Wpływ diety wysokocholesterolowej i Fluorku sodu na aktywność

&ARM0RZEGL.AUK†
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
7PŒYWDIETYWYSOKOCHOLESTEROLOWEJIFLUORKUSODU
NAAKTYWNOu¿ALDOLAZYWW’TROBIEIOSOCZUKRÌLIKÌW
4HEINFLUENCEOFHIGH†CHOLESTEROLDIETANDFLUORIDEONACTIVITY
OFALDOLASEINRABBITlSLIVERANDPLASMA
%WA"IRKNER*OLANTA:ALEJSKA†&IOLKA%WA'RUCKA†-AMCZAR
!LEKSANDRA+ASPERCZYK3ŒAWOMIR+ASPERCZYK"OGNA,EWKOWICZ!LEKSANDRA&IDYK
:AKŒAD"IOCHEMII/GÌLNEJ+ATEDRY"IOCHEMIIgL’SKIEGO5NIWERSYTETU-EDYCZNEGOW+ATOWICACH
Streszczenie
Abstract
Zbadano wpływ diety wysokocholesterolowej oraz fluorku sodu na aktywność aldolazy w osoczu krwi i wątrobie.
Badania przeprowadzono na królikach, u których podaż
diety wysokocholesterolowej (2 g%) wywołała doświadczalną miażdżycę. Dodatkowo królikom podawano fluorek sodu (NaF) w dawce 3 mgF-/kg m.c./24 godz. zawarty
w wodzie pitnej. Dodatek fluorku sodu do diety królików
spowodował zmniejszenie aktywności aldolazy w osoczu
z jednoczesnym wzrostem jej aktywności w wątrobie.
W zastosowanej dawce fluorek może działać korzystnie
na szlak glikolizy i odwracać skutki oddziaływania diety
wysokocholesterolowej.
The influence of high cholesterol diet and sodium fluoride
upon the aldolase activity in plasma and liver following the
application of high cholesterol diet have been examined.
This study was carried out on rabbits fed a high-cholesterol (2 g%) diet to induce experimental atherosclerosis. The
intake of sodium fluoride (NaF) in water in dose of
3 mgF-/kg b.w./24 h was applied The addition of sodium
fluoride to the diet of rabbits resulted in a decrease of aldolase activity in plasma and in increase in the liver. In
the dose applied fluoride may beneficially influence the
glycolysis tract and reverse the consequences of cholesterol-rich diet.
Słowa kluczowe: dieta wysokocholesterolowa, fluorek
sodu, aldolaza, króliki
Key words: high cholesterol diet, sodium fluoride, aldolase, rabbits
Wstęp
Wzrost narażenia ludzi na fluor, spowodowany zwiększającym się zanieczyszczaniem środowiska, występuje od
lat 40-tych XX wieku. Do podstawowych antropogenicznych emiterów fluoru zalicza się huty żelaza, aluminium
i szkła, elektrownie węglowe, zakłady fotochemiczne i farbiarskie. Związki fluoru są stosowane do wytapiania, trawienia i polerowania metali, produkcji elektrod spawalniczych,
lutowania i procesów galwanizowania [1].
Fluor zaliczany jest do mikroelementów, czyli pierwiastków chemicznych, występujących w organizmie w bardzo
małych ilościach i niezbędnych do prawidłowego jego rozwoju. Ulega wbudowaniu w postaci fluoroapatytu do kości
i zębów [1]. Z drugiej jednak strony fluor może wywoływać
negatywne skutki zdrowotne. Zaburza bowiem przemianę
wapnia zmniejszając stężenie tego pierwiastka w surowicy
krwi. Ponadto fluorki zmniejszają aktywność wielu enzymów. Dotyczy to szczególnie kluczowych enzymów szlaku
glikolizy [2].
Miażdżyca jest złożonym, procesem chorobowym, obejmującym infiltrację ściany naczyń komórkami zapalnymi,
powstawanie i gromadzenie komórek piankowatych, proliferację komórek mięśni gładkich oraz zmiany w macierzy
zewnątrzkomórkowej i zmiany zakrzepowe [3, 4].
