Gruźlica lekooporna typu MDR, pre-XDR i XDR w

PRACA ORYGINALNA
Monika Kozińska 1, Anna Brzostek 2, Dorota Krawiecka 3, Małgorzata Rybczyńska 4, Zofia Zwolska 1,
Ewa Augustynowicz-Kopeć1
1
Zakład Mikrobiologii, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc w Warszawie
Kierownik: prof. nadzw. dr hab. n. med. Ewa Augustynowicz-Kopeć
2
Pracownia Genetyki i Fizjologii Mycobacterium, Instytut Biologii Medycznej PAN w Łodzi
3
Zakład Diagnostyki Mikrobiologicznej, Kujawsko-Pomorskie Centrum Pulmonologii w Bydgoszczy
4
Specjalistyczny Szpital Gruźlicy Chorób Płuc i Rehabilitacji w Tuszynie
Gruźlica lekooporna typu MDR, pre-XDR i XDR w Polsce
w latach 2000–2009
MDR, pre-XDR and XDR drug-resistant tuberculosis in Poland in 2000–2009
Praca finansowana z grantu nr R1302103
Abstract
Introduction: Tuberculosis (TB) is a curable disease and its spread can be prevented by using appropriate diagnostic
methods and effective treatment. The obstacle to the rapid eradication of the disease from a population may be strainsresistant to essential and most effective antibiotics. In many places in the world MDR, pre-XDR and XDR-TB was reported.
These forms of TB do not respond to the standard six-month treatment with first-line anti-TB drugs and the therapy should be
conducted two years or more with drugs that are less potent, more toxic and much more expensive.
Material and methods: This study included MDR-TB strains isolated from 297 patients in 2000–2009. To determine the
XDR-TB population structure, the 19 isolates were genotyped by spoligotyping and MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed
repetitive units-variable number of tandem repeats) method.
Results: Among 297 MDR-TB cases, 36 (12.1%) were pre-extensively drug-resistant (pre-XDR), 19 (6.4%) were XDR and
1 (0.3%) was pre-totally drug-resistant (pre-TDR). Four of the 19 XDR isolates exhibit a unique spoligopattern, while the rest
15 belonged to one of 5 clusters. The MIRU-VNTR analysis reduced the number of clustered isolates to 11.
Conclusions: The study documented the emergence of pre-extensively and extensively drug-resistant tuberculosis in
Poland among patients with multidrug-resistant TB. Genotyping methods showed clonal similarity among XDR strains and
may suggest the possible transmission among patients with newly diagnosed and with recurrent TB.
Key words: MDR-TB, pre-XDR-TB, XDR-TB, spoligotyping, MIRU-VNTR
Pneumonol. Alergol. Pol. 2011; 79, 4: 278–287
Streszczenie
Wstęp: Gruźlica jest chorobą wyleczalną i można zapobiegać jej rozprzestrzenianiu się, stosując odpowiednie metody
diagnostyczne oraz skuteczną terapię. Zagrożeniem dla szybkiej i skutecznej eliminacji choroby z populacji są szczepy oporne
na podstawowe i najbardziej skuteczne leki przeciwprątkowe. Coraz częściej szczepy typu MDR nabywają dodatkowej
oporności i osiągają postać o oporności pre-XDR oraz XDR. Takie przypadki są już rejestrowane w wielu miejscach na
świecie. Gruźlica wielolekooporna jest trudniejsza do wyleczenia niż gruźlica lekowrażliwa. Chorzy nie wracają do zdrowia po
zastosowaniu standardowego 6-miesięcznego schematu leczenia, ale muszą być poddani długotrwałej terapii opartej na
przyjmowaniu leków mniej skutecznych, bardziej toksycznych i droższych.
Materiał i metody: Poddano analizie 297 chorych na gruźlicę, od których w latach 2000–2009 wyhodowano szczepy
o oporności MDR. Genomowe DNA tych szczepów wykorzystano do analizy molekularnej, w której zastosowano dwie
metody genotypowania: spoligotyping oraz MIRU-VNTR.
Adres do korespondencji: prof. nadzw. dr hab. n. med. Ewa Augustynowicz-Kopeć, Zakład Mikrobiologii Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc, ul. Płocka 26,
01–138 Warszawa, tel./faks: 22 43 12 182, e-mail: [email protected]
Praca wpłynęła do Redakcji: 16.11.2010 r.
Copyright © 2011 Via Medica
ISSN 0867–7077
278
www.pneumonologia.viamedica.pl
Monika Kozińska i wsp., Gruźlica lekooporna typu MDR, pre-XDR i XDR w Polsce w latach 2000–2009
Wyniki: Wśród badanych 297 chorych na gruźlicę MDR zidentyfikowano u 36 chorych (12,1%) na gruźlicę pre-XDR,
19 (6,4%) na gruźlicę XDR i jednego chorego (0,3%) na gruźlicę pre-TDR. Spośród 19 szczepów o oporności XDR 4 posiadały
odmienne wzory molekularne w analizie spoligotyping, a 15 szczepów tworzyło 5 grup, z których każda miała charakterystyczny, odrębny spoligotyp. Dalsze typowanie metodą MIRU-VNTR szczepów o oporności XDR wykazało, że można wyodrębnić tylko 3 grupy o tym samym wzorze DNA — utworzyło je 11 analizowanych szczepów.
Wnioski: Niniejsza praca dowiodła obecności na terenie Polski szczepów o oporności pre-XDR i XDR. Wykorzystane metody
typowania wskazały, że wśród 19 szczepów XDR 11 (57,9%) posiadało te same wzory DNA. Wśród chorych, od których
wyizolowano jednakowe szczepy prątków, były przypadki wznowy gruźlicy i zachorowania nowe, co może świadczyć
o aktywnej transmisji oporności XDR w Polsce.
Słowa kluczowe: MDR-TB, pre-XDR-TB, XDR-TB, spoligotyping, MIRU-VNTR
Pneumonol. Alergol. Pol. 2011; 79, 4: 278–287
Wstęp
Wyniki badań epidemiologicznych wykazały,
że wśród czynników zwiększających ryzyko zakażenia prątkiem gruźlicy lub zachorowania na gruźlicę po zakażeniu są czynniki społeczno-ekonomiczne, w tym przede wszystkim bieda i związane z nią złe warunki mieszkaniowe i niedożywienie, a także bezdomność, uzależnienia (alkohol,
papierosy, narkotyki), oraz czynniki biologiczne:
podeszły wiek, choroby prowadzące do osłabienia
odpowiedzi immunologicznej, leczenie immunosupresyjne. Szczególnie wysokie ryzyko zachorowania na gruźlicę występuje u zakażonych wirusem HIV [1, 2].
