ĆWICZENIE nr
Transkrypt
ĆWICZENIE nr
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione. Spektrofotometryczna metoda oznaczania aktywności peroksydazy Cel ćwiczenia: Ćwiczenie poświęcone jest zapoznaniu się z metodą oznaczania aktywności peroksydazy chrzanowej jako jednego z enzymów z klasy oksydoredukataz. Wprowadzenie: Peroksydazy (EC 1.11.1.1-14) to grupa enzymów należących do klasy oksydoreduktaz katalizujących utlenianie nadtlenkiem wodoru różnych substratów organicznych i nieorganicznych (Verma i Dubey, 20003). Grupą prostetyczną peroksydaz może być kofaktor hemowy, a także reszty selenocysteiny lub cysteiny luźno związane z apoenzymem. W reakcji katalizowanej przez peroksydazę, nadtlenek wodoru jest redukowany kosztem różnych związków np. kwasu askorbinowego, hydrohinonów i zredukowanego cytochromu. Sumarycznie równanie reakcji katalizowanej przez peroksydazę przedstawia się następująco: H2O2 + AH2 2 H2O + A gdzie: AH2 i A to, odpowiednio, substrat w stanie zredukowanym i utlenionym. Peroksydazy roślinne należą do kluczowych enzymów kontrolujących różnicowanie się i rozwój komórek roślinnych. Biorą one udział w takich procesach, jak: wczesny rozwój roślin, kiełkowanie, dojrzewanie owoców, starzenie oraz opadanie liści. Dodatkowo pełnią funkcję enzymów o charakterze antyoksydantów, uczestnicząc w unieczynnianiu reaktywnych form tlenu (RFT). RFT powstają w każdej żywej komórce jako nieuchronny produkt metabolizmu tlenowego. Nadmierne ich generowanie prowadzi do stresu „oksydacyjnego” oddziałując negatywnie na funkcje wszystkich organelli komórkowych, uszkadzając białka, lipidy oraz kwasy nukleinowe (Zacchini i in., 2003). Organizmy roślinne i zwierzęce wykształciły system antyoksydacyjny, który składa się zarówno z enzymów (dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza, peroksydaza oraz alternatywna oksydaza) jak i związków niskocząsteczkowych (askorbinian, cysteina, glutation). Do peroksydaz biorących udział w usuwaniu RFT należą: peroksydaza glutationowa, gwajakolowa czy askorbinowa (Mehlhorn, i in., 1996). Enzymy te zlokalizowane są m.in. w cytozolu, wakuoli, chloroplastach, ścianie komórkowej i przestrzeni międzykomórkowej. Uczestniczą nie tylko w obronie antyoksydacyjnej, ale również biorą udział w procesach lignifikacji, biosyntezie etylenu i obronie przed patogenami. Peroksydazy są wysoce specyficzne w stosunku do donora wodoru (np. peroksydaza cytochromowa, peroksydaza NADH, peroksydaza NADPH) lub niespecyficzne przenosząc atom wodoru z organicznego substratu na nadtlenek wodoru (np. peroksydaza chrzanowa). Prawie wszystkie peroksydazy niespecyficzne są hemoproteinami. Dzięki występowaniu ugrupowania hemowego połączonego ze specyficznym białkiem wykazują one charakterystyczne widmo absorpcyjne. Utworzenie przejściowego kompleksu enzymu z H2O2, powoduje aktywacje nadtlenku wodoru, w wyniku, czego działa jako akceptor wodoru. Peroksydazy mogą również katalizować reakcję bezpośredniego utlenienia substratów z udziałem tlenu cząsteczkowego. Do peroksydaz o charakterze niespecyficznym należy m.in. peroksydaza chrzanowa. Jest ona glikoproteiną o masie cząsteczkowej 44 kDa, zawierającą cztery reszty lizynowe. 