Terapia genowa stomatologia - Zakład Farmakologii Klinicznej

Terapia genowa
Autor: dr Artur Cieślewicz
Zakład Farmakologii Klinicznej
[email protected]
Definicja
Terapia genowa: Procedura medyczna, podczas której dzika wersja genu jest wprowadzana do
komórek pacjenta w celu wyleczenia choroby wywołanej przez zmutowany gen, kodującego
niefunkcjonalny produkt
Rodzaje terapii genowej
1. Terapia in vivo
a. Działanie bezpośrednio w organizmie pacjenta
b. Niezbędne metody precyzyjnego transportu terapeutycznych genów do określonych
komórek
2. Terapia ex vivo
a. Pobieramy populację komórek z organizmu pacjenta
b. Transformacja w warunkach laboratoryjnych
c. Zmodyfikowane komórki powracają do organizmu pacjenta
Wektory
•
•
Niewielkie cząsteczki DNA, umożliwiające wprowadzenie obcego DNA do komórki
Plazmidy, genomy wirusowe, sztuczne chromosomy
Wektory adenowirusowe
•
•
•
Oparte na ludzkim adenowirusie
Terapeutyczny gen wstawiany na miejsce genów wirusowych (zwykle E1-E3)
Tak przygotowany DNA – pakowany do kapsydu
Rodzaje wektorów adenowirusowych
•
•
•
1 generacja: delecje genów E1 i E3 (ograniczona replikacja)
2 generacja: delecja genu E4 (zredukowana odpowiedź immunologiczna)
3 generacja: usunięte geny wirusowe; silnie zredukowana odpowiedź immunologiczna
Zalety
•
•
•
•
Wysoka efektywność transdukcji
Pojemność” do 8 kbp
Infekuje komórki dzielące się i zróżnicowane
Wektor wyboru w terapii genowej niektórych nowotworów
Wady
•
•
•
Ekspresja ograniczona w czasie
Wczesne generacje: mogło dojść do ekspresji wirusowych białek
Skuteczność in vivo utrudniona przez odpowiedź immunologiczną
Pierwszy rekombinowany adenowirus dopuszczony do terapeutycznego stosowania: Onyx-15
(Oncorine):
•
•
Niemożność unieczynnienia białka p53 => namnażanie tylko w komórkach nowotworowych
Oncorine + 5FU + cisplatyna => lepsza odpowiedź na leczenie, mniejsze
prawdopodobieństwo progresji w porównaniu do samej chemioterapii
Wektory retrowirusowe
•
•
Bazują na genomie retrowirusa (RNA jako materiał genetyczny)
Terapeutyczny gen wstawiany na miejsce genów gag, pol, env
Zalety
•
•
•
•
Wysoka efektywność transdukcji
„Pojemność” do 8 kbp
Integracja z genomem gospodarza => stała ekspresja genu
Brak ekspresji białek wirusowych
Wady
•
•
•
Infekowanie tylko komórek dzielących się
Losowa integracja z genomem
Skuteczność in vivo utrudniona przez odpowiedź immunologiczną
Wektory niewirusowe
Liposomy
•
Fosfolipidowe pęcherzyki transportujące DNA
Sztuczne ludzkie chromosomy (HAC)
•
•
•
•
•
Tworzone na bazie chromosomów
Zawierają: centromer, miejsca inicjacji replikacji, telomery
Wiążą się z histonami; replikują, segregują poprawnie podczas kariokinezy
Brak ograniczeń co do długości genu jaki można umieścić w chromosomie
Kontrola ekspresji: elementy regulatorowe
Przykłady terapii genowej
Zespół SCID
•
•
•
•
Pierwszy sukces terapii genowej (1990r.)