Obecnie, mimo dostępności nowoczesnych
metod prewencji obejmujących diagnostykę i leczenie, największym niebezpieczeństwem w realizacji programów zwalczania tej choroby jest zjawisko lekooporności prątków. Coraz częściej szczepy typu MDR (multidrug-resistant) nabywają dodatkowej oporności i osiągają postać o oporności
pre-XDR (pre-extremely drug-resistant) oraz XDR
(extremely drug-resistant) [3, 4]. Definicje gruźlicy
wielolekoopornej podano w tabeli 1.
Gruźlicę wywołaną przez prątki wielolekooporne należy podejrzewać w każdym przypadku
niepowodzenia leczenia standardowego [5, 6].
Przyczyną lekooporności MDR jest monoterapia,
spowodowana na przykład dodaniem pojedynczego leku w przypadkach nieskuteczności wcześniejszego leczenia oraz nieregularne, okresowe przyjmowanie leków przeciwprątkowych, co skutkuje
zbyt niskim stężeniem poszczególnych leków
w tkankach chorego. Stężenia suboptymalne leków
przeciwprątkowych uniemożliwiają ich działanie
bójcze na populację prątków w zmianach chorobowych, co sprzyja mnożeniu się zmutowanych
prątków opornych na działanie tych leków. Obecnie trwają badania, które mają sprawdzić hipotezę, czy pewne wzory molekularne prątków gruźlicy predysponują je do szybszego nabywania mutacji związanych z lekoopornością.
Rozprzestrzenianiu się gruźlicy wielolekoopornej na świecie sprzyja imigracja ludności głównie z krajów rozwijających się oraz transmisja
Tabela1. Definicje gruźlicy lekoopornej
Table 1. Definitions of drug-resistant tuberculosis
Oporność Mycobacterium tuberculosis na leki
Mycobacterium tuberculosis drug resistance
Typ oporności
Type of resistance
INH + RMP
INH + RMP + SM
MDR
INH + RMP + EMB
INH + RMP + SM + EMB
MDR + fluorochinolon + jeden z leków podawanych iniekcyjnie (amikacyna lub kanamycyna lub kapreomycyna)
MDR + fluoroquinolone + one of the injectable drugs (amikacin or kanamycin or kapreomycin)
MDR + fluorochinolon lub MDR + jeden z leków podawanych iniekcyjnie (amikacyna lub kanamycyna lub kapreomycyna)
MDR + fluoroquinolone or MDR + one of the injectable drugs (amikacin or kanamycin or kapreomycin)
INH + RMP + SM + EMB + fluorochinolon + aminoglikozyd + polipeptyd + tioamid + cykloseryna + kwas paraaminosalicylowy
INH + RMP + SM + EMB + fluoroquinolone + aminoglycoside + polypeptide + tioamide + cycloserine + paraaminosalicylic acid)
www.pneumonologia.viamedica.pl
XDR
pre-XDR
TDR
279
Pneumonologia i Alergologia Polska 2011, tom 79, nr 4, strony 278–287
w tak zwanych populacjach zamkniętych, do których należą więźniowie, bezdomni, pensjonariusze domów opieki społecznej oraz chorzy zakażeni wirusem HIV [7–12].
Według raportu Światowej Organizacji Zdrowia (WHO, World Health Organization) szacuje się,
że w 2008 roku na świecie było prawie 400 000
przypadków zachorowań na gruźlicę wielolekooporną (MDR-TB, multidrug-resistant tuberculosis)
co stanowiło około 3,6% wszystkich chorych na
gruźlicę. Wśród MDR-TB zarejestrowano 5,4%
przypadków gruźlicy z lekoopornością wielolekową o rozszerzonej oporności prątków (XDR-TB,
extensively drug-resistant tuberculosis), a obecność
szczepów o tej oporności odnotowano do 2009 roku
w 58 krajach na świecie.
Największy udział w gruźlicy MDR miały kraje
nieuprzemysłowione (85% wszystkich chorych
MDR-TB), a wśród nich prawie 50% zachorowań
miało miejsce w Chinach i Indiach. W grupie szczepów o oporności MDR odnotowano w 2007 roku
w Chinach 7,2% szczepów XDR, w 2008 roku w
Estonii i Japonii odpowiednio 12,5% i 14,8%, a w
2009 roku 21% w Tadżikistanie [13]. W Polsce
pierwszy przypadek z XDR-TB zarejestrowano w
2000 roku [3, 14].
Celem niniejszej pracy była analiza częstości
występowania gruźlicy o oporności pre-XDR i XDR
w Polsce w latach 2000–2009 oraz odpowiedź na
pytanie, czy szczepy XDR są transmitowane między chorymi w Polsce.
W latach 2000–2009 wśród 297 chorych na
gruźlicę MDR potwierdzoną mikrobiologicznie
wskazano 19 chorych (6,4%) wydalających prątki
o oporności XDR i 36 (12,1%) wydalających prątki pre-XDR.
Z 55 badanych chorych 9 mieszkało w województwie mazowieckim, po 8 osób w województwie lubelskim, kujawsko-pomorskim i łódzkim, 6
osób w śląskim, 3 osoby w dolnośląskim, 4 osoby
w podlaskim, po 2 osoby w województwie podkarpackim, wielkopolskim, lubuskim, warmińskomazurskim, małopolskim i jedna osoba województwie świętokrzyskim.
W badanej grupie było 10 kobiet w wieku 23–
61 lat oraz 45 mężczyzn w wieku 33–75 lat, 52
Polaków i 3 obcokrajowców. Chorych nowo wykrytych było 19, a wcześniej leczonych — 36. Wszystkie szczepy należały do gatunku Mycobacterium
tuberculosis i wyhodowano je według standardowych metod. Wykonano identyfikację gatunkową
metodą chromatograficzną (HPLC, high pressure
liquid chromatography) i molekularną (spoligotyping) oraz oznaczono lekooporność [15].
