pobierz

Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 3, str. 659–671
PRACA ORYGINALNA – Original Article
SONIA KANIUKA1, AGNIESZKA PIEKARSKA2, PIOTR GRABARCZYK3, WITOLD
PREJZNER2, MARIA BIENIASZEWSKA2, JOANNA KISIELEWSKA4, EWA BROJER3, JAN MACIEJ ZAUCHA5
Określenie progowej liczby kopii wirusa CMV w reakcji PCR
w czasie rzeczywistym wskazującej na aktywną replikację
wirusową u chorych po allogenicznej transplantacji komórek
krwiotwórczych
Identification of cut-off value of CMV copies number in real time
PCR indicating an active viral replication in patients after allogeneic
hematopoietic cell transplantation
1
Klinika Endokrynologii i Chorób Wewnętrznych Akademii Medycznej w Gdańsku
Kierownik: Dr hab. Krzysztof Sworczak
2
Katedra i Klinika Hematologii i Transplantologii Akademii Medycznej w Gdańsku
Kierownik: Prof. dr hab. Andrzej Hellmann
3
Pracownia Biologii Molekularnej Zakładu Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej
Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
Kierownik: Prof. dr hab. Ewa Brojer
4
Pomorskie Centrum Traumatologii Wojewódzki Szpital Specjalistyczny im. Mikołaja Kopernika
w Gdańsku
Ordynator: Dr med. Andrzej Szczerba
5
Zakład Propedeutyki Onkologii Akademii Medycznej w Gdańsku
Kierownik: Dr hab. Wiesław J. Kruszewski
STRESZCZENIE
Do niedawna standardową metodą monitorowania aktywności cytomegalowirusa (CMV) u chorych, po allogenicznym przeszczepieniu komórek krwiotwórczych (allo-HCT) było oznaczanie
wczesnego antygenu wirusa CMV w komórkach krwi (antygenemii CMV). Obecnie w tym celu
coraz powszechniej określa się liczbę kopii wirusa CMV za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Wprowadzenie tej metody do praktyki klinicznej wymaga jednak określenia progowej wartości, powyŜej której wyniki świadczą o aktywnej replikacji
wirusa. W pracy przedstawiono próbę określenia takiej wartości oceniając jednoczasowo wykonane badania antygenemii CMV i RT-PCR u 25 kolejnych chorych poddanych allo-HCT. Badania wykonano u 17 chorych, o medianie 9 par badań (2–24) u jednego chorego. Dla antygenemii
równej 1 mediana kopii/ml wynosiła 1035 (0–5200). U wszystkich chorych z negatywnymi wynikami badania antygenemii CMV, Ŝaden z wyników RT-PCR nie był wyŜszy od 1000, i tylko
jeden przekraczał 500 kopii/ml. U wszystkich chorych, u których stwierdzono antygen wirusa, w
co najmniej jednej komórce (antygenemia≥1), przynajmniej jeden wynik RT-PCR przekraczał
wartość 500 lub 1000 kopii/ml. Swoistość badania RT-PCR dla wyników ≥1000 kopii/ml była
większa od 90%, a czułość wynosiła 74,5%. Wykrycie, co najmniej 1000 kopii/ml metodą RT-
660 S. KANIUKA i wsp.
PCR zawsze wiązało się z występowaniem reaktywacji i stwierdzeniem dodatniej antygenemii i
wyprzedzało dodatni wynik antygenemii o medianę 11 (0–24) dni. Na podstawie powyŜszych
wyników przyjęto, Ŝe leczenie przeciwwirusowe naleŜy włączyć przy liczbie wyniku≥1000 kopii/ml, natomiast u chorych wysokiego ryzyka rozpoczęcie leczenia moŜna rozwaŜyć przy liczbie
kopii wirusa w RT-PCR≥ 500.
SŁOWA KLUCZOWE: Cytomegalowirus – Przeszczepienie komórek krwiotwórczych – Reakcja
PCR w czasie rzeczywistym – Antygenemia CMV
SUMMARY
Cytomegalowirus (CMV) activity in recipients of allogeneic hematopoietic cell transplantation
(allo-HCT) has been monitored until recently with the standard pp65 antigen assay (antigenemia). Nowadays molecular methods such as polymerase chain reaction is used more frequently to
asses the number of viral copies in real time (RT-PCR). Introduction of this method to clinical
practice needs defining cutoff value above which the results prove an active viral replication.
Here we describe an attempt to estimate the cutoff value by comparison the results of antigenemia and RT-PCR performed at the same time in 25 consecutive patients after allo-HCT. 17 patients were eligible for analysis, with median 9 paired tests (2–24) performed for 1 patient. For
antigenemia equal to 1 median RT-PCR value was 1035 copies/ml (0–5200). In all cases with
negative antigenemia results, there was no RT-PCR results higher than 1000 copies/ml, and only
one was above 500 copies/ml. In all patients with one positive antigenemia result, at least one
RT-PCR result was above 500 or 1000. For cutoff value≥1000 PCR specificity exceeded 90%
with sensitivity of 74,5%. PCR results ≥1000 copies preceded in each case positive antigenemia
of median 11 (0–24) days. Based on these data we decided to start antiviral treatment as soon
PCR results exceeded 1000 copies/ml. However treatment might be initiated in patients with high
risk of CMV reactivation when RT-PCR≥ 500 copies/ml.
KEY WORDS: Cytomegalovirus – Hematopoietic cell transplantation – Real-time PCR – Antigenemia CMV
WSTĘP
Pierwotne zakaŜenie cytomegalowirusem (ang. cytomegalovirus, CMV) zwykle
następuje w dzieciństwie i nie pociąga za sobą powaŜnych następstw klinicznych.
