szeroko zakrojonych badañ nad poszczególnymi jej parametrami. Szczegó³owej analizie poddano miêdzy innymi znaczenie genotypu, wieku infekowanej roliny, gêstoci inokulum oraz temperatury uprawy. Czêstotliwoæ indukcji korzeni w³onikowatych w badanych wariantach metodologicznych pozwoli³a na identyfikacjê optymalnych parametrów. Wykazano, ¿e sporód dziesiêciu testowanych genotypów, najbardziej podatnym na transformacjê szczepem K599 A. rhizogenes jest Glycine max (L.) Merr. cv Zigongdongdou. Wykazano tak¿e, ¿e jednodniowe siewki tej odmiany stanowi¹ najlepszy materia³ do indukcji 198 K. HNATUSZKO-KONKA, P. £UCHNIAK, A. WIKTOREK-SMAGUR, A. GERSZBERG, T. KOWALCZYK, A. K. KONONOWICZ korzeni, która mo¿e byæ przeprowadzana przy 16 h fotoperiodzie zarówno przy temperaturach dnia i nocy 23/20oC, jak i 28/25oC. Jeli chodzi o gêstoæ inokulum bakteryjnego nie stwierdzono znacz¹cych ró¿nic w indukcji w przedziale od 0,2 do 1,2 OD600. Przy zastosowaniu zoptymalizowanych parametrów transformacja poprzez nak³uwanie ig³¹ w obszarze wêz³a licieni przynios³a u niemal 100% rolin z³o¿onych wzrost korzeni w³onikowatych [6]. W pracach nad optymalizacj¹ warunków transformacji badacze oceniaj¹ wp³yw nie tylko tych omówionych powy¿ej czynników, ale tak¿e innych, jak na przyk³ad badany przez Jian i wsp. wp³yw tzw. hodowli wstêpnej (ang. preculture). Opublikowane przez tych badaczy wyniki dowodz¹, ¿e dwudniowa kultura wstêpna (testowany przedzia³ czasowy 06 dni) eksplantatów Lotus corniculatus (fragmenty ³odygi z wêz³em) na pod³o¿u MS stymuluje proces transformacji zwiêkszaj¹c jej efektywnoæ [23]. Kumar i wsp. [25] potwierdzaj¹c istnienie ró¿nic pomiêdzy gatunkami rolin w czasowej podatnoci (ang. temporal competence) na transformacjê za porednictwem A. rhizogenes wykazali stymuluj¹cy wp³yw na efektywnoæ transformacji wstêpnego traktowania eksplantatów (kr¹¿ki liciowe Nicotiana tabacum) czynnikami fizycznymi (rêczne zranienie tkanki ig³¹, ultrasonikacja) lub chemicznymi (pektynaza, celulaza, acetosyringon lub chlorek wapnia). Najwiêkszy wzrost czêstotliwoci transformacji (ponad 4-krotny) w porównaniu z wynikami uzyskanymi po wstêpnym zranieniu eksplantatów za pomoc¹ ig³y preparacyjnej (kontrola, czêstotliwoæ transformacji = 21%) stwierdzono po transformacji w obecnoci acetosyringonu eksplantatów poddanych uprzednio sonikacji. Warto podkreliæ, ¿e po sonikacji eksplantatów w po³¹czeniu z maceracj¹ enzymatyczn¹ stwierdzono obni¿enie czêstotliwoci transformacji od 1,5- do 5,24-raza, w zale¿noci od rodzaju traktowania enzymatycznego. PODSUMOWANIE Postêp w rozwoju technologii korzeni w³onikowatych (transformowanych), jaki zosta³ dokonany w ostatnich latach, zas³uguje na najwy¿sz¹ uwagê genetyków i biologów molekularnych oraz biotechnologów. Technika transformacji genetycznej rolin za porednictwem Agrobacterium rhizogenes wykorzystywana jest obecnie zarówno w badaniach podstawowych, jak i aplikacyjnych. Korzenie transformowane wykorzystywane s¹ w genomice funkcjonalnej oraz opracowywaniu nowych technologii na potrzeby fitoremediacji oraz produkcji metabolitów wtórnych i rekombinowanych bia³ek o w³aciwociach biofarmaceutyków, enzymów diagnostycznych lub enzymów przemys³owych. U pod³o¿a tych aplikacji le¿¹ przede wszystkim unikalne w porównaniu z innymi rolinnymi kulturami in vitro w³aciwoci tych korzeni. Nie ulega w¹tpliwoci, ¿e biotechnologia dysponuje obecnie szerokim wachlarzem narzêdzi, który pozwoli w najbli¿szym czasie na pe³ne wykorzystanie potencja³u Agrobacterium rhizogenes. TRANSFORMACJA ROLIN ZA POREDNICTWEM AGROBACTERIUM RHIZOGENES 199 LITERATURA [1 AKRAMIAN M, TABATABAEI SMF, MIRMASOUMI M. Virulence of different strains of Agrobacterium rhizogenes on genetic transformation of four Hyoscyamus species. Amer-Eurasian J Agri Environ Sci 2008; 3: 759763. [2] ALPIZAR E, DECHAMP E, LAPEYRE-MONTES F, GUILHAUMON C, BERTRAND B, JOURDAN C, LASHERMES P, ETIENNE H. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of coffee (Coffea arabica): Conditions for long-term proliferation, and morphological and molecular characterization. Annal Bot 2008; 101: 929940. [3] AOKI S, SYONO K. The roles of Rirol and Ngrol genes in hairy root induction in Nicotiana debneyi. Plant Sci 2000; 159: 183189. [4] BASTIAN P, CHAVARRIA-KRAUSER A, ENGWER C, JAGER W, MARNACH S, PTASHNYK M. Modelling in vitro growth of dense root networks. J Theoret Biol 2008; 254: 99109. [5] BROOTHAERTS W, MITCHELL HJ, WEIR B, KAINES S, SMITH LMA, YANG W, MAYER JE, ROARODRIGUEZ C, JEFFERSON RA. Gene transfer to plants by diverse species of bacteria. Nature 2005; 433: 629633. [6] CAO D, HOU W, SONG S, SUN H, WU C, GAO Y, HAN T. Assessment of conditions affecting Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean. Plant Cell Tiss Organ Cult 2009; 96: 4552. [7] CHABAUD M, BOISSON-DERNIER A, ZHANG J, TAYLOR CG, YU O, BARKER DG. Agrobacterium rhizogenes-mediated root transformation. W: The Medicago truncatula handbook. Mathesius U, Journet EP, Sumner LW (eds). ISBN 0-9754303-1-9. http://www.noble.org/MedicagoHandbook/. [8] CHUNG SM, VAIDYA M, TZFIRA T. Agrobacterium is not alone: gene transfer to plants by viruses and other bacteria. Trends Plant Sci 2006; 1: 14. [9] CITOVSKY V, KOZLOVSKY SV, LACROIX B, ZALTSMAN A, DAFNY-YELIN M, VYAS S, TOVKACH A, TZFIRA T. Biological systems of the host cell involved in Agrobacterium infection. Cell Microbiol 2007; 9: 920. [10] COLLIER R, FUCHS B, WALTER N, LUTKE WK, TAYLOR CG. Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant J 2005; 43: 449457. [11] DORAN PM. Foreign protein production in plant tissue cultures. Curr Opin Biotechnol 2000; 11: 199 204. [12] ESTRADA-NAVARRETE G, ALVARADO-AFFANTRANGER X, OLIVERAS J-E, DIAZ-CAMINO C, SANTANA O, MURILLO E, GUILLEN G, SANCHEZ-GUEVERA N, ACOSTA J, QUINTO C, LI D, GRESSHOFF PM, SANCHEZ F. Agrobacterium rhizogenes Transformation of the Phaseolus spp.: A Tool for Functional Genomics. MPMI 2006; 19: 13851393. [13] FU C-X, ZHAO D-X , XUE X-F, JIN Z-P, MA FS. Transformation of Saussurea involucrata by Agrobacterium rhizogenes: Hairy root induction and syringin production. Process Biochem 2005; 40: 3789 3794. [14] GAMBORG OK, MILLER RA, OJIMA K. Nutrient requirement of suspension cultures of soybean cells. Exp Cell Res 1968; 50: 151158. [15] GELVIN SB. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the gene-jockeying tool. Microbiol Mol Biol Rev 2003; 67: 1637. [16] GELVIN SB. Agrobacterium in the Genomics Age. Plant Physiol 2009; 150: 16651676. [17] GIRI A, NARASU ML. Transgenic hairy roots: recent trends and applications. Biotech Adv 2000; 18: 1 22. [18] GUILLON S, TREMOUILLAUX-GUILLER J, PATI PK, RIDEAU M, GANTET P. Hairy root research: recent scenario and exciting prospects. Curr Opin Plant Biol 2006, 9: 341346. [19] HODGES LD, CUPERUS J, REAM W. Agrobacterium rhizogenes GALLS protein substitutes for Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 2004; 186: 30653077. [20] HODGES LD, LEE L-Y, McNETT H, GELVIN SB, REAM W. The Agrobacterium rhizogenes GALLS gene encodes two secreted proteins required for genetic transformation of plants. J Bacteriol 2009; 191: 355364. [21] HODGES LD, VERGUNST AC, NEAL-McKINNEY J, DULK-RAS A, MOYER DM, HOOYKAAS PJJ, REAM W. Agrobacterium rhizogenes GALLS protein contains domains for ATP binding, nuclear localization, and type IV secretion. J Bacteriol 2006; 188: 82228230. 