Analiza molekularna metodą spoligotyping
oraz MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repetitive units variable number tandem repeat) objęła
19 szczepów XDR-TB. Metodę spoligotyping opisywano już w poprzednich artykułach, a MIRUVNTR po raz pierwszy w Polsce zastosowano w
niniejszej pracy [16, 17].
Metoda MIRU-VNTR
Materiał i metody
Badania miały charakter retro- i prospektywny. Programy realizowano według protokołu WHO
i obejmowały one ponad 10 000 chorych na gruźlicę badanych w latach 2000–2008 (tab. 2). Poza
szczepami ujętymi w tabeli 2, analizie poddano
pochodzące od 51 chorych na MDR-TB, otrzymane
z laboratoriów regionalnych. Ogółem liczba analizowanych szczepów MDR wynosiła 297.
Sekwencje MIRU po raz pierwszy na świecie
opisano w 1997 roku, a w roku 2001 zaproponowano ich wykorzystanie do typowania prątków
gruźlicy [18, 19].
Typowanie MIRU-VNTR opiera się na identyfikacji 41 wysoce polimorficznych sekwencji mikrosatelitarnych w genomie M. tuberculosis. Każda z sekwencji może występować w kilku lub kilkunastu powtórzeniach w genomie różnych szczepów M. tuberculosis, co daje liczbę przekraczającą
Tabela 2. Liczba szczepów wyhodowanych od badanych chorych w ramach trzech programów WHO Drug Resistance Surveillence
Table 2. Number of strains isolated from patients covered by the three programs of the WHO Drug Resistance Surveillence
Program WHO/WHO program
Liczba badanych szczepów
Number of strains
Liczba szczepów MDR (%)
Number of MDR strains (%)
2000
3705
88 (2,4)
2004
3238
51 (1,6)
2008
Ogółem/Total
280
4380
97 (2,2)
11 323
236 (2,1)
www.pneumonologia.viamedica.pl
Monika Kozińska i wsp., Gruźlica lekooporna typu MDR, pre-XDR i XDR w Polsce w latach 2000–2009
16 000 000 potencjalnych kombinacji. W niniejszej
pracy wykorzystano analizę 15 najbardziej polimorficznych loci o długości 52–77 nukleotydów. W 15
reakcjach amplifikacji wykorzystano 15 par sekwencji starterowych komplementarnych do regionów sąsiadujących z sekwencjami MIRU. Produkty polymerase chain reaction (PCR) rozdzielano w 2-procentowych żelach agarozowych w stosunku do wzorca,
w celu identyfikacji liczby powtórzeń sekwencji
MIRU w poszczególnych loci. Uzyskane wyniki zobrazowano jako układ liczb (kod) reprezentujących
liczbę powtórzeń kolejnych sekwencji MIRU [20].
Szczepy wzorcowe M. tuberculosis H37Rv oraz
M. bovis BCG pochodziły z kolekcji własnej Zakładu Mikrobiologii Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc.
Wyniki
Wśród 297 szczepów o oporności MDR zidentyfikowano 36 szczepów pre-XDR (12,1%) oraz
19 szczepów XDR (6,4%). Zestawienie wzorów lekooporności wśród analizowanej puli szczepów
przedstawiono w tabeli 3.
Wśród szczepów o oporności pre-XDR i XDR
dominował wzór oporności na 4 podstawowe leki
— streptomycynę (SM), izoniazyd (INH), rifampicynę (RMP), etambutol (EMB), odpowiednio
14 (38,9%) i 15 (78,9%) szczepów.
Analizując oporność na leki dodatkowe stwierdzono, że w badanej puli szczepów o oporności
XDR najliczniejsza grupę stanowiły szczepy oporne na wszystkie 3 leki dodatkowe — ofloksacynę
(OFL), amikacynę (AMC) i kapreomycynę (CAP) —
13 szczepów (68,4%). Wśród szczepów pre-XDR
największy odsetek stanowiły szczepy oporne na
OFL — 23 szczepy (63,7%).
Wśród 19 szczepów XDR zidentyfikowano
11 szczepów (58%) opornych na SM, INH, RMP,
EMB, OFL, AMC, CAP i przeanalizowano ich wzory oporności na cykloserynę (CS) i etionamid (ETA)
— leki, na które oporne są szczepy TDR (totally
drug resistant). Wyniki przedstawiono w tabeli 4.
W badanej puli zidentyfikowano jednego chorego wydalającego prątki oporne na ETA (tab. 4.)
Był to chory nowo wykryty, zarejestrowany w Centralnym Rejestrze Gruźlicy w 2000 roku. Nie
stwierdzono szczepów opornych na CS.
Na dalszych etapach pracy wszystkie szczepy
XDR (19) poddano dwuetapowej analizie molekularnej. Pierwszy etap stanowiło typowanie metodą
spoligotyping. Otrzymane wyniki przedstawiono
w tabeli 5.
Zidentyfikowano 9 spoligotypów. Dwa z nich
były nowymi wzorami niezarejestrowanymi dotąd
w Spoligotyping Database (SpolDB4) dla 7 wzorów
molekularnych znaleziono oznaczenie w rejestrze.
Najliczniejsza była rodzina T1 1558, do której należało 5 szczepów (26,3%). Do rodziny T4_CEU1
39 należały 4 szczepy, a do rodziny Beijing 1, T1
53 oraz H3 180 po 2 szczepy (10,5%). Zidentyfikowano również po jednym szczepie w rodzinie
molekularnej U(likelyH) 46, T3 442 oraz w dwóch
nowych rodzinach niezarejestrowanych w bazie
SpolDB4. Następnie wszystkie szczepy o oporności XDR poddano analizie molekularnej MIRUVNTR. Wyniki przedstawiono w tabeli 6.
Zidentyfikowano 11 różnych wzorów DNA.
