Technika HPLC z detekcją UV w oznaczaniu peptydów

Artykuł sponsorowany
Technika HPLC z detekcją UV
w oznaczaniu peptydów
Na podstawie noty aplikacyjnej Dionex 234 opracował:
Rafał Bachorz, Polygen Sp. z o.o.
Wstęp
Peptydy mają istotne znaczenie w wielu procesach
fizjologicznych takich jak przekazywanie sygnałów
w komórkach. Wiele z nich zostało przebadanych
pod kątem ich aktywności jako leki. Okazało się,
że niektóre peptydy są odpowiedzialne za wazodilatację i wazokonstrykcję. Inne zaś to hormony i
neuropeptydy. Analiza peptydów jest niezbędna w
badaniach ich potencjalnego stosowania jako leki.
Oksytocyna jest neuropeptydem, który znalazł zastosowanie w stymulacji porodu, kontroli krwotoku poporodowego i stymulacji laktacji. Związek ten, będący
dużą strukturą pierścieniową (rys. 1), posiada mostek
dwusiarczkowy łączący dwie cząsteczki cysteiny. W
postaci obojętnej oksytocyna jest stabilna w zakresie
pH 3-5. W roztworach kwaśnych związek ten hydrolizuje, w roztworach obojętnych i zasadowych tworzy
dimery i inne układy polimerowe. Dzieje się tak przez
tworzenie międzymolekularnych mostków dwusiarczkowych co prowadzi do dezaktywacji peptydu.
Rysunek 1. Struktura oksytocyny.
Oksytocyna jest dostępna jako sól octanowa.
Amerykańska i europejska farmakopea (odpowiednio USP i EP) zezwalają na zawartość 6-10%
(wagowo) kwasu octowego w składzie leku. Stosowanie jonu octanowego jako przeciwjonu w terapeutykach peptydowych jest często spotykane.
16
Farmakopea amerykańska i europejska sugerują stosowanie metody HPLC do oznaczania oksytocyny i
jonu octanowego. Wersja USP wykorzystuje gradient
buforu fosforanowego i acetonitrylu na kolumnie
C18 z przepływem 1,5 ml/min. Cała analiza trwa 20
minut. Wersja EP jest bardzo podobna, ale przepływ
wynosi 1,0 ml/min co wydłuża czas analizy do 30
minut. Metodyka oznaczania kwasu octowego w obu
wersjach jest równoważna i sprowadza się do wykorzystania kolumny C18 oraz fazy ruchomej bufor
fosforanowy/acetonitryl w gradiencie. Oznaczenie
kwasu octowego zabiera 22 minuty przy przepływie
1,2 ml/min. Całkowite oznaczenie octanu oksytocyny zabiera przynajmniej 42 minuty z koniecznością
przeprowadzenia dwóch niezależnych nastrzyków.
W niniejszym opracowaniu oksytocyna i jon octanowy rozdzielone zostały w pojedynczym nastrzyku. Wykorzystana została kolumna Acclaim® Mixed Mode WAX-1, która pozwala na dobrą retencję
octanu i czas elucji oksytocyny równoważny kolumnie C18 co prowadzi do efektywnego oznaczenia obydwu związków w pojedynczym nastrzyku.
Duże możliwości metody równoczesnego oznaczania peptydu i towarzyszącego octanu zilustrowane
są przykładami oznaczenia octanu w czterech peptydach: oksytocynie, angiotensynie I, bradykininie
i neurotensynie. Kolumna Mixed Mode WAX-1 z
powodzeniem rozdziela rozważany peptyd, octan i
inne zanieczyszczenia peptydowe w czasie poniżej 30
minut. W porównaniu do oryginalnej metody z farmakopei znacznie skrócony jest całkowity czas analizy, zmniejszona ilość rozpuszczalnika i odpadów.
Zestaw HPLC
W niniejszej aplikacji wykorzystany został zestaw
do wysokosprawnej chromatografii cieczowej Dionex Ultimate 3000 składający się z: podstawki na
rozpuszczalniki SRD-3200, pompy binarnej HPG-3200M, autosamplera WPS-3000TSL (wyposażonego w pętlę 25 µl), termostatu do kolumn TCC-3200,
Laborant Nr 1/2010
Artykuł sponsorowany
detektora UV-Vis VWD-3400RS (wyposażonego w
celkę semi-micro 2,5 µl), oprogramowania chromatograficznego Chromeleon® 6.8.
Odczynniki
Woda dejonizowana 18 MΩ (lub lepsza), metanol jakości HPLC, fosforan potasu jakości HPLC, dziesięciowodny pirofosforan sodu, kwas fosforowy, bufory
pH=4 i pH=7, lodowaty kwas octowy, chlorobutanol.
próbki: Angiotensyna I (Sigma-Aldrich P/N A-9650),
bradykinina (Sigma-Aldrich P/N B-3259), neurotensyna (Sigma-Aldrich P/N N-6383), oksytocyna (Sigma-Aldrich P/N O-6379).
