Walidacja metod analitycznych

Kierunki rozwoju chemii analitycznej
oznaczanie coraz niŜszych stęŜeń
Walidacja metod analitycznych
Raport z walidacji
Małgorzata Jakubowska
Katedra Chemii Analitycznej WIMiC AGH
w próbkach o złoŜonej matrycy
przy bardzo małej objętości próbki
Problem:
kontrola i zapewnienie jakości uzyskiwanych wyników
Elementy systemów jakości
stosowanie odpowiedniej atestowanych metod
analitycznych (walidacja metod)
prowadzenie analiz w profesjonalny sposób (laboratoria
akredytowane)
stosowanie wzorców i materiałów odniesienia o znanym
składzie i czystości
systematyczna kontrola uzyskiwanych wyników pomiarów.
Przykłady rozrzutu wyników analitycznych obserwowane
w porównaniach międzylaboratoryjnych na przestrzeni
kilkunastu lat
Materiał
Pierwiastek
Olej opałowy
Węgiel
Mleko w
proszku
IAEA A-11
Mleko w
proszku
IAEA A-11
Liście tytoniu
typu Oriental
CTA-OTL-1
Wnioski
rozstęp wyników dostarczonych przez laboratoria
uczestniczące w porównaniach międzylaboratoryjnych
często sięga kilku rzędów wielkości
za tak znaczny rozrzut wyników odpowiedzialne są błędy
analityczne.
Ag
Hg
K
Cd
Co
Cr
Ni
Pb
Cr
Cs
Na
Pb
Liczba
Rozstęp wyników
laboratoriów
4
0,006 – 0,1 µg/g
4
0,005 – 0,4 µg/g
8
20 – 22000 µg/g
8
1,10 – 1660 ng/g
18
0,004 – 51,5 µg/g
16
0,016 – 1160 µg/g
4
22,1 – 500 ng/g
4
43 – 300 ng/g
43
17
43
40
0,038 – 11,6 µg/g
0,117 – 11,6 µg/g
48,2 – 8083 µg/g
0,051 – 19,5 µg/g
Rok
1973
1974
1980
1987
1992
Ilustracja pojęć:
zasada pomiaru,
metoda
analityczna oraz
postępowanie
analityczne
1
Walidacja metod analitycznych
(według ISO)
to proces ustalania parametrów charakteryzujących
sprawność działania i ograniczeń metody oraz sprawdzenie
jej przydatności do określonych celów.
Podczas wykonywania walidacji naleŜy:
określić, które parametry
powinny być wyznaczone
wyznaczyć wartości tych parametrów
charakteryzujące
metodę
na tej podstawie określić czy metoda spełnia stawiane jej
wymagania związane z zamierzonym zastosowaniem
wyników analitycznych.
W efekcie wykonania walidacji moŜna uzyskać pewność, Ŝe
proces analizy przebiega w sposób rzetelny i precyzyjnie
oraz daje wiarygodne wyniki.
Walidację wykonujemy gdy:
Warunki uzyskania wiarygodnych wyników walidacji:
opracowywana jest nowa metoda analityczna
stosowanie substancji porównawczych i pomocniczych o
odpowiedniej, znanej czystości (certyfikowane)
prowadzone są próby rozszerzenia zakresu stosowalności
znanej metody analitycznej (np. do oznaczania znanego
analitu do próbek o innej matrycy)
kontrola jakości stosowanej metody wykazała zmienność jej
parametrów w czasie
dana metoda analityczna ma być wykorzystywana w innym
laboratorium
stosowanie sprawdzonej aparatury
wykonanie badań przez personel o odpowiednich
kwalifikacjach
dokumentowanie kaŜdego etapu procesu walidacyjnego.
przeprowadza się porównanie danej metody z inną metoda
odniesienia.
Proces walidacji składa się zazwyczaj z następujących etapów:
określenie przeznaczenia metody analitycznej i jej zakresu,
definicja testowanych parametrów analitycznych oraz
kryteria akceptacji,
opracowanie planu eksperymentów walidacyjnych,
sprecyzowanie charakterystyki sprzętu,
przygotowanie wzorców oraz odczynników,
eksperymenty walidacyjne z ewentualną korektą parametrów
metody,
obliczenia, interpretacja wyników,
sprawdzenie kryteriów akceptacji,
opracowanie standardowej procedury operacyjnej dla
badanej metodyki,
określenie kryteriów rewalidacji,
sporządzenie raportu.