Analiza wykluczyła pokrewieństwo molekularne
dla 8 szczepów XDR (42,4%). W grupie tej były dwa
szczepy Beijing 1 — jeden z nich wyizolowany od
obcokrajowca z województwa mazowieckiego,
a drugi od Polaka mieszkającego w województwie
Tabela 3. Analiza wzorów lekooporności szczepów XDR oraz pre-XDR wyhodowanych od chorych w Polsce w latach 2000–2009
Table 3. Analysis of patterns of drug resistance XDR and pre-XDR strains isolated from patients in Poland in 2000–2009
Oporność na leki dodatkowe
Additional drug resistance
Oporność na leki podstawowe/Liczba szczepów (%)
Primary drug resistance/Number of strains (%)
S+I+R+E
pre-XDR
XDR
O
A
K
A+K
O+A
O+K
O+A+K
Ogółem
Total
11
1
1
1
(30,5)
(2,8)
(2,8)
(2,8)
S+I+R
5
4
1
2
I+R+E
(13,8)
(11,1)
(2,8)
(5,6)
2
0
0
0
(5,6)
4 (21)
0
11 (57,8)
0
0
2 (10,6)
1
0
0
(5,3)
29
14
3
Ogółem
Total
I+R
5
3
0
0
0
1
0
9
(13,8)
(8,4)
(5,3)
23
8
2
3
(63,7)
(22,3)
(5,6)
(8,4)
36
5 (26,3)
1 (5,3)
13 (68,4)
19
55
R — szczep lekooporny/drug-resistant strain
S — szczep lekowrażliwy/drug-sensitive strain
www.pneumonologia.viamedica.pl
281
Pneumonologia i Alergologia Polska 2011, tom 79, nr 4, strony 278–287
Tabela 4. Analiza wzorów oporności na leki dodatkowe wśród 11 szczepów XDR opornych na SM, INH, RMP i EMB
Table 4. Analysis of patterns of additional drug resistance among 11 XDR strains resistant to SM, INH, RMP and EMB
L.p.
N*/W**
Rok wyhodowania szczepu
Date of culture
Oporność na leki dodatkowe
Additional drugs resistance
OFL
AMC
CAP
ETA
CS
1
2000
N
R
R
R
R
S
2
2006
N
R
R
R
S
S
3
2007
W
R
R
R
S
S
4
2008
W
R
R
R
S
S
5
2008
W
R
R
R
S
S
6
2008
W
R
R
R
S
S
7
2008
W
R
R
R
S
S
8
2008
W
R
R
R
S
S
9
2008
N
R
R
R
S
S
10
2009
W
R
R
R
S
S
11
2009
W
R
R
R
S
S
*N — chory nowo wykryty/patient newly detected
**W — chory wcześniej leczony/patient previously treated
S — streptomycyna; I — izoniazyd; R — rifampicyna; E — etambutol; O — ofloksacyna; A — amikacyna; K — kapreomycyna
Objaśnienia pozostałych skrótów w tekście/Other abbreviations in the text
Tabela 5. Spoligotypy 19 szczepów XDR
Table 5. Spoligotypes of 19 XDR strains
L.p.
Spoligotyp
Spoligotype
Liczba szczepów (%)
Number of strains (%)
1
T1 1558
5 (26,3)
2
T4_CEU1 39
4 (21,0)
3
T1 53
2 (10,5)
4
H3 180
2 (10,5)
5
Beijing 1
2 (10,5)
6
U(likelyH) 46
1 (5,3)
7
T3 442
1 (5,3)
8
767777775660771
1 (5,3)
9
777773037760771
1 (5,3)
19 (100)
lubelskim, dwa szczepy z rodziny T1 53 wyizolowane od Polaków z województwa podkarpackiego, szczep U(likelyH) 46, szczep T3 442, szczep
o spoligotypie 777773037760771 oraz jeden
z 4 szczepów należących do rodziny T4_CEU1 39.
Dla pozostałych 11 szczepów stwierdzono
3 wzory MIRU-VNTR. Najliczniejszą rodzinę molekularną tworzyło 6 szczepów (31,6%) posiadających kod numeryczny 342635444243125. Wśród
nich 5 (26,3%) prezentowało spoligotyp T1 1558,
a jeden szczep (5,3%) posiadał spoligotyp niere-
282
jestrowany dotąd w bazie SpolDB4. Trzy szczepy
z rodziny T4_CEU1 39 miały wzór 353554423333325,
a dwa szczepy należące do rodziny H3 180 posiadały wzór 364624434744227.
Zestawienie wzorów molekularnych i fenotyp
oporności szczepów w trzech zidentyfikowanych
grupach chorych przedstawiono w tabeli 7.
Od 2 chorych z grupy A wyizolowano szczepy należące do rodziny molekularnej H3 180.
Chorzy zamieszkiwali województwo mazowieckie i dolnośląskie. Jeden z nich był wcześniej
leczony z powodu gruźlicy w 2004 roku, z kolei
drugi, nowo wykryty, zachorował po raz pierwszy w 2007 roku. Szczepy wyizolowane od nich
miały identyczne profile molekularne i wzory
oporności.
W grupie B było 3 mieszkańców województwa
łódzkiego, 2 z nich było wcześniej leczonych, jeden chory był nowo wykryty. W 2008 roku od każdego z tych chorych wyizolowano prątki o tym
samym wzorze molekularnym i fenotypie lekooporności. Grupę C stanowiło 6 chorych z województwa kujawsko-pomorskiego. Najwcześniejsza
rejestracja pochodziła z 2000 roku, 3 z 2007 roku
i 2 z 2008 roku. Trzech chorych było zarejestrowanych jako nowo wykryci, a 3 jako wcześniej leczeni. Prątki izolowane od tych chorych miały
identyczne profile DNA i wzory oporności, z wyjątkiem szczepu C3 wrażliwego na EMB i szczepu
C2 wrażliwego na CAP.
www.pneumonologia.viamedica.pl
Monika Kozińska i wsp., Gruźlica lekooporna typu MDR, pre-XDR i XDR w Polsce w latach 2000–2009
Tabela 6. Wzory MIRU-VNTR 19 szczepów XDR
Table 6. MIRU-VNTR patterns of 19 XDR strains
L.p.