U około 60% dorosłych w krajach rozwiniętych i blisko 100% w krajach rozwijających
się [1], stwierdza się obecność przeciwciał potwierdzających przebytą infekcję. Po
zakaŜeniu pierwotnym wirus pozostaje w organizmie w formie utajonej (latentnej), ale
w pewnych warunkach moŜe ponownie uzyskać zdolność replikacji. Mechanizmy reaktywacji nie są do końca poznane, wiadomo jednak, Ŝe sprzyja temu upośledzenie
odporności występujące między innymi u chorych poddanych immunosupresji z powodu przeszczepień narządów miąŜszowych lub komórek układu krwiotwórczego.
Niepohamowana reaktywacja wirusa prowadzi do rozwoju choroby cytomegalowirusowej [2], która najczęściej manifestuje się zapaleniem płuc, jelit, wątroby i siatkówki
oraz supresją szpiku kostnego [3, 4].
Reaktywacja wirusa CMV dotyczy 30% do 50% chorych po allogenicznym przeszczepieniu komórek krwiotwórczych (hematopoietic cell transplantation, HCT) [5].
Rokowanie w przypadku rozpoznania choroby CMV u takich pacjentów jest powaŜne,
30% chorych umiera mimo włączenia leczenia [2, 6–8]. Dlatego do standardu opieki
Określenie progowej liczby kopi wirusa CMV
661
po HCT naleŜy monitorowanie reaktywacji CMV celem włączenia odpowiednio wcześnie leczenia wyprzedzającego rozwój pełnoobjawowej choroby CMV. Do niedawna
podstawową metodą wykrywania reaktywacji wirusa CMV było badanie antygenemii,
czyli wykrywanie specyficznego dla wirusa antygenu pp65 w zakaŜonych leukocytach.
DuŜym ograniczeniem tej metody jest brak moŜliwości wykonania badania w okresie
aplazji [9, 10]. Ponadto jest to technika czasochłonna, nie zautomatyzowana, wymaga
kilkugodzinnego opracowania materiału [9, 11], a wynik badania w duŜej mierze zaleŜy od umiejętności technicznych i doświadczenia diagnosty [12]. Dlatego coraz powszechniejsze zastosowanie, równieŜ w Polsce, znajduje reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (real time-polymerase chain reaction, RT-PCR) oceniająca
liczbę kopii wirusowego DNA we krwi obwodowej. Dowodem replikacji jest albo
wykrycie duŜej liczby kopii wirusa albo jej systematyczne narastanie [13]. Stwierdzenie niewielkiej ilości wirusowego DNA nie zawsze musi świadczyć o aktywnej replikacji wirusa. Nie jest jasne, powyŜej jakiej progowej ilości (punktu odcięcia) kopii
wirusowych we krwi obwodowej moŜna rozpoznać aktywną replikację, co obligowałoby do rozpoczęcia leczenia. Arbitralne przyjęcie punktu odcięcia w laboratoriach
wprowadzających RT-PCR jako podstawową metodę monitorowania replikacji wirusa
CMV jest trudne, szczególnie wobec rozbieŜnych doniesień w literaturze i braku międzynarodowego standardu, który umoŜliwiłby porównanie róŜnych metod. Jedni
przyjmują za punkt odcięcia 1000 kopii/ml [14], zaś inni 500 kopii/ml [15]. Są i tacy
którzy przyjmują 10 000 kopii/ml [16]. W aktualnych rekomendacjach dotyczących
diagnostyki CMV po transplantacji komórek hematopoetycznych zaproponowanych w
czasie europejskiej konferencji dotyczącej infekcji w białaczkach w 2008 roku zalecane jest monitorowanie zakaŜenia CMV oznaczeniem antygenemii, albo wirusowego
DNA lub mRNA. Wybór metody pozostawiony jest ośrodkowi transplantacyjnemu,
który wraz ze współpracującym laboratorium określa najlepiej sprawdzającą się metodę w praktyce klinicznej [17].
W obecnej pracy podjęto próbę określenia progowej liczby kopii wirusowego
DNA, której przekroczenie świadczyłoby o jego aktywnej replikacji przy przyjęciu
badania antygenemii CMV za metodę referencyjną. Ocenialiśmy swoistość i czułość
reakcji RT-PCR dla róŜnych progów odcięcia, poszukując najbardziej optymalnych
parametrów. Określaliśmy równieŜ, czy reakcja PCR pozwala na wcześniejsze wykrycie replikacji CMV przy załoŜeniu, Ŝe badanie antygenemii wykonuje się dwa razy
natomiast badanie RT-PCR jeden raz w tygodniu.
MATERIAŁY I METODY
Badana grupa
Do badania włączono kolejnych 25 chorych poddanych w Klinice Hematologii
i Transplantologii AM w Gdańsku przeszczepieniu komórek układu krwiotwórczego
w okresie od marca 2004 do października 2005. Charakterystykę chorych przedstawiono w tabeli 1.
662 S. KANIUKA i wsp.
Tabela 1. Charakterystyka pacjentów
Table 1. Characteristics of patients
Charakterystyka
Mediana wieku (zakres wielu)
Płeć
Kobiety
MęŜczyźni
Choroba podstawowa:
AML
ALL
CML
CLL
MDS
Inne
Rodzaj przeszczepianego materiału
PBSCT
Szpik
Krew pępowinowa
Pokrewieństwo
Dawca spokrewniony
Dawca nie spokrewniony
Status CMV
Biorca CMV neg/Dawca CMV neg
Biorca CMV neg/Dawca CMV poz
Biorca CMV poz/Dawca CMV poz lub neg
36 (21–55)
liczba/%
14/56
11/44
8/32
2/8
6/24
2/8
5/20
2/8
19/76
5/20
1/4
14/56
11/44
3/12
1/4
21/84
Ocena reaktywacji wirusa
Do oceny replikacji wirusa zastosowano dwie metody: badanie antygenemii i RTPCR. Krew (2ml) pobierano na wersenian sodu jednoczasowo do dwóch probówek.