Oprócz klasycznych czynników ryzyka rozwoju miażdżycy jak wiek, płeć, nadciśnienie tętnicze, podwyższone
stężenie cholesterolu (głównie frakcji LDL), palenie papierosów, cukrzyca i otyłość w rozwoju zmian miażdżycowych istotną rolę odgrywają czynniki zakaźno-zapalne
[5-7].
Badania nad etiopatologią miażdżycy wskazują na ścisły
związek procesów zapalnych z ewolucją blaszki miażdżycowej. Wykazano, że przyczyną ostrego stanu wieńcowego
jest pęknięcie blaszki miażdżycowej na skutek toczących się
w niej procesów zapalnych spowodowanych m.in. infekcjami bakteryjnymi [8].
W drugiej połowie XX wieku nastąpił niezwykle dynamiczny rozwój badań mających na celu określenie przyczyn
i mechanizmów powstawania oraz sposobów zapobiegania
tej chorobie.
Ponieważ miażdżyca jest chorobą o wielu czynnikach
przyczynowych i złożonej patogenezie, autorzy pracy postanowili zbadać wpływ fluoru na proces doświadczalnie
wywołanej miażdżycy.
Do narządów najbardziej zaangażowanych w procesy
detoksykacji ksenobiotyków (w tym fluoru) należy wątroba,
dlatego też ciekawe wydaje się zbadanie funkcji tego narządu w miażdżycy u zwierząt, którym równolegle z cholesterolem podawano fluorek sodu. Jednym z enzymów, których
&ARM0RZEGL.AUK
Tab. I. Aktywność aldolazy w osoczu (na początku eksperymentu oraz po 1, 2 i 3 miesiącu jego trwania) w [IU/l]
i w wątrobie w [IU/g białka] królików karmionych dietą wysokocholesterolową (Ch2) oraz dietą z dodatkiem
fluoru (Ch2 + F)
Czas
[miesiące]
0 (osocze)
1 (osocze)
2 (osocze)
3 (osocze)
wątroba
Grupa ST
(grupa kontrolna)
Grupa Ch2
Średnia
21.86
26.76
30.10
34.21
32.00
średnia
25.29
54.15
45.73
44.02
18.25
SEM
1.03
3.02
2.93
2.13
1.49
SEM
3.08
6.86
4.99
5.10
1.51
Porównanie
grup ST
i Ch2
wartość p
0.262
0.006*
0.016*
0.200
0.004*
Grupa (Ch2 + F)
Średnia
22.42
28.10
33.24
38.72
40.33
SEM
1.22
3.82
7.88
4.08
4.81
Porównanie
grup ST
i Ch2 + F
wartość p
0.522
1.000
0.749
0.200
0.078
Porównanie
grup Ch2
i Ch2 + F
wartość p
0.337
0.025*
0.109
0.631
0.010*
*
p<0,05 wskazuje na znamienność statystyczną wyniku.
oznaczenie aktywności w osoczu, i w wątrobie jest przydatne w ocenie tej funkcji jest aldolaza [9].
Celem pracy była ocena wpływu fluorku sodu podawanego z wodą pitną królikom z hipercholesterolemią prowadzącą do wystąpienia miażdżycy doświadczalnej na aktywność aldolazy w osoczu i w wątrobie tych zwierząt.
Materiał i metody
Badania przeprowadzono na 18 królikach samcach rasy
nowozelandzkiej z początkową masą ciała 3000 g ± 50 g.
Do badań wybrano króliki rasy nowozelandzkiej, gdyż stanowią one powszechnie stosowany model do wywołania doświadczalnej miażdżycy. Ponad to, badania z użyciem królików pozwalają na monitorowanie zmian metabolicznych
podczas trwania eksperymentu. Obserwowany jest nie tylko
końcowy efekt stosowanej diety, ale co miesięczny pobór
krwi pozwolił na śledzenie dynamiki zmian po 1, 2 i 3 miesiącu ekspozycji. Przez cały okres doświadczenia zwierzęta
przebywały w standardowych warunkach laboratoryjnych
w pomieszczeniach o stałej temperaturze pokojowej (21
± 2 0C) oraz stałej wilgotności (50 – 70 %), pojedynczo
w klatkach z zachowaniem oświetleniowych cykli 12godzinnych (700 – 1900 – faza jasna, 1900 – 700 – faza ciemna). Przed rozpoczęciem eksperymentu króliki adaptowano
przez dwa tygodnie do warunków doświadczenia.
