Ćwiczenie I
Transkrypt
Ćwiczenie I
ĆWICZENIE I BADANIE WRAŻLIWOŚCI BAKTERII NA ANTYBIOTYKI I CHEMIOTERAPEUTYKI Autor i główny prowadzący dr Dorota Korsak Wstęp Jednym z najważniejszych etapów rutynowej diagnostyki mikrobiologicznej zakażeń bakteryjnych jest oznaczenie wrażliwości patogenu na leki. Szerokie stosowanie antybiotyków pociąga za sobą ciągły wzrost oporności na leki wśród wielu klinicznie ważnych drobnoustrojów, a także pojawienie się nowych mechanizmów oporności. W chwili obecnej stosuje się wiele różnych metod identyfikacji oporności od prostych testów fenotypowych po metody wykorzystujące techniki biologii molekularnej. Współczesne laboratorium mikrobiologiczne posiada możliwość oznaczania lekowrażliwości różnymi metodami fenotypowymi: 1. metoda jakościowa – metoda dyfuzyjno-krążkowa, wykorzystująca zjawisko powstawania w podłożu gradientu stężeń w trakcie dyfuzji substancji czynnej z krążka antybiogramowego. 2. metodami ilościowymi, pozwalającymi na określenie najmniejszego stężenia hamującego leku (ang. minimal inhibitory concentration, MIC). 2.1. metoda rozcieńczeń w agarze – antybiotyk obecny w podłożu agarowym w malejących stężeniach, na które posiewana jest zawiesina bakteryjna o określonej j gęstości 2.2. metoda rozcieńczeń w bulionie – antybiotyk obecny w malejących stężeniach w bulionie; 2.3. E-testy – metoda łącząca w sobie cechy metody rozcieńczeniowej i metody dyfuzyjnej, polegająca na wytwarzaniu stabilnego, ciągłego gradientu stężeń antybiotyku w podłożu agarowym. Celem ćwiczenia jest oznaczenie wrażliwości szczepów bakteryjnych antybakteryjne z zastosowaniem metod fenotypowych i molekularnych. Wykonanie ćwiczenia Materiały Szczepy bakteryjne Staphylococcus aureus ATCC 29231 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Listeria monocytogenes ATCC13932 szczepy L. monocytogenes izolowane z żywności Antybiotyki wodny roztwór tetracykliny (10 mg/ml) wodny roztwór wankomycyny (10 mg/ ml) wodny roztwór ampicyliny (10 mg/ml) roztwór cyprofloksacyny w 0.1 M HCl (10 mg/ml) Podłoża na związki (skład w przeliczeniu na 1 litr) Antybiogramowe Muellera-Hintona II pH-7,3 wyciąg wołowy 3,0 g kwaśny hydrolizat kazeiny 17,5 g skrobia 1,5 g Antybiogramowe Muellera-Hintona II agar (MHA) Bulion kazeinowo-sojowy z ekstraktem drożdżowym (TSYEB) pH-7,3 pepton K 17,0 g pepton SP 3,0 g glukoza 2,5 g chlorek sodu 50g fosforan dwupotasowy 2,5 g ekstrakt drożdżowy 6,0 1. Badanie wrażliwości szczepów metodą dyfuzyjno-krążkową Przygotować odpowiednie zawiesiny (gęstość 0,5 w skali McFarlanda) następujących szczepów: S. aureus, E. faecalis, E. coli, P. aeruginosa. Na podłoże antybiogramowe Mueller-Hinton II, za pomocą jałowej wymazówki, nanieść zawiesinę bakteryjną. Po upływie 10 min nałożyć krążki bibułowe nasączone antybiotykiem/chemioterapeutykiem w ściśle określonym stężeniu (Tabela 1). Po inkubacji, prowadzonej w 35-37 oC przez 18-20 godz., zmierzyć średnicę strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążka antybiotykowego. Określić wrażliwość badanego szczepy wykorzystując dane z Tabeli 1. 