Parametry brane pod uwagę podczas walidacji:
specyficzność/selektywność
precyzja (powtarzalność i odtwarzalność)
dokładność
zakres metody
liniowość
granica wykrywalności
granica oznaczalności
elastyczność.
2
Przeprowadzenie procesu walidacji wymaga zastosowania:
Specyficzność/selektywność:
ślepych próbek ( w tym takŜe ślepych próbek
odczynnikowych)
specyficzność - jedynie analit jest źródłem niezakłóconego
sygnału analitycznego, zaś interferencje nie występują
roztworów wzorcowych (roztworów kalibracyjnych, próbek
testowych)
selektywność - zdolność jednoznacznego określenia
substancji analizowanej w obecności składników, które
mogą być zawarte w próbce, np. substancji pomocniczych,
zanieczyszczeń, itd.
próbek ze znaną ilością dodanego analitu (wzbogaconych
w analit)
powtórzeń pomiaru
analizy statystycznej zbiorów wyników.
badanie prowadzimy dla próbki zawierającej testowany
składnik (test pozytywny) i próbki nie zawierającej
analizowanej substancji (test negatywny).
W przypadku, gdy nie jest moŜliwe udowodnienie specyficzności/selektywności
danej metody analitycznej, naleŜy zastosować kombinację dwu lub więcej
metod analitycznych by osiągnąć odpowiedni poziom pewności; muszą to być
metody niezaleŜne, dobrze scharakteryzowane.
Precyzja:
Powtarzalność :
stopień zgodności między pojedynczymi wynikami analizy
(rozrzut wyników), gdy dana procedura jest stosowana dla
wielokrotnie powtarzanych, niezaleŜnych oznaczeń
jednorodnej próbki
wyraŜa precyzję oznaczeń wykonanych w krótkim odstępie
czasu, przez tego samego analityka i w tych samych
warunkach (te same odczynniki, ten sam sprzęt)
najczęściej miarą precyzji jest odchylenie standardowe S,
względne odchylenie standardowe RSD lub współczynnik
zmienności CV
naleŜy wykonać minimum 6 powtórzeń dla poziomu
stęŜenia 100% lub po trzy powtórzenia dla kaŜdego z
minimum trzech poziomów stęŜeń w zakresie metody
(zalecane 50 – 150% nominalnego stęŜenia)
obejmuje dwa pojęcia: powtarzalność i odtwarzalność.
Kryteria akceptacji
CV wyników zawartości składnika głównego nie powinno być
większe niŜ 3%
CV wyników oznaczania zawartości składników na poziomie
śladowym nie powinno być większe niŜ 15%.
Odtwarzalność:
pozwala ocenić, czy metoda prowadzi do tych samych
rezultatów w róŜnych laboratoriach z róŜnymi analitykami,
na innym sprzęcie i w innych warunkach, z zachowaniem
parametrów wymaganych w opisie metody
badania są prowadzone analogicznie jak w przypadku
powtarzalności
wyznacza się wartość średnią, przedział ufności, odchylenie
standardowe, względne odchylenie standardowe oraz
współczynnik zmienności uzyskanych wyników.
wyznacza się wartość średnią, przedział ufności,
odchylenie
standardowe,
względne
odchylenie
standardowe oraz współczynnik zmienności uzyskanych
wyników.
Dokładność:
zgodność między wartością rzeczywistą (zawartością,
stęŜeniem) a wartością będącą wynikiem analizy
miarą dokładności metody analitycznej jest wielkość jej
błędu systematycznego
metoda niedokładna moŜe być obarczona błędem
systematycznym stałym (niezaleŜnym od poziomu
zawartości oznaczanego składnika) i zmiennym (zaleŜnym
od stęŜenia oznaczanego składnika)
powinna być oszacowana na podstawie minimum 9
wyników oznaczeń dla minimum trzech róŜnych poziomów
stęŜeń z badanego zakresu (np. trzykrotne oznaczenie dla
trzech poziomów)
najczęściej wynik przedstawia się jako błąd bezwzględny
lub względny.
3
Szacowanie dokładności metody :
przez analizę próbki o znanym stęŜeniu (np. certyfikowany
materiał odniesienia) i porównanie wyników uzyskanych
walidowaną metodą z wartością prawdziwą
przez porównanie wyników uzyskanych walidowaną metodą
z wynikami otrzymanymi metodą odniesienia, której
dokładność jest znana
Dokładność moŜe być przedstawiona
odzysku, który oblicza się wg wzoru:
xi
µ
jako
procent
*100%, gdzie
xi – oznaczona ilość analitu w badanej próbce,
µ- znana ilość analitu w badanej próbce
przez dodanie znanej ilości analitu do badanego produktu, a
następnie jego oznaczenie sprawdzaną metodą.
