atypowe przypadki bse w polsce wybrane aspekty diagnostyki oraz

Mirosław Polak
ATYPOWE PRZYPADKI BSE W POLSCE
WYBRANE ASPEKTY DIAGNOSTYKI ORAZ PATOGENEZY
ROZPRAWA HABILITACYJNA
RECENZENCI:
Prof. dr hab. Zbigniew Grądzki z Wydziału Medycyny Weterynaryjnej
Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie
Prof. dr hab. Jerzy Kulczycki z I Kliniki Neurologicznej Instytutu Psychiatrii i
Neurologii w Warszawie
Prof. dr hab. Michał Mazurkiewicz z Katedry Epizootiologii z Kliniką Ptaków
i Zwierząt Egzotycznych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytetu
Przyrodniczego we Wrocławiu
Prof. dr hab. Zbigniew Nozdryn-Płotnicki z Katedry Anatomii Patologicznej
Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie
Streszczenie
Podjęta próba adaptacji techniki dot-blot do diagnozowania BSE opierała się na
kilku praktycznych przesłankach. Metoda jest prosta i szybka, wymagania sprzętowe są
minimalne, a ilość powstałych odpadów typu biohazard jest niewielka. Także jakość
próbki badanej nie powinna mieć wpływu na wynik badania, ponieważ w metodzie tej
wykrywa się PrPSc, oporne na degradację. Porównanie czułości i specyficzności
opracowanego testu dot-blot wobec szybkiego testu Prionics Check WB wykazało
wyższą czułość metody dot-blot przy specyficzności na poziomie 100%. O ile w
szybkim teście próg czułości określono na poziomie rozcieńczenia 1:64, metoda dotblot dawała wynik dodatni w rozcieńczeniu 1:128, a natężenie sygnału reakcji było
porównywalne z rozcieńczeniem 1:64 w metodzie Western-blot. Praktycznym
potwierdzeniem wysokiej czułości opracowanej metody diagnostycznej były wyniki
analizy 28 polskich przypadków BSE. Wszystkie próbki (poza przypadkiem nr 2) dały
wysoko dodatnie wyniki. Wyniki uzyskane w badaniach własnych wskazują na
możliwość wdrożenia techniki dot-blot do badań diagnostycznych w kierunku BSE u
bydła. Uzyskana czułość oraz specyficzność testu w badaniu próbek dodatnich oraz
ujemnych w kierunku BSE jak również krótki czas badania predysponują technikę dotblot do wdrożenia jej do badań laboratoryjnych w kierunku gąbczastej encefalopatii
bydła (BSE).
Analiza profili glikozylacji białka umożliwia typowanie formy białka PrPSc
opornej na proteolizę, czyli PrPres, na podstawie analizy procentowej zawartości
poszczególnych jego glikoform oraz tempa migracji (wielkość analizowanych
fragmentów wyrażona w kilodaltonach – kDa). Ponieważ białko prionowe posiada dwa
miejsca przyłączania reszt cukrowych, jego rozdział w żelu poliakrylamidowym z
detekcją immunologiczną pozwala na uzyskanie sygnału reakcji w postaci trzech
prążków odpowiadających formie dwu- jedno- oraz nie-glikozylowanej białka PrPres.
Wśród 68 dodatnich przypadków BSE w Polsce, na podstawie analizy ich profili
glikozylacji i reaktywności z przeciwciałami dla białka PrP zidentyfikowano 10
przypadków atypowego BSE. Ustalone zostały kryteria zakwalifikowania danego
przypadku dodatniego jako atypowy.
Badania własne potwierdziły przydatność określenia tempa migracji form białka
res
PrP w typie-H do różnicowania go z postacią klasyczną BSE (0,5 kDa różnicy dla
formy nieglikozylowanej białka). Natomiast różnica w migracji typu-L w warunkach
praktycznych okazała się nieznaczna i zmienna w powtórzeniach, co oznaczało
konieczność zdefiniowania innych parametrów różnicowania typu-L od typu-C. W
związku z zaobserwowanym dla typu-L wzrostem zawartości formy
jednoglikozylowanej kosztem formy dwuglikozylowanej wprowadzono współczynnik
2G/1G (dwu/jednoglikozylowana) będący ilorazem procentowej zawartości formy
dwuglikozylowanej oraz jednoglikozylowanej białka PrPres. Analiza wszystkich
przypadków o typie-L wykrytych dotąd w Polsce wykazała bardzo stabilną wartość tego
współczynnika na poziomie 1,1-1,2 w przeciwieństwie do klasycznej postaci BSE,
gdzie stwierdzono wartości w zakresie 1,9-2,6.
Natomiast typ-H charakteryzował się reaktywnością z przeciwciałami dla końcaN białka PrP (12B2 oraz P4) w przeciwieństwie do typu-C oraz typu-L, które nie
reagowały z tymi przeciwciałami.