2. Określanie wartości minimalnego stężenia hamującego 2.1.Określanie wartości MIC metodą podwójnych rozcieńczeń antybiotyku/chemioterapeutyku w podłożu płynnym na płytkach titracyjnych. 2.1.1. Przygotować 5 ml podłoża MH II uzupełnionego odpowiednimi antybiotykami w stężeniu końcowym: wankomycyna - 16 g/ml; tetracyklina - 16 g/ml; ampicylina – 16 g/ml; cyprofloksacyna - 16 g/ml. Stężenie wyjściowe każdego z antybiotyków: 1 mg/ml. 2.1.2. Przygotowanie hodowli bakteryjnej Przygotować serię 10-krotnych rozcieńczeń hodowli nocnych szczepów bakterii z rodzaju Listeria w roztworze soli fizjologicznej (RF) tak, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie hodowli 10-5 co odpowiadało 104 jtk/ml. 2.1.3. Przygotowanie rozcieńczeń antybiotyku w podłożu Na 96 dołkowe płytki titracyjne o końcowej objętości 200 μl, nanieść po 100 μl podłoża MH II (począwszy od dołka B w każdej kolumnie). Następnie do dołka A w każdej kolumnie nanieść 200 μl podłoża MH II uzupełnionego badaną substancję w odpowiednim stężeniu. Począwszy od dołka A przenosić po 100 μl roztworu do kolejnych dołków, uzyskując w ten sposób serię dwukrotnych rozcieńczeń badanej substancji. Na koniec do każdego dołka dodać po 100 μl hodowli bakteryjnej z rozcieńczenia 10 -5 . 2.1.4 Odczyt wyników Hodowle bakteryjne na płytkach titracyjnych należy inkubować w temperaturze 35-37 oC przez 18-20 godz. Odczyt będzie polegał na obserwacji zmętnienia podłoża. Za wartość MIC należy przyjąć najmniejsze stężenie antybiotyku, przy którym nie zaobserwowano wzrostu bakterii. 2.2. Określanie wartości MIC metodą E-testów Na podłoże antybiogramowe MH II z krwią owczą, za pomocą jałowej wymazówki, nanieść zawiesinę bakteryjną szczepów Listeria monocytogenes (rozcieńczenie 10 -1). Po upływie 10 min nałożyć paski testowe (E-testy) ze stopniowo zmieniającymi się stężeniami antybiotyku. Po inkubacji przez 20-24 godz. w temp. 37oC na skali testu odczytać wartość MIC. Za MIC przyjąć wartość w punkcie przecięcia eliptycznej strefy zahamowania wzrostu utworzonej wokół paska z jego brzegiem. 3. Wykorzystanie metod molekularnych w wyrywaniu oporności bakterii 3.1 Molekularne mechanizmy oporności szczepów Campylobacter fluorochinolony i tetracykliny jejuni/coli na Mechanizm oporności bakterii z rodzaju Campylobacter (C. jejuni i C. coli) na fluorochinolony związany jest głównie pojawieniem się mutacji chromosomowych w genie gyrA kodującym podjednostkę A topoizomerazy II – gyrazy. Mutacje punktowe w genie gyrA zmieniają sekwencję nukleotydową, co prowadzi do modyfikacji miejsca, które są celem działania dla fluorochinolonów. Prowadzi to zmniejszenia powinowactwa enzymu do tych chemioterapeutyków. Najczęstszą mutacją punktową w genie gyrA spotykaną wśród szczepów Campyloabcter opornych na fluorochinolony jest zamiana kodonu ACA (kodującego treoninę) na ATA (kodującego izoleucynę ) w pozycji 86. Techniką