Jedną z nich analizowano w laboratorium centralnym Akademii Medycznej w Gdańsku, gdzie wykonywano badanie antygenemii pp65, a drugą przekazywano do Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie, gdzie badano DNA CMV metodą RTPCR.
Antygenemia CMV
Oznaczenie antygenemii CMV wykonywano dwa razy w tygodniu zgodnie z instrukcją producenta (Clonab CMV; Biotest, Dreieich, Germany). Leukocyty separowane z pełnej krwi pobranej na EDTA nanoszono na szkiełko podstawne, a następnie
utrwalano formaldehydem. Obecność wirusa stwierdzano przy pomocy monoklonalnych przeciwciał C10/11 skierowanych do antygenu pp65 CMV oraz alkalicznej fosfatazy połączonej z przeciwciałami reagującymi z mysimi immunoglobulinami. CMV
pozytywne komórki były liczone w mikroskopie świetlnym. Wynik przedstawiono
jako liczbę komórek, w których stwierdzono wirusa CMV w 50 000 analizowanych
Określenie progowej liczby kopi wirusa CMV
663
leukocytów. Za dodatni wynik przemawiający za reaktywacją wirusa CMV przyjęto
stwierdzenie, co najmniej jednej dodatniej komórki.
Technika RT-PCR
DNA wirusa CMV wykrywano uŜywając reakcji łańcuchowej polimerazy (quantitative real time PCR) zgodnie z procedurą opisaną przez Machida i wsp. [18], której
zastosowanie kliniczne było opisywane wcześniej [19;20]. Całkowite DNA izolowano
z 200 ml pełnej krwi pobranej na EDTA uŜywając QIAamp Blood Mini-Kit (Qiagen,
Germany, Hilden). Pięć mikrolitrów wyizolowanego DNA poddawano amplifikacji w
aparacie ABI Prism 7700 (Applera) [19]. Koncentracja wirusowego DNA była określana poprzez odczytanie liczby kopii wirusa z krzywej standardowej na podstawie
otrzymanej wartości Ct. Wyniki badania ilościowego RT-PCR wirusa CMV przedstawiono w jednostkach kopie/ml. Czułość metody określono na 200 kopii/ml.
Metody statystyczne
Czułość i swoistość badania PCR określono w odniesieniu do badania antygenemii,
które przyjęto za metodę referencyjną [21]. Przy poszczególnych progach odcięcia
badania PCR (>0, ≥250, ≥500 i ≥1000) czułość wyraŜono stosunkiem wyników prawdziwie dodatnich (tj. PCR dodatnich przy dodatniej antygenemii) do sumy prawdziwie
dodatnich i fałszywie ujemnych (tj. PCR ujemnych przy dodatniej antygenemii), swoistość przedstawiono stosunkiem wyników prawdziwie ujemnych (tj. PCR ujemnych
przy negatywnej antygenemii) do sumy prawdziwie ujemnych i fałszywie dodatnich
(tj. PCR dodatnich przy negatywnej antygenemii). Wartość predykcyjną dodatnią badania PCR określano jako stosunek badań prawdziwie dodatnich do sumy wyników
prawdziwie i fałszywie dodatnich, a wartość predykcyjną ujemną jako stosunek badań
prawdziwie ujemnych do badań prawdziwie i fałszywie ujemnych. Obliczenia statystyczne opracowano z uŜyciem testu chi-kwadrat oraz U-Mann-Whitney przyjmując
wartość p równą 0,05 za istotną statystycznie.
WYNIKI
Jednoczasowe oznaczenie antygenemii i RT-PCR wykonano w sumie w 174 próbkach pobranych od 17 (z 25) chorych. Mediana liczby par badań u pojedynczego chorego wynosiła 9 (2 – 24). Dodatni wynik badania antygenemii stwierdzono w 47 próbkach pochodzących od 8 chorych. U 4 chorych zaobserwowano więcej niŜ jeden epizod reaktywacji.
Analiza par badań – Korelacja pomiędzy wynikami antygenemii CMV i RT- PCR
Liczbę kopii wirusa wykrytych w badaniu RT-PCR w odniesieniu do wyniku badania antygenemii wyraŜonego liczbą zainfekowanych komórek przedstawiono w tabe-
664 S. KANIUKA i wsp.
li 2. Wzrastającym wartościom wyników antygenemii towarzyszyły wzrastające wartości mediany kopii wirusa w badaniu RT-PCR.
Tabela 2. Wyniki ilościowego badania RT-PCR dla przedziałów wartości badania antygenu pp65
Table 2. The results of quantitative RT-PCR corresponding to each level of antigenemia
Wartość
antygenemii*
0
1
2
od 3 do 10
>10
Mediana ilości kopii
wirusa CMV
0
1035
1550
5580
23380
min.
max.
Liczba badań
0
0
0
365
3930
6770
5200
11130
184650
123280
127
14
12
13
8
*– liczba komórek, w których wykryto antygen pp65
W próbkach, w których nie wykrywano antygenu mediana koncentracji wirusa
wynosiła równieŜ 0 (0–6770) i róŜniła się istotnie statystycznie od mediany ilości kopii
równej 1035 (0–5200) stwierdzonej w próbkach z wynikiem antygenemii 1 (p<0.001).
