instrukcja (kliknij żeby pobrać)

http://mt.ch.pw.edu.pl/page/2.php
Otrzymywanie polimerów z użyciem enzymów
Biotransformacje są procesami, które wykorzystują aparat enzymatyczny organizmów
żywych do prowadzenia kontrolowanych reakcji chemicznych. W tych procesach najczęściej
wykorzystuje się całe komórki drobnoustrojów lub wyizolowane z różnych źródeł enzymy o
różnym stopniu oczyszczenia.
Enzymy najczęściej składają się z części białkowej (tzw. apoenzymu) oraz niebiałkowej,
grupy prostetycznej i koenzymów. Grupy prostetyczne pełnią funkcje przenośników
elektronów w trakcie biotransformacji. Część białkowa odpowiada natomiast za konfiguracje
przestrzenną oraz zmiany hydrofobowości centrum aktywnego.
Wiele rodzin enzymów może być wykorzystane do przekształcenia nie tylko ich
naturalnych substratów, ale wielu różnych związków, otrzymując wiele użytecznych
materiałów. Wykorzystanie enzymów w syntezie organicznej ma wiele zalet: reakcja
przebiega w łagodnych warunkach w odniesieniu do temperatury, ciśnienia, pH, co prowadzi
do zmniejszenia wydatku energentycznego.
Rys. 1 Wpływ katalizatora na szybkość reakcji chemicznej
Ponadto odznaczają się wysoką specyficznością i kierunkowością działania. Enzymy są
chemo-, regio- i enancjoselektywne, często można nimi zastąpić drogie i nietrwałe
katalizatory syntetyczne. Polimeryzację enzymatyczną definiuje się, jako chemiczną syntezę
polimerów („in vitro”) na drodze nieametabolicznej reakcji, przy udziale wyizolowanych
enzymów.
1
Struktura enzymów (czwartorzędowa struktura białkowa) zapewnia zarówno stabilność jak i
selektywność enzymów. Z jednej strony zwarta struktura enzymu odpowiada za jego
stabilność, układając się w taki sposób, iż wnętrze enzymu stanowi hydrofobowy rdzeń a na
zewnątrz występują grupy hydrofilowe. Z drugiej, odpowiednia struktura zapewnia
specyficznym substratom dostęp do miejsca aktywnego, eksponując przy tym część
hydrofobowego rdzenia.
Selektywność enzymów związana jest z możliwością ich „dopasowania” do substratu.
Wyróżnia się trzy modele owego dopasowania:

tzw. model klucza i zamka (Fisher, 1894) – zakłada, iż substrat reakcji i enzym
pasują do siebie tak idealnie, jak klucz do zamka. Odpowiednie ukształtowanie
przestrzenne substratu znajduje odbicie w konformacji miejsca aktywnego
enzymu.

tzw. model trzypunktowego dołączenia (Ogston, 1984) – zakłada, iż wystarczą
tylko trzy wiązania, by enzym połączył się z substratem