W badaniach własnych na myszkach zakażanych czynnikiem atypowego BSE,
potwierdzono udział patologicznej formy białka prionowego (PrPSc) w etiologii
choroby. Okazało się, że wraz z wydłużaniem się okresu inkubacji choroby u myszek
„zakażonych”, wprost proporcjonalnie rosła zawartość formy PrPSc opornej na
proteolizę (PrPres), od wartości 0,9 do 3,0 odpowiednio przy 68 oraz 129 dniach różnicy
w długości okresu inkubacji choroby (współczynnik korelacji r=0,93).
Badania na myszkach potwierdziły utrzymywanie się wyjściowego profilu
białka prionowego opornego na proteolizę z atypowych przypadków BSE (wyjątek
stanowił izolat 17B). Cechy specyficzne dla typu-L oraz typu-H z atypowych
przypadków BSE pozostały niezmienne po transmisji zakażenia na myszki
transgeniczne. Badania porównawcze mysich i bydlęcych profili glikozylacji i wzorców
migracji PrPres potwierdziły unikalny charakter dwóch nowych typów BSE i
zachowanie cech pierwotnych w nowym gospodarzu. Ten etap analizy atypowego BSE
może stanowić podstawę do zaliczenia wariantów BSE wyizolowanych w Polsce do
nowych szczepów czynnika BSE.
Summary
An attempt undertaken to adapt dot-blot technique for BSE diagnosis was based
on several practical hints. The method is simple and fast, equipment requirements
are minimal and the amount of biohazard waste produced during the testing is low.
Also the sample quality should not influence the final result, since PrPres detected
with this technique is resistant to degradation. Sensitivity and specificity
comparisons of the developed dot-blot method with commercially available Prionics
Check WB rapid test showed higher sensitivity of dot-blot with specificity at 100%.
While the detection limit for rapid test was estimated to be at the dilution of 1:64,
dot-blot method was positive at 1:128 dilution with the signal strength comparable
to 1:64 dilution in western-blot. Expected results of the analysis of 28 Polish cases
of BSE were a practical confirmation of the high sensitivity of the dot-blot method.
All samples (except sample from case #2) gave very high positive response. Results
from this study indicate the feasibility of the implementation of dot-blot method in
the diagnostic lab testing cattle for BSE. Data from sensitivity and specificity trails
using confirmed BSE positive and BSE negative samples as well as the short testing
time favour the dot-blot method to be introduced in laboratory diagnosis of bovine
spongiform encephalopathy (BSE).
Glycoprofile analysis enables the typing of PrPSc protein resistant to proteolysis
(PrPres), based on percentage of each glycoform and the migration distance. Since
the prion protein binds two sugar residues, its resolution in polyacrylamide gel with
immunological detection yields the reaction pattern comprised of 3 bands
representing di-, mono- and non-glycosylated moieties of PrPres.
Based on the glycoprofile analysis and reactivity patterns with antibodies for PrP
protein among 68 positive cases of BSE diagnosed in Poland, 10 were classified as
atypical BSE. Criteria for atypical BSE were elaborated to help to classify every
positive case as classical or atypical BSE.
Results from this study confirmed the usefulness of the evaluation of migration
distance of PrPres for distinguishing H-type BSE from classical BSE (0.5 kDa
difference for nonglycosylated moiety). The same criterion used for L-type BSE was
found to be less obvious and gave various results upon repetitive testing which
forced us to find other parameters for L-type identification and its distinction from
C-type BSE. Ratio 2G/1G (di/monglycosylated) being the result of dividing the
percentage of diglycosylated moiety by the percentage of monglycosylated moiety
of PrPres was introduced when in L-type BSE it was observed that the amount of
monoglycosylated PrPres was higher and at the same time the content of
diglycosylated PrPres was lower when compared with C-type BSE. Analysis of all
diagnosed L-type BSE cases found in Poland so far showed very stable value for
this ratio at the level of 1.1-1.2 opposite to C-type BSE where the ratio reached 1.92.6.
H-type BSE was characterized by reactivity with N-terminal anti-PrP antibodies
(12B2 and P4) opposite to C-type and L-type BSE, which did not react with those
antibodies.
Results from inoculation of mice with homogenates from atypical BSE
confirmed the involvement of pathological form of prion protein (PrPSc) in disease
etiology. In inoculated mice it was observed that parallel to the increased incubation
time the level of PrPSc resistant to proteolysis (PrPres) was also rising from 0.9 to 3.0
when the difference in incubation time was 68 and 129 days respectively
(correlation coefficient r=0.93).
Studies in mice confirmed the stability of PrP profile of atypical BSE upon
transmission. Typical features of L-type and H-type atypical BSE remained
unchanged when tested in inoculated mice. Comparative studies of glycoprofiles
and migration rates of PrPres in mice and bovines confirmed the unique features of
two new types of BSE and their stability upon transmission into a new host. The
results of this analysis of atypical BSE variants may be the basis for the introduction
of the term new isolates of BSE when referring to atypical BSE of L-type and Htype.