Wśród 127 próbek z negatywnym wynikiem oznaczenia antygenemii (pp65=0) w 12
(9,4% wyników) stwierdzono >1000 kopii/ml, a w 21 (16,5% wyników) >500 kopii/ml. W tej grupie próbek częstość wyniku badania RT-PCR powyŜej 1000 kopii/ml
nie róŜniła się statystycznie istotnie od częstości wyniku > 500 kopii/ml (p=0,07).
Swoistość, specyficzność, wartości predykcyjna dodatnia i ujemna badania PCR
dla róŜnych progów odcięcia
Czułość i swoistość badania PCR oraz jego wartość predykcyjną dodatnią i ujemną
przy progach odcięcia 0, 250, 500 i 1000 kopii/ml przedstawiono w tabeli 3. Podnosząc wartość progu odcięcia badania PCR, powyŜej którego wyniki interpretujemy
jako dodatnie, zwiększa się swoistość testu, ale zmniejsza się jego czułość. Podobnie
przy wzroście progu odcięcia podnosi się wartość predykcyjną dodatnią badania PCR,
ale zmniejsza się wartość predykcyjna ujemna.
Tabela 3. Zmienność parametrów testu diagnostycznego w zaleŜności od przyjętego progu dla wyników
badania RT-PCR
Table 3. The variability of RT-PCR test characteristics according to the change in cut-off values
Wynik badania RT-PCR istotny klinicznie (kopie/ml)
>0
≥250
≥500
≥1000
78,7%
74,5%
Czułość
93,6%
89,36%
Swoistość
67,7%
73,23%
83,5%
90,6%
Wartość predykcyjna dodatnia
51,8%
55,26%
63,8%
74,5%
Wartość predykcyjna ujemna
96,6%
94,90%
91,4%
90,6%
Określenie progowej liczby kopi wirusa CMV
665
Przedstawione wyniki wskazują, Ŝe przy progu odcięcia 1000 kopii uzyskujemy
wysoką (90,6%) swoistość i wysoką ujemną wartość (90,6%) predykcyjną badania RTPCR przy utrzymaniu satysfakcjonującej czułości (74,5%) i wartości predykcyjnej
dodatniej (74,5%). Na tej podstawie w dalszej analizie za wartość progową badania
RT-PCR sugerującą aktywną replikację przyjęto wynik 1000 kopii/ml.
Analiza chorych
Chcąc lepiej określić kliniczną wartość wybranego progu odcięcia 1000 kopii/ml
przeanalizowano kolejne wyniki badań RT-PCR u poszczególnych chorych. U 5 pacjentów z wszystkimi negatywnymi wynikami badania antygenemii CMV, Ŝaden z wyników badania RT-PCR nie przekroczył 1000 kopii/ml (mediana 0 (0–870) kopii/ml),
natomiast wynik badania RT-PCR powyŜej 500 kopii/ml stwierdzono tylko u jednego
chorego w jednym oznaczeniu. U wszystkich 8 chorych, z co najmniej jednym dodatnim wynikiem badania antygenemii CMV, w kolejnych oznaczeniach otrzymano wynik powyŜej 1000 kopii/ml w przynajmniej jednym z następujących po sobie oznaczeń.
Analiza dodatnich wyników PCR (≥1000 kopii/ml) przy negatywnych badaniach
antygenemii
Analizując indywidualnie 12 par wyników z negatywną antygenemią (pp65=0)
i dodatnim wynikiem RT-PCR (PCR≥1000 kopii/ml), stwierdzono, Ŝe 11 to wyniki uzyskane od osób, u których w kolejnych badaniach stwierdzono dodatnie wartości antygenemii, potwierdzające ostatecznie reaktywację. Tylko w przypadku jednego wyniku nie
moŜna było jednoznacznie określić, czy u chorego miała miejsce reaktywacja.
Na tej podstawie moŜna uznać 11 wyników, które dotąd traktowaliśmy jako fałszywie dodatnie (które zaniŜały swoistość badania) za wyniki prawdziwie dodatnie.
W tabeli 4 przedstawiono zmianę czułości, swoistości oraz wartości predykcyjnej dodatniej i ujemnej badania RT-PCR dla progu odcięcia 1000 kopii/ml przy uznaniu powyŜszych 11 badań za badania prawdziwie dodatnie.
Tabela 4. Zmienność parametrów testu diagnostycznego przed i po przeliczeniu wyników pierwotnie
fałszywie dodatnich na prawdziwie dodatnie
Table 4. The variability of RT-PCR test characteristics before and after recalculation of false positive to
true positive results
Czułość
Swoistość
Wartość predykcyjna dodatnia
Wartość predykcyjna ujemna
Uznaniu wyników 11oznaczeń RT-PCR+/pp65- jako
fałszywie ujemne
prawdziwie dodatnie
74,5%
79,3%
90,6%
99,1%
74,5%
97,9%
90,6%
90,6%
Przedstawione powyŜej wyniki sugerują, Ŝe dodatnie badania PCR przy progu odcięcia 1000 kopii wyprzedzają uzyskanie dodatniego badania antygenemii.
666 S. KANIUKA i wsp.
Analizując w ten sam sposób 21 par wyników RT-PCR≥500 kopii/ml i negatywnej
antygenemii (pp65=0), wykazaliśmy, Ŝe aŜ w 4 przypadkach nie stwierdzono później
dodatnich wyników badań antygenemii, co wskazuje, Ŝe moŜna przyjąć te badania za
wyniki fałszywie dodatnie.