Kryteria akceptacji
Odzysk powinien wynosić 95 – 105% w przypadku składnika
głównego i 80 – 120% dla składników na poziomie śladowym
(wartości te zaleŜą między innymi od stęŜenia analitu w
badanej próbie i metody badania).
Precyzja i dokładność metod analitycznych
a) metoda dokładna i precyzyjna
b) metoda precyzyjna ale mało dokładna
c) metoda mało precyzyjna ale dokładna
d) metoda mało dokładna i mało precyzyjna
Kryterium akceptacji:
w przypadku oznaczania substancji głównej współczynnik r
powinien być większy od 0,995, w przypadku oznaczania
śladów powinien być większy od 0,98.
Granica wykrywalności (DL)
jest to najmniejsza ilość (stęŜenie) badanej substancji w
próbce, które moŜe być wykryta, lecz niekoniecznie
oznaczona z odpowiednią dokładnością.
Liniowość:
0,30
y = 0,0085x + 0,00235
r = 0,99662
0,25
y,zmierzony sygnał
Liniowość:
zdolność do uzyskiwania wyników pomiaru analitycznego
wprost proporcjonalnych do stęŜenia (zawartości) substancji
oznaczanej w próbce, w określonym zakresie – zgodnie z
wyznaczonym równaniem matematycznym y = ax+b
zaleŜność między obu zmiennymi charakteryzuje
współczynnik korelacji r
liniowość wykazuje się przez analizę próbek o stęŜeniach
analitu, obejmujących deklarowany zakres stęŜeń metody
naleŜy wykonać badanie minimum 5-ciu serii wzorców (3-6
powtórzeń), których stęŜenia obejmują 80-120% stęŜenia
spodziewanego w próbce.
Granica oznaczalności (QL)
jest to najmniejsza ilość (stęŜenie) badanej substancji w
próbce, jaka moŜe być ilościowo oznaczona z odpowiednią
precyzją i dokładnością.
0,20
0,15
0,10
DL =
0,05
3 .3 * S
b
QL =
10 * S
b
0,00
0
20
40
60
80
100
120
S – odchylenie standardowe ślepej próby
x,odwaŜka badanej próbki [mg]
b – nachylenie prostej kalibracji
4
Zakres:
Elastyczność (stabilność metody):
przedział między minimalną i maksymalną zawartością
(stęŜeniem) substancji aktywnej w badanej próbie, w
którym metoda analityczna ma odpowiednią liniowość,
dokładność i precyzję.
badanie elastyczności metody powinno udowodnić
niezawodność analizy po wprowadzeniu niewielkich
celowych zmian parametrów metody
Minimalny zakres stosowania metody analitycznej powinien
wynosić (kryteria akceptacji):
jeśli pomiar jest wraŜliwy na zmianę warunków
analitycznych, warunki te powinny być odpowiednio
kontrolowane lub dokładnie opisane w procedurze.
dla zawartości substancji głównej – od 80% do 120%
deklarowanej ilości analitu w badanej próbie
w przypadku oznaczania substancji na poziomie
śladowym zakres powinien wynosić od 10% do 120%
maksymalnej dopuszczalnej zawartości tej substancji
określonej w specyfikacji.
Raport walidacyjny
Raport z walidacji metod analitycznych (wykonany po
zakończeniu prac laboratoryjnych) powinien zawierać:
przedmiot i zakres walidacji
rodzaj oznaczanych związków i matrycy
opis metody
kryteria akceptacji
stosowane odczynniki, substancje porównawcze i wzorce
opis aparatury (producent, typ)
względy bezpieczeństwa
parametry pomiaru
opis przeprowadzonego eksperymentu
postępowanie statystyczne i obliczenia
reprezentatywne wykresy
kryteria rewalidacji
podsumowanie i wnioski.
Raport walidacyjny
1. Oznaczana metoda analityczna
Raport walidacyjny
2. Wybór optymalnych warunków pomiaru
ogólne informacje o metodzie i zastosowanej
aparaturze z podaniem jej typu
badania jakie wykonano w celu określenia
optymalnych warunków pomiaru
roztwory wzorcowe
parametry podlegające modyfikacji
rozwory badane
wykonanie pomiaru.
wyniki osobno dla kaŜdego zmienianego parametru (w
tabeli – wartość parametru, wyniki – np. 7 powtórzeń,
średnia, odchylenie standardowe)
wnioski.
