Badanie tolerancji bakterii na antybiotyki β

Prowadzący ćwiczenia:
dr Agata Krawczyk-Balska
Badanie tolerancji bakterii na antybiotyki β-laktamowe
Wstęp:
Oprócz oporności bakterii na antybiotyki β-laktamowe, innym znanym zjawiskiem jest
tolerancja bakterii wobec antybiotyków β-laktamowych. O tolerancji mówimy, gdy bakterie
nie giną w obecności antybiotyku, lecz trwają nie rosnąc i nie dzieląc się (bakteriostaza).
Zjawisko to zostało po raz pierwszy zaobserwowane w 1942 roku przez Hobby’ego i
współpracowników, jednak oddzielne określenie nadano mu w latach 70-tych ubiegłego
wieku. WyróŜnia się dwa rodzaje tolerancji na antybiotyki β-laktamowe: genotypową oraz
fenotypową. Tolerancja genotypowa wynika z mutacji w genomie, w wyniku których bakterie
unikają bakteriobójczego działania antybiotyku. Zmiany te dotyczą najczęściej genów
kodujących autolizyny i/lub genów regulatorowych zaangaŜowanych w procesy regulacji
ekspresji i/lub aktywności autolizyn. Tolerancja genotypowa moŜe być wrodzona - wówczas
jest stałą cechą gatunku lub szczepu bakterii albo nabyta – wówczas w początkowo nie
wykazującej tolerancji populacji bakterii, z czasem na skutek mutacji, pojawia się
subpopulacja bakterii wykazujących tolerancję; zmiana ta staje się dziedziczna. Natomiast
tolerancja fenotypowa na antybiotyki β-laktamowe nie wiąŜe się ze zmianami w genomie i
jest cechą charakterystyczną wszystkich niedzielących się lub wolno dzielących się komórek
bakteryjnych. Tolerancja fenotypowa jest ściśle związana ze stanem fizjologicznym bakterii
np. głodzenie spowalnia wzrost bakterii, co zwiększa ich tolerancję wobec antybiotyku.
Niedzielące się bakterie mogą teoretycznie trwać w stanie stazy przez nieokreślony czas i
stanowić rezerwuar Ŝywych komórek, prowadząc do utrzymującej się infekcji, co powoduje,
Ŝe tolerancja bakterii na antybiotyki postrzegana jest jako zjawisko równie niebezpieczne co
oporność. W ujęciu klinicznym o tolerancji mówimy, gdy w określonych warunkach, badany
antybiotyk wykazuje zmniejszenie lub brak właściwości bakteriobójczych bez utraty działania
hamującego wzrost (nie występuje zmiana w MIC). Zgodnie z definicją EUCAST oraz CLSI
jeŜeli stosunek MBC:MIC jest równy lub wyŜszy od 32 to badany szczep jest uznawany za
tolerancyjny. W związku z powyŜszym, aby zbadać tolerancję naleŜy sprawdzić, czy stęŜenie
antybiotyku 32-krotnie wyŜsze niŜ wartości MIC jest stęŜeniem MBC.
MBC – minimal bactericidal concentration – najmniejsze stęŜenie antybiotyku, które w
określonych warunkach redukuje o 99,9 % (3 jednostki logarytmiczne) liczbę bakterii
obecnych w innoculum.
Cel ćwiczenia: Zbadanie tolerancji
ampicylinę.
Escherichia coli oraz Listeria monocytogenes na
Wykonanie ćwiczenia:
Dzień I
1. Przygotować szereg podwójnych rozcieńczeń ampicyliny w podłoŜu płynnym LB (zakres
stęŜeń 1024 – 2 µg/ml). W tym celu odpipetować sterylnie po 1 ml podłoŜa do 9
probówek oraz 2 ml do pierwszej probówki szeregu. Do probówki zawierającej 2 ml
podłoŜa dodać ampicylinę do końcowego stęŜenia 1024 µg/ml z roztworu antybiotyku o
stęŜeniu 20 mg/ml.