stosowaną do identyfikacji tej mutacji jest metoda MAMA PCR (ang. mismatch amplification mutation assay PCR). Jest to reakcja amplifikacji ze starterami o zmodyfikowanej sekwencji. Startery są komplementarne do zmienionej sekwencji w DNA. Oporność na tetracykliny szczepów Campylobacter związana jest z obecnością genu tet(O). Gen ten koduje białko chroniące rybosom przed działaniem antybiotyku. Materiały DNA genomowy szczepów C. coli i C. jejuni Startery Mutacja Thr 86 w genie gyr A dla C. jejuni; gyrA1 5- TTT TTA GCA AAG ATT CTG AT-3 gyrA2 5- CAA AGC ATC ATA AAC TGC AA-3 Mutacja Thr 86 w genie gyr A dla C. coli gyrA3 5- TAT GAG CGT TAT TAT CGG TC -3 gyrA4 5-TAA GGC ATC GTA AAC AGC CA-3 Obecność genu tet(O) TET1 5- GGC GTT TTG TTT ATG TGC G-3 TET2 5-ATG GAC AAC CCG ACA GAA GC-3 3.1.1 Wykrywanie oporności na fluorochinolony Wykrywanie mutacji w genie kodującym podjednostkę A gyrazy Skład mieszaniny reakcyjnej (25 µl) H2O bufor do PCR (10 x) starter A1 (lub A3) (stężenie wyjściowe 10 µM) starter A2 (lub A4) (stężenie wyjściowe 10 µM) deoksyrybonukleotydy (10 mM) polimeraza Taq (1U/µl) DNA 19 µl 2,5 µl 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl 2 µl Warunki reakcji - 35 cykli 94oC – 5 min 94oC – 1 min 48oC – 1 min 72oC – 1 min 72oC – 7 min 4oC - 3.1.2 Wykrywanie oporności na tetracykliny Wykrywanie obecności genu tet(O) Startery: TET1 iTET2 Warunki reakcji jak wyżej – jedyna zmiana to temperatura przyłączania starterów (Tm ) 57 oC Probówki umieścić w termocyklerze 4. Przeprowadzić reakcję PCR. 5. Po zakończeniu reakcji próbki (po dodaniu buforu obciążającego) rozdzielić w 1% żelu agarozowym. 6. Sporządzić dokumentację fotograficzną rozdziału DNA. 7. Określić, czy badany szczep jest oporny na fluorochinolony i/lub tetracykliny. Tabela 1. Badanie wrażliwości szczepów bakteryjnych na antybiotyki i chemioterapeutyki* antybiotyk krążek (g) imipenem ceftriakson minocyklina ciprofloksacyna 10 30 30 5 krążek (g) Pseudomonas aeruginosa strefa zahamowania wzrostu (mm) R I S 14 – 15 13 16 14 - 20 13 21 15 -18 14 19 16 - 20 15 21 Enterococcus feacalis strefa zahamowania wzrostu (mm) Wartość MIC (g/ml) R S 16 4 64 8 16 4 4 1 Wartość MIC (g/ml) antybiotyk tetracyklina ampicylina wankomycyna linezolid 30 10 30 30 antybiotyk krążek (g) ampicylina tikarcylina / kwas klawulanowy cefoksytyna aztreonam 10 75/10 30 30 I 15 - 18 15 - 16 21 - 22 S 19 17 17 23 Escherichia coli strefa zahamowania wzrostu (mm) R I S 14 – 15 13 17 15 – 19 14 20 14 15 15 - 17 16 - 21 18 22 Staphylococcus aureus strefa zahamowania wzrostu (mm) R I S 13-16 12 17 19 20 R 16 16 32 8 S 4 8 4 2 Wartość MIC (g/ml) R S 32 8 128/2 16/2 32 32 8 8 Wartość MIC (g/ml) R S norfloksacyna 10 16 4 cefoksytyna 30 4 2 (oksacylina) wankomycyna 30 15 2 gentamicyna 10 13 - 14 12 15 8 4 * kryteria interpretacyjne wg. CLSI. 2006. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; sixteenth informational supplement. Vol 26 no. 3. M100-S16 antybiotyk krążek (g) R 14 16 14 20