200 K. HNATUSZKO-KONKA, P. £UCHNIAK, A. WIKTOREK-SMAGUR, A. GERSZBERG, T. KOWALCZYK, A. K. KONONOWICZ [22] HUFFMAN GA, WHITE FF, GORDON MP, NESTER EW. Hairy-root-inducing plasmid: Physical map and homology to tumor-inducing plasmids. J Bacteriol 1984; 157: 269276. [23] JIAN B, HOU W, WU C, LIU B, LIU W, SONG S, BI Y, HAN T. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of Superroot-derived Lotus corniculatus plants: a valuable tool for functional genomics. BMC Plant Biol 2009; 9: 78. [24] KERESZT A, LI D, INDRASUMUNAR A, NGUYEN CDT, NONTACHAIYAPOOM S, KINKEMA N, GRESSHOFF PM. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nat Protoc 2007; 2: 948952. [25] KUMAR V, SHARMA A, PRASAD BCN, GURURAJ HB, RAVISHANKAR GA. Agrobacterium rhizogenes mediated genetic transformation resulting in hairy root formation is enhanced by ultrasonication and acetosyringone treatment. Electr J Biotech 2006; 9: 349357. [26] LACROIX B, KOZLOVSKY SV, CITOVSKY V. Recent Patents on Agrobacterium-Mediated Gene and Protein Transfer, for Research and Biotechnology. Recent Patents on DNA & Gene Sequences 2008; 2: 6981. [27] LACROIX B, TZFIRA T, VAINSTEIN A, CITOVSKY V. A case of promiscuity: Agrobacterium's endless hunt for new partners. Trends Genet 2006; 22: 2937. [28] LINSMAIER EM, SKOOG F. Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures. Physiol Plant 1965; 18: 100127. [29] LOURENCO PML, DE CASTRO S, MARTINS TM, CLEMENTE A, DOMINGOS A. Growth and proteolytic activity of hairy roots from Centaurea calcitrapa: effect of nitrogen and sucrose. Enzyme Microb Tech 2002; 31: 242249. [30] MURASHIGE T, SKOOG F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 1962, 15: 473497. [31] RAKOCZY-TROJANOWSKA M. Alternative methods of plant transformation a short review. Cell Mol Biol Lett 2002; 7: 849858. [32] RAKOCZY-TROJANOWSKA M. Wprowadzanie genów do rolin.W: Malepszy S [red.] Biotechnologia Rolin. PWN Warszawa 2007: 233246. [33] SCHENK RU, HILDERBRANDT. AC. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous plant cell cultures. Can J Bot 1972; 50: 199204. [34] SUNIL KUMAR GB, GANAPATHI TR, STRINIVAS L, REVATHI CJ, BAPAT, VA. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Sci 2006; 170: 918925. [35] TAO J, LI L. Genetic transformation of Torenia fournieri L. mediated by Agrobacterium rhizogenes. S Afr J Bot 2006; 72: 211216. [36] TZFIRA T, CITOVSKY V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Curr Opin Biotechnol 2006; 17: 147154. [37] VAN DE VELDE W, MERGEAY J, HOLSTERS M, GOORMACHTIG S. Agrobacterium rhizogenesmediated transformation of Sesbania rostrata. Plant Sci 2003; 165: 12811288. [38] WASILEWSKA A, KRÓLICKA A. Otrzymywanie i charakterystyka kultur korzeni w³onikowatych. Biotechnologia 2005; 4: 173188. [39] WHITE PR. The Cultivation of Animal and Plant Cells. The Ronald Press, New York, 1963: 228 ss. [40] WHITE FF, NESTER EW. Hairy Root: Plasmid encodes virulence TrqKts in Agrobacterium rhizogenes. J Bacteriol 1980; 141: 11341141. [41] WHITE FF, NESTER EW. Relationship of plasmids responsible for hairy root and crown gall tumorigenicity. J Bacteriol 1980; 144: 710720. [42] ZUPAN JR, MUTH TR, DRAPER O, ZAMBRYSKI P. The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: A feast of fundamental insights. Plant J 2000; 23: 1128. Prof. dr hab. Andrzej Kiejstut Kononowicz, Katedra Genetyki Ogólnej, Biologii Molekularnej i Biotechnologii Rolin, Uniwersytet £ódzki ul. Banacha 12/16, 90-237 £ód e-mail: [email protected]