Która z metod PCR czy CMV wcześniej wskazuje na reaktywacje wirusa?
Przyjmując za reaktywację wirusa CMV punkt odcięcia 1000 kopii CMV DNA
rozpoznano 13 reaktywacji u 8 pacjentów. U wszystkich chorych, u których rozpoznano reaktywację CMV za pomocą PCR rozpoznano równieŜ reaktywację CMV za pomocą badania antygenemii. Porównując daty otrzymania pozytywnych wyników
w obu metodach PCR wyprzedza pp65Ag o 3–24 dni (mediana 11 dni). W jednym
przypadku wyniki dodatnie w obu metodach pojawiły się w tym samym czasie. Nie
odnotowaliśmy sytuacji, w której dodatni wynik pp65Ag poprzedzałby pojawienie się
w surowicy DNA wykrywanego metodą PCR. W pozostałych 5 przypadkach porównanie nie było moŜliwe.
DYSKUSJA
Wprowadzenie monitorowania reaktywacji wirusa CMV metodami biologii molekularnej wymaga określenia przez kaŜde z laboratoriów progu wartości, powyŜej którego wyniki dowodzą aktywnej replikacji wirusa. Wiadomo, bowiem, Ŝe samo wykrycie wirusowego DNA w reakcji PCR nie jest równowaŜne z jego aktywnym namnaŜaniem, z drugiej strony wiadomo równieŜ, Ŝe wzrastającej liczbie kopii wirusa odpowiada wzrastające ryzyko rozwoju choroby CMV [22, 23]. Natomiast, przy jakich
wartościach naleŜy włączyć leczenie wyprzedzające nie jest jednoznacznie rozstrzygnięte. Wysoka czułość testu gwarantuje, Ŝe metoda wykryje replikację wirusa niemal
zawsze. Oczywiste jest, Ŝe podwyŜszając próg odcięcia danego badania zwiększamy
jego swoistość tracąc jednocześnie na czułości metody. W naszej pracy przy próbie
określenia progowej wartości RT-PCR za metodę referencyjną przyjęliśmy oznaczanie
antygenemii, w której stwierdzenie juŜ jednej dodatniej komórki jest wystarczające do
rozpoznania namnaŜania wirusa i włączenia leczenia. Mimo ograniczeń związanych
z subiektywizmem wykonującego oznaczanie metoda ta od wielu lat dobrze sprawdzała się w naszym ośrodku w codziennej praktyce klinicznej. Według danych literaturowych przy odpowiednim doświadczeniu osób wykonujących badanie swoistość metody oceniana jest na 80% do 100% [24, 25].
W naszej pacy podjęliśmy próbę wyznaczenia takiej wartości progowej RT-PCR,
dla której uzyskamy najwyŜszą swoistość metody przy satysfakcjonującej czułości.
Wybór określonych wartości z istoty swojej jest arbitralny. W zebranym materiale
wykazaliśmy podobnie jak inni [2, 14, 15, 26, 27], Ŝe rosnącym wynikom antygenemii
odpowiada równieŜ wzrost liczby kopii wirusa. Uzyskane wyniki sugerowały uznanie
wartość 1000 kopii/ml za właściwy punkt odcięcia. Analiza wyników u pacjentów bez
reaktywacji wirusa CMV (stwierdzanej badaniem antygenemii) potwierdzała słuszność
Określenie progowej liczby kopi wirusa CMV
667
przyjętego roboczo punktu odcięcia, poniewaŜ Ŝaden z wyników RT-PCR nie przekraczał wartości 1000 kopii/ml u tych chorych. Jednak przyjmując za punkt odcięcia wartość 500 kopii/ml otrzymaliśmy tylko jeden wynik przemawiający fałszywie w tym
przypadku za reaktywacją. Stąd na tej tylko podstawie trudno rozstrzygnąć, którą
z wartości uznać za optymalną.
Na podstawie własnego materiału ustaliliśmy, Ŝe przyjmując próg odcięcia 0 badanie PCR odznacza się wysoką czułością (93,6%) i niską swoistością (67,7%) co w konsekwencji stwarza ryzyko włączenia toksycznego leczenia u pacjentów niewymagających takiej terapii. Analizując próg odcięcia wyników badania RT-PCR na poziomie
250, 500 i 1000 kopii/ml uznaliśmy, Ŝe najkorzystniejszy kompromis miedzy swoistością i czułością badania uzyskuje się dla wartości 1000 kopii/ml. Za przyjęciem takiego
progu odcięcia przemawiała równieŜ mediana oznaczeń antygenemii takich próbek
(równa 1) oraz szczegółowa analiza 12 par wyników pp65 ujemnych (pp65=0) i RTPCR dodatnich (≥1000 kopii/ml). Wykazaliśmy bowiem, Ŝe w 11 oznaczeniach pomimo ujemnej początkowo antygenemii doszło ostatecznie do reaktywacji wirusa CMV.
Przy przeniesieniu tych wyników do grupy prawdziwie dodatnich swoistość metody
wzrosłaby do 99% przy czułości 79%. PowyŜsza analiza pozwoliła równieŜ na stwierdzenie, Ŝe dodatnie badanie PCR przy progu odcięcia 1000 wyprzedzało pojawienie się
dodatniego badania antygenemii o medianę 11 dni.