tzw. model indukowanego dopasowania (Koshland, 1958) – zakłada
możliwość niewielkiego dopasowania enzymu do substratu, by pasował do
niego właśnie jak „klucz do zamka” . W czasie dopasowywania następuje
pewne odkształcenie centrum aktywnego i substratu.
Poziom reakcji enzymatycznej definiowany, jako ilość powstałego produktu lub ubytku
substratu w jednostce czasu.
𝜈𝑖 =
𝑑[𝑃]
𝑑𝑡
=
−𝑑[𝑆]
𝑑𝑡
gdzie ν – poziom przemiany
[P]- stężenie produkty reakcji
[S]- stężenie substratu reakcji
Wartość aktywności enzymatycznej jest określana zgodnie z definicją IUPAC jako jednostka
standardowa enzymu U (ang. Unit) i jest równoważna z międzynarodową jednostką
aktywności (ang. International Unit) dla substancji biologicznie czynnych. U wyraża ilość
2
enzymu katalizującą przemianę 1 µmola substratu w czasie 1 minuty w optymalnych
warunkach reakcji, przy stężeniu substratu gwarantującym pełne wysycenie enzymu.
1 𝑈𝑛𝑖𝑡 ≡ 1 𝐼𝑈 ≡ 1 𝑈 ≡ 1 𝜇𝑚𝑜𝑙 ∙ 𝑚𝑖𝑛−1
Zdecydowanie ważniejszą jednostką jest aktywność właściwa (ang. Specific activity), które
wyraża wartość U na mg białka, oraz aktywność objętościowa (ang. Volumetric activity), U na
mL. Jednostki te określają stopień czystości preparatów enzymatycznych
1 𝑈 (𝑚𝑔 𝑏𝑖𝑎ł𝑘𝑎)−1 = 1 𝜇𝑚𝑜𝑙 (𝑚𝑖𝑛 ∙ 𝑚𝑔 𝑏𝑖𝑎ł𝑘𝑎)−1 ≡ 𝑎𝑘𝑡𝑦𝑤𝑛𝑜ś𝑐 𝑤ł𝑎ś𝑐𝑖𝑤𝑎
1 𝑈 ∙ 𝑚𝐿−1 = 1 𝜇𝑚𝑜𝑙(𝑚𝑖𝑛 ∙ 𝑚𝐿)−1 ≡ 𝑎𝑘𝑡𝑦𝑤𝑛𝑜ść 𝑜𝑏𝑗ę𝑡𝑜ś𝑐𝑖𝑜𝑤𝑎
Używaną wielkością określającą aktywność enzymu jest również aktywność molekularna.
Jest to liczba cząsteczek substratu przekształconych w produkt w czasie 1 minuty prze 1
cząsteczkę enzymu, w optymalnych warunkach reakcji. Wyrażana w jednostkach min-1.
1𝑈 ∙ 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑒𝑛𝑧𝑢𝑚𝑢 −1 ≡ 𝑎𝑘𝑡𝑦𝑤𝑛𝑜ść 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑘𝑢𝑙𝑎𝑟𝑛𝑎
W celu określenia aktywności enzymów zawierających kilka miejsc aktywnych podaje się
aktywność centrum katalitycznego, która jest równa aktywności molekularnej podzielonej
przez liczbę centrów aktywnych enzymu. Aktywność molekularna i centrów aktywnych
zastąpiły wcześniej używaną jednostkę liczby obrotów (ang. turnover number/frequency, tof.
𝑡𝑜𝑓 =
𝑖𝑙𝑜ść 𝑐𝑧ą𝑠𝑡𝑒𝑐𝑧𝑒𝑘 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑢 ,𝑘𝑡ó𝑟𝑒 𝑚𝑜𝑔ą 𝑧𝑜𝑠𝑡𝑎ć
𝑝𝑟𝑧𝑒𝑘𝑠𝑧𝑡𝑎ł𝑐𝑜𝑛𝑒 𝑝𝑟𝑧𝑒𝑧 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑤 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑘𝑡
𝑐𝑧𝑎𝑠 [𝑠]∙𝑙𝑖𝑐𝑧𝑏𝑎 𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑜𝑤 𝑎𝑘𝑡𝑦𝑤𝑛𝑦𝑐ℎ
W związku z problemami w ustaleniu dokładnej ilości czystego enzymu Komitet Enzymowy w
1972 roku wprowadził kolejną jednostkę aktywności enzymatycznej – katal (kat). Katal jest
definiowany, jako aktywność (ilość lub wielkość aktywności), która przekształca 1 mol
substratu w czasie 1 sekundy. Jej mianem jest [mol·s-1]. Jednostka ta przyjmuje bardzo małe
wartości, w związku z tym użytkowymi wielkościami są mikrokatal (µkat), nanokatal (nkat) i
pikokatal (pkat).
1 𝑘𝑎𝑡 = 1
𝑚𝑜𝑙
𝑠
𝑚𝑜𝑙
= 60 𝑚𝑖𝑛 = 60 ∙ 106 𝜇𝑚𝑜𝑙 ∙ 𝑚𝑖𝑛−1 = 6 ∙ 107 𝑈
1𝑈 = 0,16667 ∙ 10−7 𝑘𝑎𝑡
𝜇𝑘𝑎𝑡 = 10−6 𝑘𝑎𝑡
3
𝑛𝑘𝑎𝑡 = 10−9 𝑘𝑎𝑡
𝑝𝑘𝑎𝑡 = 10−12 𝑘𝑎𝑡
Odpowiednio wielkości pochodne będą definiowane, jako:

aktywność objętościowa - [µkat·L-1]

aktywność właściwa - [µkat·kg-1]

aktywność molekularna - [kat·mol-1]
Aktywność katalityczna enzymów zależy od:

temperatury – szybkość reakcji enzymatycznej wzrasta wraz z temperaturą
do określonej temperatury, po przekroczeniu której zaczyna maleć w
wyniku inaktywacji termicznej enzymu

stężenia jonów wodorowych – aktywność enzymu pojawia się w roztworze
o pH, w którym rozpoczyna się dysocjacja grup karboksylowych i
stopniowo wzrasta przy dalszym zwiększaniu, pH aż do wartości
maksymalnej (optimum, pH). Dalsze zwiększanie pH powoduje obniżenie
się aktywności enzymu w związku z oddysocjowywaniem jonów
wodorowych od grup – NH3+.