1 Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione. Substratem, a więc donorem wodoru mogą być m.in. fenole oraz aminy tj. e-toluidyna, gwajakol czy pirogalol. Oznaczanie aktywności peroksydazy chrzanowej Aktywność peroksydazy może być oznaczana na podstawie: spadku stężenia nadtlenku wodoru, spadku stężenia donoru wodoru lub pomiarze poziomu utworzonych produktów utlenienia. Na dzisiejszych ćwiczeniach pomiar aktywności peroksydazy chrzanowej będzie się opierał na trzeciej metodzie, czyli na pomiarze poziomu utworzonych produktów utlenienia. Przy oznaczaniu aktywności peroksydazy nadtlenek wodoru stosuje się w niewielkim nadmiarze ze względu na jego inaktywujące działanie na enzymy. Reakcję przeprowadza się przez 5-10 minut ze względu na szybkie wyczerpywanie się nadtlenku wodoru. Zasada fotometrycznej metody oznaczania aktywności peroksydazy chrzanowej Metoda opiera się na reakcji utleniania pirogalolu do purpurogaliny przy udziale nadtlenku wodoru. Ilość powstającej purpurogaliny mierzona jest fotometrycznie przy długości fali 430 nm i temperaturze 25°C. Próbę materiałową wykonuje się bez dodatku H 2O2 w celu wyeliminowania aktywności oksydazy polifenolowej, która również wykazuje właściwości utleniające. Aktywność peroksydazy uzyskujemy poprzez odjęcie od absorbancji dla prób pełnych wartość absorbancji dla prób materiałowych (Próba pełna – Próba materiałowa). Rys. 1. Utlenienie pirogalolu do purpurogaliny. Odczynniki 1. 0.2 M bufor fosforanowy pH 7.0: 2. 0.2 M roztwór pirogallolu 3. 0.01 M H2O2 4. 10% Kwas siarkowy 5. 10% Siarczyn sodowy 6. 2.5 g Chrzanu/1000ml Wykonanie Wyciąg enzymowy (zadanie kontrolne) uzupełnić wodą destylowaną w kolbie miarowej na 25 ml. Procedura Wykonywane są następujące próby: 2 Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione. 1) kontrolna zawiera wszystkie składniki, ale bez wyciągu enzymowego. Służy do wyzerowania spektrofotometru i kompensuje absorbancję pochodzącą od odczynników. 2) materiałowa bez dodatku H2O2 w celu wyeliminowania aktywnej w roślinach oksydazy polifenolowej wykazującej właściwości utleniające pirogalol. 3) pełna zawierająca wszystkie odczynniki oraz enzym i H2O2. Aktywność peroksydazy chrzanowej wykonuje się w buforze fosforanowym pH 7.0, temperaturze 25oC, inkubację prowadzi się przez 10 minut. Do probówek należy odpipetować następujące ilości odczynników: Próba kontrolna Próba materiałowa Próba pełna (w 2 powtórzeniach) (w 2 powtórzeniach) 0.15 ml 0.15 ml 0.15 ml Bufor fosforanowy Bufor fosforanowy Bufor fosforanowy -----0.5 ml 0.5 ml Enzym Enzym 0.7 ml 0.7 ml 0.2 ml Woda destylowana Woda destylowana Woda destylowana Wstawić do łaźni wodnej na 5 minut o temperaturze 25 ° C 0.5 ml -----0.5 ml Nadtlenek wodoru Nadtlenek wodoru 0.15 ml 0.15 ml 0.15 ml Pirogalol Pirogalol Pirogalol Inkubować w łaźni wodnej przez 10 minut o temperaturze 25 ° C 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Kwas siarkowy Kwas siarkowy Kwas siarkowy* 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Siarczyn sodowy Siarczyn sodowy Siarczyn sodowy** 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml Woda destylowana Woda destylowana Woda destylowana *zahamowanie