Analogicznych wniosków nie moŜna było wyciągnąć dla progu odcięcia 500 kopii/ml gdyŜ 4 oznaczenia były wynikami rzeczywiście fałszywie ujemnymi, a takich
wyników dla progu odcięcia 1000 kopii/ml nie stwierdzono. Tym niemniej w przypadku chorych wysokiego ryzyka reaktywacji CMV wydaje się rozsądne rozwaŜenie przyjęcia niŜszego progu odcięcia (≥500 kopii/ml). Klinicysta w decyzji o włączeniu leczenia przeciw-wirusowego nie powinien kierować się jedynie samą wartością RT-PCR.
W literaturze rozpiętość przyjętych progów wartości wirusowego DNA w metodzie
PCR obligujących do włączenia leczenia waha się od 200 do 10 000 kopii/ml [2, 14,
15, 28–33]. Kalpoe i wsp. [2] decyzję o włączeniu terapii antywirusowej uzaleŜniają
nie tylko od ilości kopii, ale równieŜ od innych czynników takich jak poprzednio przebyta infekcja CMV oraz szybkość narastania ilości kopii wirusa. W sytuacji pierwotnej
infekcji CMV oraz szybkiego namnaŜania wirusa autorzy proponują przyjęcie progu
odcięcia 1000 kopii/ml. Li i wsp. [14] dzieląc chorych na grupy wysokiego, umiarkowanego oraz niskiego ryzyka choroby CMV postulują przyjąć punkty odcięcia odpowiednio na poziomie 1000, 4000 i 10000 kopii/ml. Podobnie Lilleri i wsp. przyjęli za
punkt odcięcia warunkujący rozpoczęcie terapii wartość 10 000 kopii/ml. Natomiast
Gimeno i wsp. [33] proponują włączenie leczenia przeciwwirusowego u pacjentów, u
których ilość CMV DNA juŜ w dwóch kolejnych oznaczeniach PCR przekracza 288
kopii/ml. Z kolei Ikewaki i wsp. [15] określili wartość progową obligującą do rozpoczęcia terapii antywirusowej dla grupy wysokiego ryzyka choroby CMV na 500 kopii/ml. Jednocześnie autorzy poddali w wątpliwość proponowany przez innych próg
200 kopii/ml [29;30], który ich zdaniem stwarza ryzyko włączania niepotrzebnego
leczenia naraŜając chorych na działania niepoŜądane leków. DuŜa rozpiętość wartości
progowych PCR wynika najprawdopodobniej z róŜnych celów badawczych stawianych
668 S. KANIUKA i wsp.
sobie przez autorów prac. Poszukując najkorzystniejszego kompromisu pomiędzy swoistością i czułością Ikewaki [15] wybrał niŜszy próg (500 kopii/ml) niŜ stawiający na
wysoką wartość predykcyjną dodatnią Lilleri (10 000 kopii/ml) [28]. Na podstawie
naszej analizy wykazaliśmy, Ŝe dla wartości progowej PCR 1000 kopii/ml parametry
testu są najkorzystniejsze, choć nie ma istotnych rozbieŜności w rozpoznawaniu reaktywacji pomiędzy wartościami 1000 a 500 kopii/ml. Być moŜe to mała ilość oznaczeń
nie pozwoliła na wykreślenie wyraźniejszych granic, jednak trudno mówić o wyznaczaniu jednego progu dla niejednolitej pod względem ryzyka reaktywacji grupy pacjentów. W decyzji o włączaniu leczenia naleŜy, bowiem uwzględnić czynniki ryzyka
szybkiej progresji do choroby CMV, do których naleŜy dawca niespokrewniony, występowanie choroby przeszczep przeciw gospodarzowi oraz intensywność leczenia
immunosupresyjnego w szczególności stosowanie kortykosterydów. W naszej opinii
przy obecności czynników ryzyka próg odcięcia 500 naleŜy uznać za wystarczający do
włączenia leczenia, podczas gdy u chorych bez czynników ryzyka z włączeniem leczenia moŜna poczekać do chwili przekroczenia wartości PCR>1000 kopii/ml.
Podsumowując moŜna stwierdzić, Ŝe monitorowanie molekularne wirusa CMV za
pomocą reakcji RT-PCR raz w tygodniu u chorych po allo-HCT jest ekwiwalentne do
badania wczesnego antygenu dwa razy w tygodniu. Metoda molekularna szybciej wykrywa reaktywację wirusa, co daje zwolennikom badań molekularnych argument do
zastąpienia oznaczeń antygenemii badaniami molekularnymi. Na podstawie uzyskanych przez nas wyników, uznaliśmy, Ŝe badanie RT-PCR dla wartości ≥1000 kopii/ml
uzyskuje optymalną czułość i swoistość. Stąd przyjęliśmy, Ŝe przekroczenie ilości kopii≥1000/ml obliguje do rozpoznania reaktywacji i włączenia leczenia przeciwwirusowego, natomiast u chorych obciąŜonych czynnikami ryzyka rozpoczęcie terapii naleŜy
rozwaŜyć juŜ przy wartościach ≥ 500 kopii/ml.
Podziękowania
Autorzy serdecznie dziękują dr Ryszardowi Szydło z Londynu za pomoc w analizie statystycznej wyników oraz Małgorzacie Anzel i Piotrowi Kuźmińskiemu studentom ówcześnie działającego Koła Naukowego przy Katedrze i Klinice Hematologii i
Transplantologii Akademii Medycznej w Gdańsku (opiekun dr Agnieszka Piekarska),
aktywnie uczestniczących w zbieraniu danych do pracy.
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
Cope AV, Sweny P, Sabin C, Rees L, Griffiths PD, Emery VC. Quantity of cytomegalovirus viruria is
a major risk factor for cytomegalovirus disease after renal transplantation. J Med Virol 1997; 52(2):
200-205.