1
Wzór MIRU-VNTR
MIRU-VNTR pattern
Spoligotypy szczepów posiadających ten sam wzór MIRU-VNTR
Spoligotypes of strains clustered in MIRU-VNTR analysis
342635444243125
T1 1558
Liczba szczepów (%)
Number of strains (%)
5 (26,3)
767777775660771
2
1 (5,26)
353554423333325
T4_CEU1 39
3 (15,80)
3
364624434744227
H3 180
2 (10,53)
4
333534544441456
Beijing 1
1 (5,3)
5
333753544441457
Beijing 1
1 (5,3)
6
331534342231125
T1 53
1 (5,3)
7
342635442233125
T1 53
1 (5,3)
8
364631434444135
U(likelyH) 46
1 (5,3)
9
334434343241325
T3 442
1 (5,3)
10
334532342242425
777773037760771
1 (5,3)
11
343444333441345
T4_CEU1 39
1 (5,3)
19 (100)
Tabela 7. Dane epidemiologiczne, wzory molekularne i fenotyp oporności szczepów M. tuberculosis w trzech grupach
chorych, wśród których stwierdzono transmisję gruźlicy
Table 7. Epidemiological data, molecular patterns and resistance phenotypes of M. tuberculosis strains isolated from
patients belonging to epidemiological groups
Grupa chorych
Group of patients
A
B
C
Chory/Patient
1
2
1
2
3
1
2
3
4
5
6
N*/W**
W
N
W
W
N
N
N
W
W
W
W
Województwo
Province
Rok hodowli
Date of culture
Spoligotyp
Spoligotype
Wzór MIRU-VNTR
MIRU-VNTR pattern
Dolno- Mazośląskie wieckie
2004
Łódzkie
2007
2008
H3 180
Kujawsko-pomorskie
2000
2007
T4_CEU1 39
2007
2007
2008
T1 1558
2008
767777775660771
364624434744227
353554423333325
342635444243125
Lekooporność
na leki podstawowe
Primary drug resistance
SMR INHR RMPR EMBR
SMR INHR RMPR EMBR
SMR INHR RMPR EMBR***
Lekooporność
na leki dodatkowe
Additional drug resistance
OFLR AMCR CAPS
OFLR AMCR CAPR
OFLR AMCR CAPR ****
*N — chory nowo wykryty/patient newly detected
**W — chory wcześniej leczony/patient previously treated
***Szczep C3 wrażliwy na EMB/C3 strain sensitive to EMB
****Szczep C2 wrażliwy na CAP/C2 strain sensitive to CAP
www.pneumonologia.viamedica.pl
283
Pneumonologia i Alergologia Polska 2011, tom 79, nr 4, strony 278–287
Dyskusja
Z problemem gruźlicy lekoopornej zmagają się
te kraje, gdzie między innymi trudne warunki społeczno-ekonomiczne, niepoprawna diagnostyka
chorych, niewłaściwe schematy leczenia oraz koincydencja z zakażeniem wirusem HIV ograniczają
eliminację choroby ze społeczeństwa.
Wczesne wykrycie i zdiagnozowanie chorych
na tę postać gruźlicy umożliwia włączenie odpowiedniego zestawu leków oraz zapobiega transmisji szczepów lekoopornych w środowisku [21–24].
Analiza lekooporności szczepów MDR wyizolowanych w Polsce w latach 2000–2009 pozwoliła
na ocenę sytuacji epidemiologicznej chorych na
gruźlicę o oporności XDR i pre-XDR. W grupie 297
chorych na gruźlicę MDR stwierdzono 19 XDR
i 36 pre-XDR. Pierwszy przypadek XDR-TB został
zarejestrowany w 2000 roku i od tego czasu, jak
wykazała niniejsza analiza, co roku w Polsce
zwiększała się liczba chorych nowo wykrytych
i wcześniej leczonych z tą postacią gruźlicy [25].
W 2004 roku zidentyfikowano dwa szczepy XDR,
w 2005 i w 2006 roku po jednym, w 2007 roku
4 szczepy, w 2008 roku 8 i w 2009 roku kolejne
2 szczepy.
Wśród 19 chorych na XDR-TB zarejestrowanych w Polsce w latach 2000–2009 dominowała
oporność na 4 leki podstawowe — zidentyfikowano 15 chorych (78,9%). W tej grupie 13 chorych
(68,4%) wydalało prątki oporne jednocześnie na
OFL i CAP.
Analiza oporności szczepów XDR na leki dodatkowe wykazała, że w Polsce nie zarejestrowano dotychczas chorego z gruźlicą TDR jednak
w puli 11 szczepów XDR opornych na 4 podstawowe leki — SM, INH, RMP i EMB, które warunkują
oporność TDR, zidentyfikowano jeden szczep XDR
oporny dodatkowo na ETA. W związku z tym można określić go szczepem o oporności pre-TDR. Zidentyfikowany szczep był wrażliwy na cykloserynę warunkującą w połączeniu z ETA i kwasem paraaminosalicylowym (PAS, para-aminosalicylic
acid) oporność TDR. Jak dotąd, w Polsce nie zarejestrowano oporności na CS, a PAS nie jest lekiem
stosowanym w testach oporności.
Wśród analizowanych 19 szczepów XDR
stwierdzono brak krzyżowej oporności między
RMP. Dziesięć szczepów (53%) było jednocześnie
opornych na RMP i ryfabutinę, 9 szczepów (47%)
było wrażliwych na ryfabutinę, ale nie wykazywało
oporności na RMP. Takie dane odpowiadają doniesieniom opartym na badaniach O’Brien oraz badaniach przeprowadzonych w Polsce przez Augustynowicz-Kopeć [25–27].
284
Analiza wzorów oporności ujawniła, że od
2 chorych wyhodowano w różnym czasie po 2 szczepy prątków gruźlicy o różnych wzorach oporności. W pierwszym przypadku była to 40-letnia kobieta, od której w 2004 roku wyizolowano szczep
pre-XDR, a w 2008 szczep XDR, natomiast drugi
chory — 75-letni mężczyzna, od którego w 2008
roku wyhodowano szczep pre-XDR, a w 2009 XDR.
Analiza molekularna szczepów wykazała, że prątki izolowane od chorych w różnym czasie i o różnych wzorach oporności, posiadały identyczne
wzory DNA. Tym samym można stwierdzić, że
w obu przypadkach przyczyną wznowy choroby
był ten sam szczep M. tuberculosis, który w trakcie leczenia zmienił fenotyp lekooporności. Szczep
wyizolowany od chorej w 2004 roku był oporny na
INH, RMP, OFL i był typem pre-XDR, a szczep wyizolowany od tej chorej w 2008 był szczepem
o oporności XDR. Szczep wyizolowany od drugiego chorego w 2008 roku był typem pre-XDR opornym na SM, INH, RMP, AMC i CAP, a rok później
był szczepem o oporności XDR.
Przykładem ponownego zachorowania na
gruźlicę spowodowanego zakażeniem egzogennym
jest chory z województwa kujawsko-pomorskiego.