Warunki rozdziału chromatograficznego
Kolumna:
Acclaim® Mixed-Mode WAX-1, 5 µm, 2,1×150
mm, prekolumna Acclaim® Mixed-Mode WAX-1,
5 µm, 2,1×10 mm, holder do prekolumny
Faza ruchoma:
A: 50 mM fosforan potasu
B: methanol
Gradient:
98% A przez 5 minut, 2-50% B przez 20 minut,
50% B przez 10 minut
5 minut równowagowania przed nastrzykiem
Przepływ:
0,21 ml/min
Temperatura:
30°C
Objętość nastrzyku:
25 µl
Detekcja:
UV-Vis przy długości fali 220 nm
Szum:
≈0,06 mAU
Ciśnienie:
1400 psi (97 bar)
Wyniki i dyskusja
a) separacja
Rysunek 2 przedstawia rozdział octanu i oksytocyny w próbce peptydu na kolumnie Acclaim® Mixed
Mode WAX-1. Odczyn pH fazy ruchomej został
wyznaczony na wartość 4,2 po badaniach w zakresie 3-6. Stanowi to kompromis pomiędzy rozdzielczością, czasem retencji octanu i całkowitym czasem
analizy. Przy niższych wartościach pH octan jest
słabo zatrzymywany na kolumnie natomiast przy
wyższych wartościach pH (blisko 6) rozdzielenie
pomiędzy oksytocyną i jej peptydowymi zanieczyszczeniami jest niezadawalające. Przy optymalnym pH
(4,2) piki oksytocyny i octanu są dobrze rozdzielone
od zanieczyszczeń co pozwala na łatwą identyfikację
oraz jakościowe i ilościowe oznaczenie. Przy 27 minucie widoczny jest pik pochodzący od nieznanego
zanieczyszczenia, który nie jest obecny w referencyjnych danych z farmakopei. Całkowity czas analizy
może być skrócony do 20 minut przy nieobecności
tego zanieczyszczenia w badanej próbce.
www.czasopismolaborant.pl
Rysunek 2. Rozdział octanu i oksytocyny na kolumnie Acclaim® Mixed-Mode (odjęty został sygnał fazy ruchomej w celu uniknięcia przesunięcia linii
podstawowej).
Chlorobutanol jest często spotykanym konserwantem dozwolonym w roztworach oksytocyny przeznaczonych do zastrzyków. W celu potwierdzenia,
że jego obecność nie koliduje z oksytocyną czy octanem, został on dodany do próbki. Chromatogram
na rys. 3 pokazuje, że nie ma takiego zagrożenia a
piki oksytocyny i chlorobutanolu są bardzo dobrze
rozdzielone.
Rysunek 3. Rozdział octanu, oksytocyny i chlorobutanu na kolumnie Acclaim® Mixed-Mode (odjęty został sygnał fazy ruchomej w celu uniknięcia
przesunięcia linii podstawowej).
17
Artykuł sponsorowany
b) Analiza jakościowa, liniowość,
granica oznaczenia ilościowego
(LOQ), granica wykrywalności
(LOD)
Oznaczenie oksytocyny przy zastosowaniu metod farmakopei
europejskiej wymaga stężenia 250
µg/ml, amerykański odpowiednik
zakłada 25 µg/ml przy założeniu
że jej aktywność jest nie mniejsza
niż 400 jednostek/mg. Badanie liniowości zostało przeprowadzone
w zakresie 15 µg/ml do 250 µg/
ml tak aby uwzględnić wartości z
obydwu farmakopei. Wyznaczony współczynnik korelacji w tym
zakresie wynosi 0,9997. Wartości
LOD i LOQ zostały zmierzone
przez nastrzyknięcie próbek, które dają odpowiedź 3- i 10-krotności wartości szumu. To dało
wynik 0,06 µg/ml dla LOD i 0,2
µg/ml dla LOQ. Stężenie przeciwjonu octanowego w próbce peptydowej zmienia się znacznie w
zależności od peptydu. Liniowość
odpowiedzi octanu została zbadana w zakresie 5,0 do 35 µg/ml, co
odpowiada oczekiwanemu zakresowi zawartości octanu w badanych peptydach. Wartości współczynnika korelacji, LOD i LOQ
są zaprezentowane w tabeli 1.
c) Precyzja i dokładność analizy
octanu w oksytocynie i innych peptydach.