Kalpoe JS, Kroes AC, de Jong MD, Schinkel J, de Brouwer CS, Beersma MF, Claas EC. Validation
of clinical application of cytomegalovirus plasma DNA load measurement and definition of treatment
criteria by analysis of correlation to antigen detection. J Clin Microbiol 2004; 42(4): 1498-1504.
Określenie progowej liczby kopi wirusa CMV
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
669
Boeckh M, Nichols WG. Immunosuppressive effects of beta-herpesviruses. Herpes 2003; 10(1): 1216.
Gentile G, Capobianchi A, Ferraironi M, Greco E, Martino P. Relationship of serum human herpesvirus 6 DNA with cytomegalovirus pp65 antigenemia in allogeneic bone marrow transplant recipients.
Transplantation 2004; 77(12): 1907-1908.
Leruez-Ville M, Ouachee M, Delarue R, Sauget AS, Blanche S, Buzyn A, Rouzioux C. Monitoring
cytomegalovirus infection in adult and pediatric bone marrow transplant recipients by a real-time
PCR assay performed with blood plasma. J Clin Microbiol 2003; 41(5): 2040-2046.
Razonable RR, Brown RA, Espy MJ, Rivero A, Kremers W, Wilson J, Groettum C, Smith TF, Paya
CV. Comparative quantitation of cytomegalovirus (CMV) DNA in solid organ transplant recipients
with CMV infection by using two high-throughput automated systems. J Clin Microbiol 2001; 39(12):
4472-4476.
Whitley RJ, Jacobson MA, Friedberg DN, Holland GN, Jabs DA, Dieterich DT, Hardy WD, Polis
MA, Deutsch TA, Feinberg J, Spector SA, Walmsley S, Drew WL, Powderly WG, Griffiths PD, Benson CA, Kessler HA. Guidelines for the treatment of cytomegalovirus diseases in patients with AIDS
in the era of potent antiretroviral therapy: recommendations of an international panel. International
AIDS Society-USA. Arch Intern Med 1998; 158(9):957-969.
Ljungman P, Perez-Bercoff L, Jonsson J, Avetisyan G, Sparrelid E, Aschan J, Barkholt L, Larsson K,
Winiarski J, Yun Z, Ringden O. Risk factors for the development of cytomegalovirus disease after allogeneic stem cell transplantation. Haematologica 2006; 91(1):78-83.
Boeckh M, Boivin G. Quantitation of cytomegalovirus: methodologic aspects and clinical applications. Clin Microbiol Rev 1998; 11(3):533-554.
Mori T, Okamoto S, Matsuoka S, Yajima T, Wakui M, Watanabe R, Ishida A, Iwao Y, Mukai M,
Hibi T, Ikeda Y. Risk-adapted pre-emptive therapy for cytomegalovirus disease in patients undergoing allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant 2000; 25(7):765-769.
Guiver M, Fox AJ, Mutton K, Mogulkoc N, Egan J. Evaluation of CMV viral load using TaqMan
CMV quantitative PCR and comparison with CMV antigenemia in heart and lung transplant recipients. Transplantation 2001; 71(11):1609-1615.
Boeckh M, Gallez-Hawkins GM, Myerson D, Zaia JA, Bowden RA. Plasma polymerase chain reaction for cytomegalovirus DNA after allogeneic marrow transplantation: comparison with polymerase
chain reaction using peripheral blood leukocytes, pp65 antigenemia, and viral culture. Transplantation
1997; 64(1):108-113.
Emery VC, Sabin CA, Cope AV, Gor D, Hassan-Walker AF, Griffiths PD. Application of viral-load
kinetics to identify patients who develop cytomegalovirus disease after transplantation. Lancet 2000;
355(9220):2032-2036.
Li H, Dummer JS, Estes WR, Meng S, Wright PF, Tang YW. Measurement of human cytomegalovirus loads by quantitative real-time PCR for monitoring clinical intervention in transplant recipients. J
Clin Microbiol 2003; 41(1):187-191.
Ikewaki J, Ohtsuka E, Satou T, Kawano R, Ogata M, Kikuchi H, Nasu M. Real-time PCR assays
based on distinct genomic regions for cytomegalovirus reactivation following hematopoietic stem cell
transplantation. Bone Marrow Transplant 2005; 35(4):403-410.
Gerna G, Lilleri D, Caldera D, Furione M, Zenone BL, Alessandrino EP. Validation of a DNAemia
cutoff for preemptive therapy of cytomegalovirus infection in adult hematopoietic stem cell transplant
recipients. Bone Marrow Transplant 2008; 41(10):873-879.
Ljungman P, de la CR, Cordonnier C, Einsele H, Engelhard D, Reusser P, Styczynski J, Ward K.
Management of CMV, HHV-6, HHV-7 and Kaposi-sarcoma herpesvirus (HHV-8) infections in patients with hematological malignancies and after SCT. Bone Marrow Transplant 2008; 42(4):227-240.
Machida U, Kami M, Fukui T, Kazuyama Y, Kinoshita M, Tanaka Y, Kanda Y, Ogawa S, Honda H,
Chiba S, Mitani K, Muto Y, Osumi K, Kimura S, Hirai H. Real-time automated PCR for early diag-
670 S. KANIUKA i wsp.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
nosis and monitoring of cytomegalovirus infection after bone marrow transplantation. J Clin Microbiol 2000; 38(7):2536-2542.
Grabarczyk P, Brojer E, Nasiłowska B. Ilościowe badania DMA CMV techniką real-time PCR; standaryzacja metody i wstępne wyniki u chorych hematologicznych. Acta Haematologia Polonica 2003;
34(4):447-457.