Po raz pierwszy był on zarejestrowany w 2001 roku
jako chory nowo wykryty, wydalający szczep wrażliwy na wszystkie leki. Ponownie podjęto u niego
leczenie w styczniu 2008 roku. Wyniki badań mikrobiologicznych potwierdziły lekowrażliwość
szczepu taką samą jak w 2001 roku. Ponieważ stan
kliniczny chorego po włączeniu leczenia nie poprawiał się, a wyniki mikrobiologiczne, bakterioskopia i posiewy dawały pozytywne wyniki, wykonano ponownie test lekooporności w kwietniu
2008 roku i na jego podstawie zidentyfikowano
XDR-TB. Analiza wzorów DNA szczepów wyhodowanych w styczniu i kwietniu 2008 roku wykluczyła ich pokrewieństwo molekularne i wykazała,
że doszło do zakażenia egzogennego prątkami
o oporności XDR i rozwoju nowej postaci gruźlicy.
Dochodzenie epidemiologiczne ujawniło, że w tym
samym czasie w szpitalu, w sali obok, przebywał
pacjent wydalający prątki o oporności XDR z takim samym fenotypem oporności. Wyniki badań
genetycznych potwierdziły, że szczepy te były
identyczne.
Biorąc pod uwagę bliski kontakt oraz podobieństwo genetyczne wyhodowanych szczepów,
można przypuszczać, że doszło do transmisji gruźlicy XDR między chorymi.
Te dwa przykłady wskazują na praktyczne
zastosowanie molekularnych badań epidemiologicznych. Poprzez genotypowanie szczepów prątków wykazano, że kolejne zachorowanie na gruź-
www.pneumonologia.viamedica.pl
Monika Kozińska i wsp., Gruźlica lekooporna typu MDR, pre-XDR i XDR w Polsce w latach 2000–2009
licę nie zawsze jest wynikiem endogennej reaktywacji choroby. Chory na gruźlicę w przeszłości
może zachorować kolejny raz w wyniku nowego
zakażenia innym szczepem prątków, czyli z przyczyny egzogennej [28].
Jak w sytuacji ponownego zachorowania spowodowanego szczepem o nowym wzorze molekularnym zdefiniować przypadek dla celów rejestracji? Czy jest to chory nowo wykryty czy chory
wcześniej leczony? Jeżeli pod uwagę wziąć częstotliwość rejestracji z powodu zachorowania na gruźlicę, wówczas będzie to chory wcześniej leczony.
Z kolei biorąc pod uwagę fakt, że zachorowanie
nastąpiło na skutek zakażenia innym szczepem —
w opisanym przypadku szczepem o oporności XDR
— jest to lekooporność pierwotna, a w związku
z tym chory jest pacjentem nowo wykrytym.
Niniejsza analiza posłużyła do określenia skali
zjawiska rozprzestrzeniania się szczepów lekoopornych oraz wskazała na prawdopodobieństwo
ich transmisji wśród chorych w Polsce.
Typowanie molekularne prątków jest jednym
z podstawowych narzędzi identyfikujących zjawisko transmisji gruźlicy w populacji. Najbardziej
narażone na zachorowanie są osoby przebywające
w otoczeniu chorego, przede wszystkim mieszkające razem i utrzymujące z nim częste kontakty.
Istnieje wiele doniesień o udowodnionej transmisji gruźlicy w małych społecznościach, takich jak
wiezienia, domy opieki społecznej, przedszkola
i szkoły [29–32]. Literatura opisuje zjawisko transmisji między personelem szpitala a pacjentami,
a także między osobami podróżującymi środkami
komunikacji publicznej i w środowisku osób bezdomnych [33, 34]. Jeżeli w wymienionej populacji znajduje się osoba prątkująca, wówczas może
dojść do rozprzestrzeniania się źródła zakażenia.
Dlatego ważne jest, aby podjąć odpowiednie kroki
w celu identyfikacji wszystkich chorych i jak najszybciej przerwać łańcuch transmisji.
Podobieństwo szczepów obserwuje się nie tylko wśród ludzi pozostających ze sobą w bliskich
kontaktach, ale również u chorych bez udowodnionych epidemiologicznych powiązań [35, 36].
W takiej sytuacji prześledzenie drogi, jaką rozprzestrzeniało się źródło zakażenia jest bardzo trudne.
Jedynym wiarygodnym dowodem transmisji jest
wynik molekularnej analizy epidemiologicznej
wskazujący na identyczność wzorów DNA wyhodowanych szczepów. Aby pewnie wskazać genetyczne pokrewieństwo prątków stosuje się wystandaryzowane metody typowania o wysokim potencjale dyferencyjnym [37–40].
Niniejsza praca jest przykładem takiej analizy. Molekularne dochodzenie epidemiologiczne
przeprowadzone w niej pozwala przypuszczać, że
w badanych 3 grupach chorych mogło dojść do
niedawnej transmisji gruźlicy XDR lub w przeszłości źródło zakażenia w poszczególnych grupach
było wspólne.
W grupie dwóch chorych wydalających prątki należące do rodziny H3 180, jeden chory wcześniej leczony został zidentyfikowany w 2004
roku, a chory nowo wykryty w 2007 roku. Nie
udało się ustalić, czy chorzy kontaktowali się ze
sobą i czy istnieje pomiędzy nimi jakieś powiązanie epidemiologiczne. Nic również nie wiadomo o ewentualnym wspólnym źródle zakażenia.
Mimo to nie można wykluczyć transmisji gruźlicy między tymi chorymi.
W drugiej grupie chorych, od których izolowano prątki o tym samym profilu DNA byli
3 mieszkańcy województwa łódzkiego, jeden chory
nowo wykryty w 2008 roku z gruźlicą XDR i dwóch
chorych wcześniej leczonych — jeden wykryty
w 2005 roku, wydalający prątki wrażliwe na wszystkie leki, a w 2008 roku z gruźlicą o oporności XDR,
a drugi w 2006 roku z gruźlicą MDR i w 2008 roku
z gruźlicą XDR. W 2008 roku od każdego z tych
chorych wyizolowano prątki o tych samych wzorach molekularnym i lekooporności. Na podstawie
wywiadu ustalono, że w 2008 roku chorzy byli hospitalizowani w tym samym czasie w jednym
z łódzkich szpitali i prawdopodobnie tam doszło
do transmisji szczepu prątków z opornością XDR.