Zwierzęta podzielono na 3 grupy po sześć królików każda wg poniższego schematu:
1. Pierwsza grupa królików stanowiła kontrolę i pozostawała na standardowej diecie hodowlanej (ST).
2. Druga grupa stanowiła grupę wysokocholesterolową
(Ch2) karmioną dietą wzbogaconą w 2 g% cholesterolu.
3. Trzecia grupa królików utrzymywana była na diecie wysokocholesterolowej z dodatkiem fluorku sodu w dawce
3 mgF- /kg m.c./24 godz. (Ch2 + F).
Zwierzęta otrzymywały standardową paszę hodowlaną
(100 g na królika na dobę). Pasza standardowa wyprodukowana została w Zakładzie Żywienia Zwierząt Instytutu
Zootechnicznego w Brzezinach. Skład paszy standardowej był następujący: białko ogólne 13,1%, tłuszcz roślinny
2,4%, włókno 10,5%. Indukcję miażdżycy doświadczalnej
prowadzono stosując przez okres 3 miesięcy dietę wysokocholesterolową, która uznawana jest za dietę aterogenną
[10]. Zwierzęta z grupy badanej (Ch2) otrzymywały die-
tę standardową z dodatkiem 2g% cholesterolu. Natomiast
zwierzęta z grupy Ch2 + F otrzymywały dietę standardową
z dodatkiem 2g% cholesterolu oraz fluorek sodu w dawce
3 mgF- /kg m.c./24 godz. Cholesterol dodawano do paszy,
natomiast fluorek sodu do wody pitnej.
Podaż diety wysokocholesterolowej wywołał miażdżycę, co udokumentowano wcześniej [11].
Co 30 dni pobierano w sposób jałowy krew z żyły brzeżnej ucha w ilości 6 ml każdorazowo (jako antykoagulant stosowano EDTA). W osoczu oznaczano aktywność aldolazy
(ALD) wg Krawczyńskiego [9]. Po upływie 3 miesięcy króliki usypiano 20% roztworem uretanu etylowego stosując
dawkę 2,5 g/kg m.c. zwierzęcia.
Do badań wykorzystano osocze i tkankę wątrobową.
Z tkanki wątrobowej sporządzono 10% w/v homogenaty
(w 0,9% NaCl). W homogenatach wątroby oznaczono aktywność aldolazy metodą kolorymetryczną wg Krawczyńskiego [9] i aktywność ALD przeliczano na gram białka,
które oznaczono metodą Lowry’ego i wsp. [12].
Analiza statystyczna:
Bazę danych utworzono w programie MS EXCEL 2000.
Do analizy statystycznej wykorzystano program Statistica
PL. Jako wskaźnik statystyki opisowej użyto wartość średnią i SEM. Celem porównania aktywności ALD w grupie
kontrolnej (ST) i w grupie badanej (Ch2 + F) w każdym miesiącu eksperymentu, wykorzystano test U Manna – Whitne’a. Testem tym porównano także aktywność ALD dla grupy
kontrolnej (ST) względem grupy badanej (Ch2) w każdym
miesiącu eksperymentu. Za znamienne statystycznie uznano
wyniki, dla których p<0,05.
Wyniki
Wyniki badań biochemicznych zestawiono w tabeli.
Aktywność aldolazy w osoczu w grupie królików
otrzymujących dietę wysokocholesterolową zwiększyła
się statystycznie znamiennie, szczególnie po 1 (o 114%)
i 2 miesiącu eksperymentu (o 89 %). Dodatek do diety fluorku spowodował zmniejszenie aktywności aldolazy w osoczu
badanych królików w porównaniu do grupy wysokocholesterolowej (Ch2). Aktywność aldolazy po 1 miesiącu eksperymentu zmalała o 48 % w porównaniu do grupy zwierząt
utrzymywanych na diecie wysokocholesterolowej.
Natomiast wyniki badań tkanki wątrobowej wykazały,
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
iż dieta wysokocholesterolowa (grupa Ch2) spowodowała
zmniejszenie aktywności aldolazy w porównaniu z grupą
kontrolną (ST) o około 43%. Dodatek do diety wysokocholesterolowej fluorku (grupa Ch2 + F) spowodował statystycznie znamienny wzrost aktywności aldolazy w porównaniu do grupy wysokocholesterolowej (Ch2) o 121%.