Przyczyna genetyczna: mutacja w genie ADA, prowadząca do niedoboru deaminazy
adenozyny
terapia ex vivo: pobrane limfocyty modyfikowano dzikim genem ADA
Modyfikacja (2002r.): transfer genu ADA do komórek hematopoetycznych +
kondycjonowanie niemieloablacyjne
Mukowiscydoza
•
•
•
Przyczyna: mutacje w genie CFTR (Cystic Fibrosis Conductance Transmembrane Regulator) –
brak funkcjonalnych kanałów jonowych w przypadku homozygot recesywnych
Badania na kulturach tkankowych, wyprowadzonych z komórek płuc i trzustki pacjentów
chorych na mukowiscydozę: znaczące obniżenie zawartości Cl- po wprowadzeniu dzikiego
allela CFTR
Badanie kliniczne: terapia in vivo
o 140 pacjentów przyjmowało inhalację (1/miesiąc) placebo lub wektora
liposomowego z genem CFTR
Znacząco wyższa nasilona pierwszosekundowa objętość wydechowa (FEV1) u
pacjentów poddanych terapii genowej
Lepszy wektor dla mukowsicydozy: F-HN SIV
o lentiwirus + białka kapsydu F i HN wirusa Sendai
o
•
Wrodzona ślepota Lebera
•
•
Stopniowa utrata wzroku (fotoreceptory przestają reagować na światło) powodowana
mutacją w genie RPE65 (enzym pełniący kluczową rolę w cyklu przemian retinolu)
Terapia genowa: psy, które odziedziczyły zmutowane allele RPE65
o Wstrzyknięcie wektora z dzikim genem RPE65 bezpośrednio do siatkówki psów
ślepych od urodzenia
o Po terapii psy zaczęły be trudności poruszać się po otoczeniu (omijanie przeszkód)
o odzyskanie wzroku potwierdzone rezonansem magnetycznym mózgu
Regeneracja kości i przyzębia
BMP
•
•
•
•
Odbudowa kości wokół implantów
badanie na szczurach: Do dużych ubytków kostnych w szczęce dostarczono wektory
adenowirusowe z BMP7 przy użyciu macierzy kolagenowej
BMP7 bierze udział w regulacji wzrostu i różnicowania komórek kości, rozwojy zębów,
procesach naprawczych przyzębia
Zwierzęta, które poddano terapii genowej produkowały 50% więcej kości wokół implantów
od zwierząt poddanych standardowemu leczeniu
Sialoproteina (BSP)
•
•
BSP pobudza różnicowanie komórek podczas naprawy i regeneracji kości
Dostarczenie in vivo genu BSP do ubytku kostnego pobudza regenerację kości zębodołu
Czynniki pobudzające angiogenezę
•
•
•
VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor
bFGF: basic Fibroblast Growth Factor
EMD: Enamel Matrix Derived protein
RUNX2: Runt-related transcription factor 2
•
•
Pobudzenie różnicowania komórek zrębowych szpiku kostnego w komórki kości
adenowirus + RUNX2: komórki zrębowe uformowały więcej kości w porównaniu do kontroli;
również – lepsza mineralizacja
PDGF: Platelet Derived Growth Factor (płytkopochodny czynnik wzrostu)
•
Zastosowanie genu PDGF w większym stopniu pobudza proliferację komórek ozębnej i
cementoblastów niż ciągłe podawanie czynnika PDGF
TGF-β (Transforming growth factor β; transformujący czynnik wzrostu beta)
•
Pozytywny efekt na regenerację kości wokół implantu
Transfer genów do gruczołów ślinowych
Kserostomia
•
•
Uszkodzenie gruczołów ślinowych (radioterapia, zespół Sjögrena, niektóre leki)
AQ1 – akwaporyna 1; kanał dla cząsteczek wody => pozytywna odpowiedź pacjentów
Wykorzystanie funkcji zewnątrzwydzielniczej
•
•
Kandydoza: infekcja oportunistyczna u pacjentów z AIDS
adenowirus z genem histatyny 3 => 90% efekt przeciwgrzybiczny
Próby wykorzystania czynności wewnątrzwydzielniczej
•
Wektor adenowirusowy + ludzki hormon wzrostu (hGH)
Szczepionki DNA
•
•
Podanie do gruczołów ślinowych plazmidu zawierającego gen kodujący białko fimbrii
Porphyromonas gingivalis
Plazmid pCIA-P z genem PAC Streptococcus mutans
Bóle twarzy
•
•
•
•
Bóle zlokalizowane w twardych i miękkich tkankach twarzy, głowy i szyi; różne przyczyny
Cel terapii genowej: ciągła produkcja i wydzielanie antynocyceptywnych białek w pobliżu
rogów grzbietowych (dorsal horn) rdzenia kręgowego
Wektor AAV z genem IL-10
wirus opryszczki z genem preproenkefaliny
Nowotwory
•
•
•
•
Rak jamy ustnej, zatok przynosowych, krtani, gardła, rak skóry twarzy i szyi
Terapia korygująca: wyciszenie ekspresji onkogenów, transfer genów supresorowych (np.