Z analizy wzorów lekooporności wynika, że źródłem
zakażenia mógł być chory wydalający prątki MDR
w 2006 roku, który na skutek przerwania leczenia
w 2008 roku wydalał prątki o oporności XDR.
Trzecią grupę epidemiologiczną stanowiło
6 chorych z województwa kujawsko-pomorskiego.
Najwcześniej zarejestrowany chory pochodził z 2000
roku, kolejnych 3 zachorowało po raz pierwszy
w 2007 roku, a 2 w 2008 roku. Trzy osoby były już
wcześniej leczone, a 3 osoby należały do grupy chorych nowo wykrytych. Szczepy prątków izolowane
od tych chorych miały identyczne profile DNA.
Nie udało się ustalić, czy chorzy mogli mieć
ze sobą kontakt i czy zaistniały okoliczności sprzyjające transmisji prątków między nimi. Mimo to,
podobnie jak w pierwszej badanej grupie, nie można wykluczać zjawiska transmisji.
Przeprowadzona w pracy analiza molekularna posłużyła do wskazania potencjalnych grup
epidemiologicznych wśród chorych na gruźlicę
wielolekooporną oraz pozwoliła ocenić przydatność zastosowanych metod.
W analizie posłużono się dwiema metodami
genotypowania — w pierwszym etapie zastosowano
spoligotyping, a w drugiej kolejności MIRU-VNTR.
www.pneumonologia.viamedica.pl
285
Pneumonologia i Alergologia Polska 2011, tom 79, nr 4, strony 278–287
Na podstawie doniesień z literatury światowej
uważa się, że spoligotyping jest metodą przesiewową i wymaga uzupełnienia o dodatkowe typowanie metodą pozwalającą zróżnicować profile
DNA szczepów o tym samym spoligotypie. Do takich metod zalicza się między innymi analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych
(RFLP, restriction fragment length polymorphism)
oraz MIRU-VNTR [37, 38].
Wyniki licznych badań przeprowadzonych
w ostatnich latach wykazały, że analiza epidemiologiczna szczepów M. tuberculosis metodą MIRUVNTR jest równie skuteczna jak analiza RFLP,
a w przypadku szczepów zawierających niewielką
liczbę kopii IS6110 (insertion sequence 6110) posiada wyższy potencjał różnicujący. Metoda ta jest
znacznie tańsza i mniej pracochłonna w porównaniu z RFLP, a do jej przeprowadzenia wystarcza
niewielka ilość DNA [39].
Typowanie metodą spoligotyping pozwoliło na
identyfikację wśród 19 szczepów XDR 5 rodzin
molekularnych (spoligotypów), do których należało 15 szczepów. Z kolei analiza MIRU-VNTR zredukowała liczbę szczepów o podobnych wzorach
DNA do 11 i wskazała ich przynależność do 3 rodzin o charakterystycznym kodzie MIRU. Taki
wynik świadczy o przesiewowym charakterze typowania metodą spoligotyping i wskazuje na konieczność uzupełnienia dochodzeń molekularnych
metodą o wyższym potencjale różnicującym, która może posłużyć do analizy szczepów o tych samych spoligotypach [37, 38].
Wnioski
1.
2.
3.
286
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Na podstawie analizy oporności szczepów wyizolowanych od 297 chorych na MDR-TB wskazano 19 chorych (6,4%) wydalających prątki
XDR i 36 chorych (12,1%) wydalajacych prątki pre-XDR.
W badanej populacji nie stwierdzono chorych
na gruźlicę wydalających prątki o wzorze
oporności TDR.
Analiza molekularna pozwoliła na identyfikację wśród chorych na XDR-TB trzech potencjalnych grup epidemiologicznych. Podobieństwo molekularne szczepów wyhodowanych
od chorych w poszczególnych grupach może
świadczyć o prawdopodobnej transmisji gruźlicy lub wspólnym źródle zakażenia.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
Davies P.D. Risk factors for tuberculosis. Monaldi. Arch. Chest
Dis. 2005; 63: 37–46.
Kolappan C., Gopi P.G., Subramani R., Narayanan P.R. Selected biological and behavioural risk factors associated with
pulmonary tuberculosis. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2007; 11:
999–1003.
Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Emergence
of Mycobacterium tuberculosis with extensive resistance to second-line drugs — worldwide, 2000–2004. MMWR Morb. Mortal Wkly Rep. 2006; 55: 301–305.
Valayati A., Masjedi M. Emergence of new forms of totally drugresistant tuberculosis bacilli. Chest 2009; 136: 420–425.
Mahmoudi A., Iseman M.D. Pitfalls In the care of patients with
tuberculosis. Common errors and their association with the
acquisition of drug resistance. JAMA 1993; 270: 65–68.
Sharma S.K., Turaga K.K., Balamurugan A. i wsp. Clinical and
genetic risk factors for the development of multi-drug resistant
tuberculosis in non-HIV infected patients at a tertiary care center in India: a case-control study. Infect. Genet. Evol. 2003; 3:
183–188.
Casal M., Vaquero M., Rinder H. i wsp. A case-control study for
multidrug-resistant tuberculosis: risk factors in four European
countries. Microb. Drug Resist. 2005; 11: 62–67.
Faustini A., Hall A.J., Perucci C.A. Risk factors for multidrug
resistant tuberculosis in Europe: a systematic review. Thorax
2006; 61: 158–163.
Centers for Disease Control and Prevention Trends in tuberculosis — United States 2007. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep.
2008; 57: 281–285.
Gilad J., Borer A., Riesenberg K., Peled N., Schlaeffer F. Epidemiology and ethnic distribution of multidrug-resistant tuberculosis in Southern Israel 1992–1997: the impact of immigration.
Chest 2000; 117: 738–743.
Hersi A., Elwood K., Cowie R., Kunimoto D., Long R. Multidrug-resistant tuberculosis in Alberta and British Columbia
1989–1998. Can. Respir. J. 1999; 6: 155–160.
Lomtadze N., Aspindzelashvili R., Janjgava M. i wsp. Prevalence and risk factors for multidrug-resistant tuberculosis in
the Republic of Georgia: a population-based study. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2009; 13: 68–73.