Dyskusja
Aldolaza jest enzymem glikolizy, który rozszczepia
fruktozo-1,6-bisfosforan na dwie fosfotriozy: aldehyd 3-fosfoglicerynowy i fosfodihydroksyaceton. Stwierdzono występowanie kilku izoenzymów aldolazy. Wszystkie zawierają cztery podjednostki. W większości tkanek występuje
aldolaza A, natomiast w wątrobie i w nerkach występuje
dodatkowo aldolaza B [13].
W przedstawionej pracy stwierdziliśmy wzrost aktywności aldolazy w osoczu królików karmionych dietą wysokocholesterolową natomiast w wątrobie aktywność ta uległa
zmniejszeniu.
Enzymy glikolityczne są pochodzenia cytoplazmatycznego i ich aktywność w osoczu jest w warunkach prawidłowych niska [14]. Wzrost aktywności tych enzymów
w osoczu zwierząt eksponowanych na związki fluoru może
wskazywać na wzrost przepuszczalności błony komórkowej
lub nawet na częściową nekrozę komórek [14]. Okazuje się,
że dodatek do diety wysokocholesterolowej fluorku sodu
spowodował zmniejszenie aktywności aldolazy w osoczu
(po 1, 2 i 3 miesiącu trwania eksperymentu) oraz wzrost jej
aktywności w wątrobie względem grupy Ch2. Natomiast
porównanie grupy Ch2 + F z grupą kontrolną (ST) wykazało wzrost aktywności ALD w osoczu i w wątrobie po
1 miesiącu prowadzenia eksperymentu. Otrzymane wyniki
sugerują, że dieta wysokocholesterolowa, spowodowała wzrost przepuszczalności błon komórkowych lub też
nekrozę komórek, wskutek czego wzrosła aktywność
aldolazy w osoczu. Istotne znaczenie dla funkcji błony
cytoplazmatycznej ma prawidłowy jej skład lipidowy,
a przede wszystkim składnik fosfolipidy/cholesterol.
Zmniejszona wartość tego stosunku stwierdza się między
innymi w komórkach wątrobowych, jako typową zmianę metaboliczną w przebiegu miażdżycy. Dodatkowym
czynnikiem wpływającym na destrukcję błon komórkowych może być wzmożona peroksydacja lipidów błonowych, co powoduje wzrost przepuszczalności błony
i migrację białka w wątroby do osocza.
Dodatek do diety wysokocholesterolowej fluorku sodu
mógł spowodować, zmniejszenie aktywności nie tylko aldolazy, ale również innych enzymów glikolizy. Gumińska
i wsp. wykazali hamowanie aktywności enolazy, jak również niektórych enzymów kluczowych szlaku glikolizy pod
wpływem fluorku sodu [14].
Z licznych prac wynika, że związki zawierające fluor mogą być inhibitorami aldolazy. Magnien i wsp. [15]
stwierdzili, że fosforan 2-keto-4,4,4-trifluorobutylu (HTFP)
jest nieodwracalnym inhibitorem aldolazy. Birkner i wsp.
[16] stwierdzili, że w hiperglikemii fluorkowej, wywołanej dawkami fluorku 50 i 100 mg F-/dm3 wody pitnej, aktywność aldolazy po dawce niższej nie uległa zmianie,
natomiast po dawce 100 mg F-/dm3 wody obniżyła się.
Grucka-Mamczar i wsp. [17], badając wpływ fluorku sodu
i kofeiny na metabolizm węglowodanów u szczurów wykazali, że zastosowanie dawki 4,9 mg F-/kg m.c./dobę spowodowało zahamowanie aktywności enzymów glikolizy
w tkankach pozawątrobowych. Natomiast aktywność aldolazy w wątrobie tych szczurów zwiększyła się.
Podczas trwania całego eksperymentu zaobserwowano
także wzrost aktywności aldolazy w grupie zwierząt kontrolnych. Wyniósł on 55%. Tłumaczyć go można wzrostem
wieku badanych zwierząt. Obliczenia statystyczne uwzględniły wzrost tego parametru. Także w grupie wysokocholesterolowej zaobserwowano wzrost aktywności aldolazy.