Gendicine)
Cytoredukcja: zniszczenie komórek nowotworowych: wirusy onkolityczne, wprowadzanie
genów samobójczych
Immunomodulacja: modyfikacja limfocytów, transfer do komórek nowotworowych genów
kodujących antygeny, cytokiny
Keratynocyty
•
•
Komórki naskórka, występują w śluzówce jamy ustnej
Modele zwierzęce: wykorzystanie modyfikowanych keratynocytów do wydzielania
terapeutycznych substancji: hormon wzrostu, ApoE, czynnik IX
Ortodontyczny ruch zębów
•
•
Transfer genu RANKL do tkanki przyzębia => ortodontyczny ruch zęba przyśpieszony o 150%
Transfer genu OPG => ruch zęba opóźniony o 50%
Tworzenie nowych zębów
•
•
in vivo: Identyfikacja genów odpowiedzialnych za indukowanie ząbkowania
ex vivo: Hodowla naturalnych implantów: nieunerwione, nieukrwione, ale zbudowane z tej
samej tkanki co naturalny ząb
Parodontoza
•
•
•
Wektor wirusowy z genem kodującym rozpuszczalny receptor TNF
60-80% ochrona tkanek przyzębia przed zniszczeniem w porównaniu do pacjentów nie
poddanych terapii genowej
Terapia genowa i alkoholizm
•
•
•
•
Dehydrogenaza aldehydowa: kluczowy enzym w metabolizowaniu etanolu
Mutacje obniżające aktywność enzymu: mniejsze o 2/3 ryzyko zapadnięcia na alkoholizm
Disulfiram: inhibitor dehydrogenazy aldehydowej; stosowany w leczeniu alkoholizmu
Terapia genowa: Antysensowny ssDNA komplementarny do mRNA ADH
o blokada translacji
o test na uzależnionych od alkoholu szczurach => 50% mniejsze spożycie alkoholu przez
> miesiąc po terapii
Wyciszanie genów
Interferencja RNA: naturalny proces polegający na degradacji lub zahamowaniu ekspresji
docelowego transkryptu przez specyficzne krótkie cząsteczki RNA (siRNA lub miRNA)
•
projektowanie siRNA w celu wyciszenia ekspresji szkodliwych genów
RNAi w leczeniu raka
Wyciszenie ekspresji VEGF
•
•
•
Zablokowanie angiogenezy w tkance nowotworowej
Odcięcie dopływu krwi
Zagłodzenie” nowotworu
Wyciszenie ekspresji PKN3 (kinaza białkowa N3)
•
•
•
•
Atu027
Inhibicja PKN3 zmniejsza przerzuty do węzłów chłonnych w raku prostaty
Zwierzęce modele raka płuc: zmniejszenie przerzutów w grupie zwierząt, której podano lek
Zwierzęce modele raka piersi: zapobiega przerzutom do płuc
Wyciszenie ekspresji tenascyny C (TN-C)
•
•
•
nadekspresja przyczynia się do adhezji, migracji, inwazyjności i proliferacji glejaka
„nagie” cząsteczki dsRNA, 160 pz wstrzyknięto bezpośrednio do naciekającej tkanki
nowotworowej podczas zabiegu chirurgicznego
Znaczące wydłużenie mediany czasu przeżycia pacjentów poddanych terapii w poróonaniu
do grupy kontrolnej (48,2 tygodnie vs 106,6 tygodni)
Infekcje wirusowe
Wirus Ebola
•
•
siRNA przeciwku L-polimerazie, oraz wirusowym białkom VP24 i VP35
Zastosowanie leku uchroniło zwierzęta przed śmiercią
Wirus HIV
•
•
niezwykle wysokie tempo mutacji; zwiększenie skuteczności terapii => łączenie wielu metod
wyciszania wirusowych genów
o Lentiwirusy niosące shRNA przeciwko transkryptom genów tat (trans-aktywator
transkrypcji) i rev (regulator ekspresji białek wirusowych
o wabik TAR RNA
o rybozym typu hammerhead przeciwko receptorowi CCR5
Badanie kliniczne I faza
o Zmodyfikowane komórki przyjęły się u wszystkich pacjentów w ciągu 11 dni
o
o
Nie zaobserwowano związanych z leczeniem toksyczności
Ekspresja shRNA i rybozymu – udokumentowana przez 24 miesiące obserwacji
Choroby metaboliczne
•
Obniżenie poziomu LDL: siRNA przeciwko APOB, PCSK9
o Badanie eksperymentalne na gryzoniach => znaczące obniżenie LDL
o Pierwsze badania na ludziach: siRNA przeciwko APOB jest dobrze tolerowany