WHO. 2010. Multidrug and extensively drug-resistan TB
(M/XDR-TB): 2010 global report on surveillance and response.
Geneva, Switzerland: World Health Organization. WHO/HTM/
/TB/2010.3.
Augustynowicz-Kopeć E., Zwolska Z. Gruźlica wywołana
prątkami o oporności XDR w Polsce. Badania mikrobiologiczne
i molekularne. Pneumonol. Alergol. Pol. 2007; 75: 32–39.
Zwolska Z., Augustynowicz-Kopeć E., Klatt M. Pierwotna
i nabyta lekooporność prątków gruźlicy w Polsce. Pneumonol.
Alergol. Pol. 1999; 67: 536–545.
Warren R., Streicher E., Chjaralambous S. Use of spoligotyping
for accurate classification of recurrent tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 2002; 40: 3851–3853.
Augustynowicz-Kopeć E., Jagielski T., Kozińska M., Zabost A.,
Zwolska Z. The significance of spoligotyping method in epidemiological investigations of tuberculosis. Pneumonol. Alergol.
Pol. 2007; 75: 22–31.
Supply P., Magdalena J., Himpens S., Locht C. Identification of
novel intergenic repetitive units in a mycobacterial two-component system operon. Mol. Microbiol. 1997; 26: 991–1003.
Supply P., Lesjean S., Savine E., Kremer K., van Soolingen D.,
Locht C. Automated high-throughput genotyping for study of
global epidemiology of Mycobacterium tuberculosis based on
mycobacterial interspersed repetitive units. J. Clin. Microbiol.
2001; 39: 3563–3571.
Alonso-Rodriguez N., Martinez-Lirola M., Herranz M. Evaluation of new advanced 15-loci MIRU-VNTR genotyping tool in
Mycobacterium tuberculosis molecular epidemiology studies.
BMC Microbiology 2008; 8; 34.
Banerjee R., Allen J. Extensively drug-resistant tuberculosis
in California, 1993–2006. Clin. Infect. Dis. 2008; 47: 450–
–457.
www.pneumonologia.viamedica.pl
Monika Kozińska i wsp., Gruźlica lekooporna typu MDR, pre-XDR i XDR w Polsce w latach 2000–2009
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
Kwon Y., Kim Y., Suh G. Treatment outcomes for HIV-uninfected patients with multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis. Clin. Infect. Dis. 2008; 47: 496–502.
Mitrzyk B. Treatment of extensively drug-resistant tuberculosis
and role of the pharmacist. Pharmacotherapy 2008; 28; 1243–
–1254.
Cox H., McDermid Ch. XDR tuberculosis can be cured with
aggressive treatment. Lancet 2008; 372: 1363–1365.
Augustynowicz-Kopeć E. Gruźlica lekooporna w Polsce. Analiza epidemiologiczna, mikrobiologiczna i genetyczna. Rozprawa habilitacyjna. Akademia Medyczna w Warszawie,
Warszawa 2007.
O’Brien R., Lyle M., Snider D. Jr. Rifabutin (ansamycin LM427):
a new rifamycin-S derivative for the treatment of mycobacterial
diseases. Rev. Infect. Dis. 1987; 9: 519–530.
Zwolska Z, Augustynowicz-Kopeć E., Klatt M. Primary and
acquired drug resistance in Polish tuberculosis patients: results
of a study of the national drug resistance surveillance programme. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2000; 4: 832–838.
Feng Z., Castillo-Chavez C., Capurro A. A model for tuberculosis
with exogenous reinfection. Theor. Popul. Biol. 2000; 57: 235–247.
Baussano I., Williams B.G., Nunn P., Beggiato M., Fedeli U.,
Scano F. Tuberculosis inciedence in prisons: a systematic review. PloS Med. 2010; 7: 1–10.
Askew G.L., Finelli L., Hutton M. i wsp. Mycobacterium tuberculosis transmission from pediatrician to patients. Pediatrics
1997; 100: 19–23.
Puneet K., Dewman., Banouvong H. i wsp. A tuberculosis outbreak in a private-home family child care center in San Francisco 2002–2004. Pediatrics 2006; 117: 863–869.
Kumar S., Radhakrishna, Chadha V.K. i wsp. Prevalence of
tuberculous infection among school children in Kerala. Indian
J. Tuber. 2009; 56: 10–16.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
Moore M., Valway S.E., Ihle W., Onorato I.M. A train passenger
with pulmonary tuberculosis: evidence of limited transmission
during travel. Clin Infect. Dis. 1999; 28: 52–56.
Lofy K.H., Mc Elroy P.D., Lake L. i wsp. Outbreak of tuberculosis in a homeless population involving multiple sites of transmission. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2006; 10: 683–689.
Afanas’ev M.V., Ikryannikova L.N., Il’ina E.N. i wsp. Molecular
typing of Mycobacterium tuberculosis circulated in Moscow,
Russian Federation. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2011;
30: 181–191.
Parissa-Farnia, Masjedi M.R., Varahram M. i wsp. The recent-transmission of Mycobacterium tuberculosis strains
among Iranian and Afghan relapse cases: a DNA-fingerprinting Rusing RFLP and spoligotyping. BMC Infect. Dis. 2008;
8: 109–114.
Sola C., Filliol I., Legrand E. i wsp. Genotyping of the Mycobacterium tuberculosis complex using MIRUs: association with
VNTR and spoligotyping for molecular epidemiology and evolutionary genetics. Infect. Genet. Evol. 2003; 3: 125–133.
Kwara A., Schiro R., Cowan L. i wsp. Evaluation of the epidemiologic utility of secondary typing methods for differentiation
of Mycobacterium tuberculosis isolates. J. Clin. Microbiol. 2003;
41: 2683–2685.
Cowan L., Mosher L, Diem L, Massey J., Crawford J. Variablenumber tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis
isolates with low copy numbers of IS6110 by using mycobacterial interspersed repetitive units. J. Clin. Microbiol. 2002; 40:
1592–1602.
Allix-Béguec C., Harmsen D., Weniger T., Supply P., Niemann
S. Evaluation and strategy for use of MIRU-VNTRplus, a multifunctional database for online analysis of genotyping data and
phylogenetic identification of Mycobacterium tuberculosis complex isolates. J. Clin. Microbiol. 2008; 46: 2692–2699.
www.pneumonologia.viamedica.pl
287