reakcji przez dodanie 10 % kwasu siarkowego ** rozłożenie pozostałego nadtlenku wodoru Absorbancję uzyskanych roztworów (2 próby pełne, 2 próby materiałowe) należy odczytać w fotometrze wobec próby kontrolnej przy długości fali 430 nm. Opracowanie wyników Od średniej wartości absorbancji prób pełnych odjąć średnią wartość absorbancji prób materiałowych. Dla otrzymanej absorbancji odczytać z krzywej wzorcowej stężenie purpurogaliny. Obliczyć aktywność peroksydazy wyrażona w μmol purpurogaliny utworzonej w ciągu 1 minuty w przeliczeniu na 1 g korzenia. 3 Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione. Przykładowe obliczenie Absorbancja prób pełnych 1 Absorbancja prób pełnych 2 Średnia absorbancja prób pełnych Absorbancja prób materiałowych 1 Absorbancja prób materiałowych 2 Średnia absorbancja prób materiałowych 0.175 0.164 0.170 0.020 0.030 0.025 Różnica Stężenie purpurogaliny (μg) 0.145 900 Różnica absorbancji 0.145 W 0.5 ml próby znajduje się 900 μg purpurogaliny W 25 ml (w kolbce)- 45 000 μg purpurogaliny (900 μg x 50) Do kolbki przed dopełnieniem jej wodą do objętości 25 ml wlano np. 3 ml analizowanego ekstraktu z korzenia chrzanu (wartość tę poda prowadzący ćwiczenie, po zanotowaniu różnic absorbancji P pełna – P materiałowa). W 3 ml roztworu było 45 000 μg purpurogaliny, zatem w 1000 ml: 45 000 μg purpurogaliny x 1000/3 = 15 000 000 μg purpurogaliny Masa molowa purpurogaliny 220 μg/μmol, zatem 15 000 000 μg/220 μg/μmol = 68 181 μmol Do doświadczenia użyto 2.5 g korzenia chrzanu a aktywność musimy przeliczyć na 1 g i na 1 minutę: 68 181 μmol x 1 g/2.5 g = 27 272 μmol 27 272 μmol x 1 minuta/10 minut = 2727 μmol Schemat rozcieńczeń 2.5g 1000 ml X ml Zadanie kontrolne 25 ml 0.5 ml Pytania: 1) Do jakiej klasy enzymów należą peroksydazy i jakie reakcje katalizują? 2) Wyjaśnij, dlaczego w metodach oznaczania aktywności peroksydaz reakcję prowadzi się tylko przez krótki czas? 3) W jaki sposób przerywa się na ćwiczeniu reakcję katalizowaną przez peroksydazę chrzanową? W jakim celu po zakończeniu reakcji enzymatycznej dodaje się siarczynu sodowego? 4) Czym różnią się próby kontrolne od prób pełnych w fotometrycznej metodzie oznaczania aktywności peroksydazy? Do czego służy próba kontrolna, materiałowa oraz pełna? 4 Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione. Literatura: 1) Becana M, Dalton DA, Moran JF, Iturbe-Ormaetxe I, Matamoros MA, Rubio MC. 2000. Reactive oxygen species and antioxidants in legume nodules. Physiologia Plantarum 109: 372–381. 2) Mehlhorn H, Lelandais M, Korth HG, Foyer CH. 1996. Ascorbate is the natural substrate for plant peroxidases? FEBS Lett: 378:203–206 3) Małecka A., Tomaszewska B. 2005. Reaktywne formy tlenu w komórkach roślinnych i enzymatyczne systemy obronne. Postępy Biologii Komórki 32:311-325 4) Verma, S. and R.S. Dubey, 2003. Lead toxicity induces lipid peroxidation and alters the activities of antioxidant enzymes in growing rice plants. Plant Sci: 164: 645-655. 5) Zacchini M., Rea E., Tullio M., de Agazio M. 2003. Increased antioxidative capacity in maize calli during and after oxidative stress induced by a long lead treatment. Plant Physiology and Biochemistry: 41: 49-54. 5