Grabarczyk P, Brojer E, Nasiłowska B, Mariańska B. UŜyteczność ilościowego badania techniką realtime PCR do wykrywania i monitorowania zakaŜenia cytomegalowirusem po przeszczepieniu allogenicznych komórek krwiotwórczych. Polski Merkuriusz Lekarski 2006; XXI(123):227-231.
Jędrychowski W. Zasady planowania i prowadzenia badań naukowych w medycynie. Trafnośc procedur diagnostycznych. 2004: 59-63.
Gerna G, Furione M, Baldanti F, Sarasini A. Comparative quantitation of human cytomegalovirus
DNA in blood leukocytes and plasma of transplant and AIDS patients. J Clin Microbiol 1994;
32(11):2709-2717.
Mendez JC, Espy MJ, Smith TF, Wilson JA, Paya CV. Evaluation of PCR primers for early diagnosis
of cytomegalovirus infection following liver transplantation. J Clin Microbiol 1998; 36(2):526-530.
Bhatia J, Shah BV, Mehta AP, Deshmukh M, Sirsat RA, Rodrigues C. Comparing serology, antigenemia assay and polymerase chain reaction for the diagnosis of cytomegalovirus infection in renal
transplant patients. J Assoc Physicians India 2004; 52:297-300.
Greanya ED, Partovi N, Yoshida EM, Shapiro RJ, Levy RD, Sherlock CH, Stephens GM. The role of
the cytomegalovirus antigenemia assay in the detection and prevention of cytomegalovirus syndrome
and disease in solid organ transplant recipients: A review of the British Columbia experience. Can J
Infect Dis Med Microbiol 2005; 16(6):335-341.
Onishi Y, Mori S, Higuchi A, Kim SW, Fukuda T, Heike Y, Tanosaki R, Minematsu T, Takaue Y,
Sasaki T, Furuta K. Early detection of plasma cytomegalovirus DNA by real-time PCR after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Tohoku J Exp Med 2006; 210(2):125-135.
Yaghobi R, Behzad-Behbahani A, Sabahi F, Roustaee MH, Alborzi A, Ramzi M, Nourani H. Comparative analysis of a double primer PCR assay with plasma, leukocytes and antigenemia for diagnosis of active human cytomegalovirus infection in bone marrow transplant patients. Bone Marrow
Transplant 2005; 35(6):595-599.
Lilleri D, Baldanti F, Gatti M, Rovida F, Dossena L, De Grazia S, Torsellini M, Gerna G. Clinicallybased determination of safe DNAemia cutoff levels for preemptive therapy or human cytomegalovirus infections in solid organ and hematopoietic stem cell transplant recipients. J Med Virol 2004;
73(3):412-418.
Yakushiji K, Gondo H, Kamezaki K, Shigematsu K, Hayashi S, Kuroiwa M, Taniguchi S, Ohno Y,
Takase K, Numata A, Aoki K, Kato K, Nagafuji K, Shimoda K, Okamura T, Kinukawa N, Kasuga N,
Sata M, Harada M. Monitoring of cytomegalovirus reactivation after allogeneic stem cell transplantation: comparison of an antigenemia assay and quantitative real-time polymerase chain reaction. Bone
Marrow Transplant 2002; 29(7):599-606.
Mori T, Okamoto S, Watanabe R, Yajima T, Iwao Y, Yamazaki R, Nakazato T, Sato N, Iguchi T,
Nagayama H, Takayama N, Hibi T, Ikeda Y. Dose-adjusted preemptive therapy for cytomegalovirus
disease based on real-time polymerase chain reaction after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant 2002; 29(9):777-782.
Ruell J, Barnes C, Mutton K, Foulkes B, Chang J, Cavet J, Guiver M, Menasce L, Dougal M, Chopra
R. Active CMV disease does not always correlate with viral load detection. Bone Marrow Transplant
2007; 40(1):55-61.
Yaghobi R, Behzad-Behbahani A, Sabahi F, Roustaee MH, Alborzi A, Ramzi M, Nourani H. Comparative analysis of a double primer PCR assay with plasma, leukocytes and antigenemia for diagnosis of active human cytomegalovirus infection in bone marrow transplant patients. Bone Marrow
Transplant 2005; 35(6):595-599.
Określenie progowej liczby kopi wirusa CMV
671
33. Gimeno C, Solano C, Latorre JC, Hernandez-Boluda JC, Clari MA, Remigia MJ, Furio S, Calabuig
M, Tormo N, Navarro D. Quantification of DNA in plasma by an automated real-time PCR assay (cytomegalovirus PCR kit) for surveillance of active cytomegalovirus infection and guidance of preemptive therapy for allogeneic hematopoietic stem cell transplant recipients. J Clin Microbiol 2008;
46(10):3311-3318.
Praca wpłynęła do Redakcji 24.09.2008 r. i została zakwalifikowana do druku 14.04.2009 r.
Adres autora do korespondencji:
dr hab. Jan Maciej Zaucha
Zakład Propedeutyki Onkologii
Akademii Medycznej w Gdańsku
Gdyńskie Centrum Onkologii
Szpital Morski w Gdyni
ul. Powstania Styczniowego 1
81-519 GDYNIA
tel-fax/tel:0048-58-69-98-156/105
email: [email protected]
Adres pierwszego autora
lek. med. Sonia Kaniuka
Klinika Endokrynologii i Chorób Wewnętrznych
Akademii Medycznej w Gdańsku
ul. Dębinki 7
80-952 Gdańsk
tel-fax/tel:0048-58-349-28-40/41
e-mail: [email protected]