Rafał Świerzewski
Transkrypt
Rafał Świerzewski
Mgr Rafał Świerzewski „Właściwości lizozymu w warunkach zatłoczenia makromolekularnego” Promotor: Prof. dr hab. Wojciech Zielenkiewicz Celem pracy było określenie wpływu zatłoczenia makromolekularnego na trwałość struktury białka w środowisku wodnym w układzie białko (lizozym) – czynnik zatłaczający (polimery - glikole polietylenowe o masach cząsteczkowych 6000, 10000 i 20000) poprzez zastosowanie metod kalorymetrycznych, densymetrycznych i spektroskopii fluorescencyjnej. W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono występowanie zależności pozornych, molowych objętości lizozymu, V2Φ (298K ) , oraz nadmiarowych pojemności cieplnych, ΔCp(298K), od masy cząsteczkowej oraz stężenia dodanego do roztworu polimeru. W najmniejszym stopniu zależności te są obserwowane dla PEG 6000; natomiast w przypadku PEG 10000 i 20000 zależności te są wyraźne, szczególnie gdy stężenie tych glikoli polietylenowych osiągnie wartość 8 – 10 g·dm-3. W celu wyjaśnienia zaobserwowanych zmian przeprowadzono badania metodą spektroskopii fluorescencyjnej. Ich wyniki zinterpretowano przyjmując podział chromoforów (tryptofanów) w cząsteczce lizozymu na dwie grupy: a) na powierzchni cząsteczki oraz b) wewnątrz cząsteczki badanego białka. Wykazano, że w miarę wzrostu stężenia PEG 20000 maksimum intensywność fluorescencji lizozymu, I0,max, maleje. Charakterystyczny punkt zmiany trendu zależności I0,max=f(%PEG) jest zgodny z zaobserwowanym dla zależności pozornej, molowej objętości lizozymu, V2Φ (298K ) i pojemności cieplnych, ΔCp(298K), od stężenia tego polimeru, w tych samych warunkach temperatury, ciśnienia oraz pH. Wskazuje to na występowanie zmian w otoczce hydratacyjnej białka w miarę wzrostu zatłoczenia makromolekularnego. Badania procesu denaturacji lizozymu spowodowanego wzrostem temperatury w warunkach zatłoczenia makromolekularnego, prowadzone były z wykorzystaniem adiabatycznej, różnicowej kalorymetrii skaningowej. Stwierdzono, że procesy denaturacji białka są procesami dwustanowymi. Wykazano to uzyskując zgodność pomiędzy kalorymetrycznie wyznaczonymi wartościami zmian entalpii denaturacji lizozymu, ΔH NU , a obliczonymi wartościami zmian entalpii van’t Hoffa, ΔHvH,. Wyznaczone wartości temperatur przemiany konformacyjnej, Tm, w zależności od stężenia i masy cząsteczkowej dodanego PEG wskazują na zmiany trwałości struktury białka. Natomiast brak zmian w wartościach ΔH NU występujących w przemianach konformacyjnych wskazuje na entropowy charakter przemiany.