Zawartość octanu w próbce oksytocyny jest niewielka. Można ją
szacować na około 0,5 mola octanu przypadające na 1 mol peptydu. W przypadku innych peptydów wartość ta może sięgać aż
2,5 mola octanu przypadające na
mol peptydu. W celu precyzyjnego wyznaczenia stężenia octanu w
różnych peptydach próbki zostały
przygotowane przez rozpuszczenie 250 µg w 1 ml rozpuszczalni18
Analit
LOD
(µg/ml)
LOQ (µg/
ml)
Zakres
liniowości
(µg/ml)
Współczynnik korelacji
Precyzja
powierzchni
piku
(RSD)
Precyzja
czasu retencji (RSD)
Kwas
octowy
1,5
5
5,0-35,0
0,9994
2,40
0,08
Oksytocyna
0,06
0,2
15-250
0,9997
1,13
0,11
Tabela 1. Granica wykrywalności, granica oznaczenia ilościowego, liniowość i precyzja w oznaczeniu
octanu i oksytocyny.
Peptyd
Zawartość octanu
(µg/ml)
Precyzja czasu retencji
(min)
Precyzja pola
powierzchni piku (RSD)
szacowana
wyznaczona
octan
peptyd
octan
peptyd
Angiotensyna I
12
13,0
0,16
0,17
1,94
0,11
Bradykinina
21
19,5
0,08
0,06
0,98
0,24
Neurotensyna
20
24,0
0,08
<0,01
1,23
0,66
Oksytocyna
6,2
6,7
0,08
<0,01
0,87
0,32
Tabela 2. Oznaczenie octanu w próbkach czterech różnych octanów.
Peptyd
Zawartość octanu (µg/ml)
Odzysk (%)
w próbce wyjściowej
dodana
oznaczona
Angiotensyna I
13,0
10,0
22,8
98,0
Bradykinina
19,5
15,0
35,2
104,0
Neurotensyna
18,4
10,4
29,2
104,0
Oksytocyna
6,7
11,2
18,4
105,0
Tabela 3. Odzyski octanu w próbkach peptydów.
ka. W tabeli 2 przedstawione są
wyznaczone zawartości octanu dla
czterech rozważanych peptydów.
W żadnym przypadkach względne odchylenie standardowe (RSD)
powierzchni pików nie przekracza
2%, co jest znacznie poniżej 5%
wymogu farmakopei.
Wyznaczone zawartości octanu w
próbkach peptydów dobrze zgadają się z wartościami sugerowanymi przez producenta. Stężenia
nie różnią się o więcej niż 10% za
wyjątkiem neurotensyny, gdzie
wyznaczone stężenie przekracza o
17%
oczekiwaną
wartość.
Rysunek 4 przedstawia rozdział
octanu i peptydu dla rozważanych
próbek oksytocyny, angiotensyny I, neurotensyny i bradykininy.
W każdym przypadku ilościowe
oznaczenie peptydu i towarzyszącego jonu octanowego możliwe
jest w pojedynczym nastrzyku.
Rysunek 5 pokazuje powiększenie
otoczenia pików pochodzących
od jonów octanowych. Jak widać
mogą one być bez trudu zintegrowane bez zakłóceń ze strony innych składników próbki.
Laborant Nr 1/2010
Artykuł sponsorowany
Odzysk octanu w czterech próbkach zbadany został
przez dodanie kwasu octowego do roztworów peptydów. W przypadku neurotensyny zamiast kwasu
octowego wykorzystana była jego sól sodowa. Dodanie kwasu octowego do roztwory neurotensyny prowadziło do niespodziewanych odzysków rzędu 128132%.Prawdopodobnie zmiana pH spowodowała
uwolnienie związanego octanu z peptydu. Odzyski
wahają się w granicach 98-105% (tabela 3).
6) Wnioski
W niniejszej aplikacji przedstawiona została metoda
oznaczania peptydu i towarzyszącego jonu octanowego w pojedynczym nastrzyku. Wykorzystany został zestaw do wysokosprawnej chromatografii cieczowej Dionex Ultimate 3000 i kolumna Acclaim®
Mixed-Mode WAX-1. Metoda jest szybka, czuła i
posiada wystarczającą czułość do oznaczania octanu w próbkach zawierających 250 µg/ml peptydu.
Octan został z powodzeniem oznaczony w próbkach
czterech różnych peptydów. Zastosowanie kolumny
o średnicy wewnętrznej 2,1 mm oraz przeprowadzenie całej analizy w ramach pojedynczego nastrzyku
oszczędza czas, zmniejsza pięciokrotnie zużycie rozpuszczalników (dla próbki oksytocyny) i znacznie
zmniejsza ilość odpadów.
Rysunek 5. Powiększenie otoczenia piku pochodzącego od octanu (odjęty
został sygnał czystej fazy ruchomej w celu uniknięcia przesunięcia linii podstawowej).
Rysunek 4. Oznaczenie octanu w próbce oksytocyny, angiotensyny I, bradykininy i neurotensyny (odjęty został sygnał czystej fazy ruchomej w celu
uniknięcia przesunięcia linii podstawowej).
www.czasopismolaborant.pl
19