5
Raport walidacyjny
Przykład: Dobór optymalnego przepływu acetylenu (fragment
tabeli wyników)
Numer
poziomu
Absorbancja
2
0.051
0.052
0.050
0.047
0.049
4
0.076
0.077
0.080
0.077
0.078
Średnia
absorbancja
Odchylenie
standardowe
Raport walidacyjny
3. ZałoŜenia walidacyjne
3.1. Specyficzność/selektywność
opis pomiarów jakie naleŜy wykonać
wymagane wzorce wraz z określeniem stęŜeń
sposób obliczenia wyniku
kryterium akceptacji.
3.2. Powtarzalność
3.3. Precyzja pośrednia
3.4. Dokładność
3.5. Liniowość
3.6. Zakres metody
3.7. Granica oznaczalności.
Raport walidacyjny
4. Wyniki testów walidacyjnych
4.1. Specyficzność/selektywność
opis pomiarów jakie wykonano
lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem
stęŜeń
wyniki pomiarów
wyniki obliczeń
informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
Raport walidacyjny
Przykład. Badanie wpływu Na na wynik oznaczenia Ca
metodą ASA.
Stosunek
stęŜeń
Na:Ca
Średnia
absorbancja
0:1
0.163
0.000
1:10
0.159
0.004
1:5
0.165
0.002
1:2
0.168
0.005
1:1
0.169
0.006
10:1
0.186
0.023
4.2. Powtarzalność
opis pomiarów jakie wykonano
lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem
stęŜeń
Kryterium
akceptacji
0.006
Raport walidacyjny
4. Wyniki testów walidacyjnych
RóŜnica średnich
absorbancji wzorca bez
dodatku Na i wzorca z
dodatkiem Na
Raport walidacyjny
Przykład. Badanie powtarzalności oznaczania Ca metodą
ASA.
StęŜe
nie
[mg/l]
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
1
0.067 0.068 0.071 0.070 0.069 0.071 0.070
0.110 0.107 0.110 0.107 0.109 0.110 0.109
wyniki pomiarów
2
wyniki obliczeń
3
informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
4
A
S
CV
[%]
5
7.5
6
Raport walidacyjny
Raport walidacyjny
4. Wyniki testów walidacyjnych
4.2. Precyzja pośrednia
tak jak powtarzalność ale dwóch róŜnych dniach
4. Wyniki testów walidacyjnych
4.4. Dokładność
opis pomiarów jakie wykonano
lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem
stęŜeń
wyniki pomiarów
obliczony wynik wraz z podaniem poziomu
niepewności
pozostałe wyniki obliczeń
informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
Raport walidacyjny
Raport walidacyjny
Przykład. Badanie dokładności oznaczeania Ca metoda
ASA.
StęŜenie
[mg/l]
Absorbancja
2.5
0.134
0.132
0.133
0.132
0.133
4.5
Średnia
absorbancja
Średnie
stęŜenie
Stopień
odzysku [%]
0.226
0.228
0.224
0.225
0.228
4. Wyniki testów walidacyjnych
4.5. Liniowość
opis pomiarów jakie wykonano
lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem
stęŜeń
wyniki pomiarów
wyniki obliczeń (współczynniki prostej kalibracji,
współczynnik korelacji)
wykres prostej kalibracji
informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
Prosta kalibracji: y=0.0485x+0.0075
Raport walidacyjny
Przykład. Badanie liniowości oznaczania Ca metodą ASA.
Raport walidacyjny
4. Wyniki testów walidacyjnych
4.6. Zakres metody
StęŜenie [mg/l]
Średnia absorbancja
0
0.000
1
0.059
2
0.109
3
0.154
4
0.203
5
0.250
7.5
0.368
informacja jak obliczono zakres metody
uzyskany wynik (tj. zakres)
informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
7
Raport walidacyjny
4. Wyniki testów walidacyjnych
4.7. Granica oznaczalności
informacja jak obliczono granicę oznaczalności
uzyskany wynik (tj. DL)
informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
Raport walidacyjny
5. Wnioski końcowe
informacja czy walidacja została zakończona
wynikiem pozytywnym i metoda moŜe być
stosowana.
KONIEC RAPORTU
Wykonał: xxx
Dziękuję za uwagę!
8