2. Przygotować szereg podwójnych rozcienczeń ampicyliny w podłoŜu płynnym BHI
(zakres stęŜeń 64 – 0,125 µg/ml). W tym celu odpipetować sterylnie po 1 ml podłoŜa do 9
probówek oraz 2 ml do pierwszej probówki szeregu. Do probówki zawierającej 2 ml
1
3.
4.
5.
6.
podłoŜa dodać ampicylinę do końcowego stęŜenia 64 µg/ml z roztworu antybiotyku o
stęŜeniu 1 mg/ml.
Z jednodniowych hodowli Escherichia coli oraz Listeria monocytogenes na podłoŜu
stałym pobrać pojedyncze kolonie i zawiesić w roztworze soli fizjologicznej (2 ml) przygotować zawiesiny bakterii o gęstości 0.5 McFarlanda.
Przygotowany szereg podwójnych rozcienczeń ampicyliny w podłoŜu LB zaszczepić
zawiesiną E. coli wprowadzając do kaŜdej probówki 50 µl zawiesiny.
Przygotowany szereg podwójnych rozcienczeń ampicyliny w podłoŜu BHI zaszczepić
zawiesiną L. monocytogenes wprowadzając do kaŜdej probówki 50 µl zawiesiny.
Określić liczbę bakterii obecnych w innoculum. W tym celu wykonać szereg rozcienczeń
przygotowanych zawiesin E. coli i L. monocytogenes w roztworze RF, a następnie z
rozcieńczenia 10-5 wysiać 100 µl na 2 szalki z podłoŜem stałym LB (w przypadku E. coli)
oraz na 2 szalki z podłoŜem stałym BHI (w przypadku L. monocytogenes). Zaszczepione
szeregi podwójnych rozcienczeń oraz szalki z wysianymi bakteriami pozostawić na 24
godzinną inkubację w 37 oC.
Dzień II
1. Odczytać wartości MIC ampicyliny dla badanych szczepów bakterii.
2. Zliczyć kolonie wyrosłe na szalkach wykonanych w pierwszym dniu eksperymentu. Na
podstawie uzyskanych wyników obliczyć liczbę bakterii obecnych w innoculum.
3. Określić liczbę bakterii obecnych w podłoŜu zawierającym ampicylinę w stęŜeniu
równym MIC oraz w stęŜeniu równym 32×wartość MIC. W tym celu, wykonać szeregi
rozcienczeń bakterii w roztworze RF, a następnie z rozcieńczenia 10-1 10-2 10-3 wysiać
100 µl na szalki z podłoŜem stałym LB (w przypadku E. coli) oraz na szalki z podłoŜem
stałym BHI (w przypadku L. monocytogenes).
4. Szalki z wysianymi bakteriami pozostawić na 24 godzinną inkubację w 37 oC.
Dzień III
1. Zliczyć kolonie wyrosłe na szalkach wykonanych w drugim dniu eksperymentu. Na
podstawie uzyskanych wyników obliczyć liczbę bakterii obecnych w podłoŜu
zawierającym ampicylinę w stęŜeniu równym MIC oraz w stęŜeniu równym 32×wartość
MIC.
2. Na podstawie uzyskanych wyników określić (I) czy wartość MIC = MBC dla badanych
szczepów, oraz (II) procent redukcji liczby Ŝywych bakterii w podłoŜu zawierającym
ampicylinę w stęŜeniu 32-krotnie wyŜszym od stęŜenia MIC (procent redukcji liczby
Ŝywych bakterii naleŜy obliczyć w odniesieniu do liczby bakterii obecnych w
innoculum).
Opracowanie wyników:
Na podstawie uzyskanych wyników określić tolerancję E. coli oraz L. monocytogenes na
ampicylinę.
Literatura:
1. EuropeanCommittee forAntimicrobial SusceptibilityTesting (EUCAST) of the
European Society of ClinicalMicrobiology and Infectious Diseases (ESCMID). 2000.
Terminology relating to methods for the determination of susceptibility of
bacteria to antimicrobial agents.
2. RiceK.C., Bayles K.W.:Molecular Control of Bacterial Death and Lysis. Microbiol
Mol Biol Rev. 2008, (72): 85–109
3. Markiewicz Z i Kwiatkowski A.: Bakterie, antybiotyki, lekooporność. PWN 2001
2