Wyniósł on 77%, a więc był zdecydowanie większy od
wzrostu w grupie kontrolnej, świadczy to o wpływie cholesterolu zawartego w diecie.
W obecnym eksperymencie stwierdziliśmy także obniżenie aktywności aldolazy w wątrobie wskutek zastosowanej diety wysokocholesterolowej z jednoczesnym wzrostem
jej aktywności pod wpływem fluorku.
Korzystny wpływ fluorku, stwierdzony u zwierząt z doświadczalnie wywołaną miażdżycą wymaga dalszych badań
z uwagi na wykazane ostatnio prooksydacyjne działanie fluorku sodu [18-20].
Piśmiennictwo
1. Kozłowski J. Narażenie konsumentów wody do picia na
fluor w zależności od regionu Polski. Med Środowisk
2001; 4/2: 35-43.
2. Gumińska M. Biochemiczne mechanizmy działania
fluoru na żywy organizm. Folia Med Cracov 1981; 23
(3-4): 305-321.
3. Nowicka G. Etiopatogeneza miażdżycy: Rola procesu
zapalnego. Żywienie człowieka i metabolizm. 2005; 32:
245-253.
4. Mizerska M, Goch JH. Etiopatogeneza miażdżycy –
ciągle aktualny problem kliniczny. Pol Merk Lek 2006;
20: 133-138.
5. Meijs MF. i wsp. Unrecognized myocardial infarction in
subjects at high vascular risk: prevalence and determinants. Heart 2009; 95: 728-732.
6. Andersson J i wsp. The carotid artery plaque size and
echogenicity are related to different cardiovascular risk
factors in the elderly: the Prospective Investigation of
the Vasculature in Uppsala Seniors (PIVUS) study. Lipids 2009; 44: 397-403.
7. Mallika V, Goswami B, Rajappa M. Atherosclerosis
pathophysiology and the role of novel risk factors: a
clinicobiochemical perspective. Angiology 2007; 58:
513-522.
8. Villegas E i wsp. Chlamydophila pneumoniae: from
proteomics to arteriosclerosis. Enferm Infecc Microbiol
Clin. 2008; 26: 629-637.
9. Krawczyński J. Diagnostyka enzymologiczna w medycynie praktycznej. PZWL. Warszawa 1972.
10. Vesselinovitch D. Animal models and the study of atherosclerosis. Arch Path Lab Med 1988; 112: 1011-1017.
11. Stawiarska-Pięta B i wsp. Influence of fluoride on rabbit
organ morphology in atheromatosis. Fluoride 2007; 40:
116-127.
&ARM0RZEGL.AUK
12. Lowry OM i wsp. Protein measurement with the Folkin
phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: 265-275.
13. Murray RK i wsp. Biochemia Harpera. PZWL. Warszawa 2006.
14. Gumińska M, Sterkowicz J. Biochemical changes in the
blood of humans chronically exposed to fluorides. Acta
Med Pol 1975; 16: 215-224.
15. Magnien A, Le-Clef B, Belimann JE. Suicide inactivation of fructose 1,6-bisphosphate aldolase. Biochemistry 1984; 23: 6858-6862.
16. Birkner E i wsp. Aktywność aldolazy i dehydrogenazy
mleczanowej w wątrobie szczurów z hiperglikemią fluorkową. Ann Acad Med Siles 2002; 50-51: 7-11.
17. Grucka-Mamczar E i wsp. Influence of extender exposure to sodium fluoride and caffeine on the activity of
carbohydrate metabolism enzymes in rat blood serum
and liver. Fluoride 2007; 40: 62-66.
18. Chlubek D. Fluoride in medicine, biology and toxicology. Borgis Ltd. Warszawa 2003.
19. Chlubek D. Fluoride and oxidative stress. Fluoride
2003; 36: 217-228.
20. Chinoy NJ. Fluoride stress on antioxidant defence system. Fluoride 2003; 36: 38-41.
data otrzymania pracy: 01.03.2010r.
data akceptacji do druku: 20.07.2010r.
Adres do korespondencji:
prof. Ewa Birkner
Kierownik Zakładu Biochemii Ogólnej Katedry Biochemii Śląskiego Uniwersytetu
Medycznego w Katowicach
ul. Jordana 19, 41-808 Zabrze
tel/fax: +48 32 272 23 18
e-mail: [email protected]