potencjał oksydo-redukcyjny – niektóre enzymy ulegają nieodwracalnej
inaktywacji w środowisku o nieodpowiednim dla nich potencjale red-ox

obecność koenzymów, aktywatorów lub inhibitorów

siła jonowa i stała dielektryczna
Kinetyka reakcji enzymatycznej jest opisywana prostą rekcją:
k1
k2
𝐸 + 𝑆 ⇄ 𝐸𝑆 ⟶ 𝐸 + 𝑃
k2
(1)
gdzie:
E – enzym
S – substrat
P – produkt
ES – kompleks aktywny (przejściowy) enzym-substrat
4
k1 - stała szybkości tworzenia kompleksu ES
k-1 - stała szybkości rozpadu kompleksu ES
k2 - stała szybkości tworzenia P.
W wyniki działania enzymu w pierwszym etapie powstaje kompleks ES, o większym zasobie
energii swobodnej niż substrat i produkt. Utworzenie takiego kompleksu wymaga wydatku
pewnej ilości energii zwanej energią aktywacji (Rys. 2.). Kompleks ES jest w stanie
równowagi chemicznej z substratami, a szybkość jego rozpadu na enzym i produkt decyduje o
szybkości reakcji.
Stan przejściowy, czyli kompleks ES, ma w tej reakcji najwyższą energię swobodną. Reakcja
zajdzie, gdy zostanie pokonana bariera energetyczna, czyli różnica energii swobodnej stanu
przejściowego (prowadzącego do produktu) a substratu – zwana energią aktywacji. Enzym
stabilizuje stan przejściowy reakcji i zmniejsza, G‡, nie zmieniając przy tym energii substratu
i produktu.
ΔG‡ - energia aktywacji
ΔG – energia swobodna (Gibbsa)
Rys. 2. Zmiana energii aktywacji, w reakcji bez i z dodatkiem enzymu.
Zgodnie z kinetyką Michaelis-Menten [9-14] dla małych stężeń [S], część
cząsteczek enzymu nie tworzy kompleksu [ES]. Enzym osiąga maksymalną
aktywność katalityczną przy wyższym stężeniu [S], gdy wszystkie cząsteczki enzymu
będą tworzyć kompleks ES. Gdy nastąpi całkowite wysycenie enzymu substratem,
5
dalsze zwiększanie stężenia S nie wpływa na zwiększenie szybkości reakcji. Szybkość
reakcji osiąga stała, maksymalną wartość (Rys. 3.).
Stałe szybkości równania reakcji (1) wyrażają się wzorami (2-5){13-16}:
𝑉1 = 𝑘1 ∙ [𝐸] ∙ [𝑆]
(2){13}
𝑉−1 = 𝑘−1 ∙ [𝐸𝑆]
(3){14}
𝑉2 = 𝑘2 ∙ [𝐸𝑆]
(4){15}
W stanie równowagi można przyjąć, że V1 = V-1 + V2. Stąd:
𝑘1 ∙ [𝐸] ∙ [𝑆] = (𝑘−1 + 𝑘2 ) ∙ [𝐸𝑆]
(5){16}
[S] – stężenie substratu
V – szybkość reakcji
Vmax – maksymalna szybkość
reakcji
Km- stałej Michaelisa
Rys. 3. Wykres zależności szybkości reakcji V od stężenia substratu [S], dla enzymu
zachowującego się zgodnie z kinetyką Michaelisa-Menten.
Początkowa szybkość reakcji zależy od szybkości rozpadu kompleksu ES - (k-1+k2),
od stężenia kompleksu [ES] oraz szybkości jego powstawania - (k1) . Stała równowagi
takiego układu jest opisana wzorem (6) i nosi nazwę stałej Michaelisa (Km).
6
𝐾𝑚 =
𝑘−1 +𝑘2
𝑘3
=
[𝐸]∙[𝑆]
(6)
[𝐸𝑆]
Stężenie [E] to stężenie enzymu niezwiązanego, równe początkowemu stężeniu
enzymu [Ep], które zostało pomniejszone o stężenie enzymu w kompleksie, czyli
[ES], wzór (7):
[𝐸] = [𝐸𝑝 ] − [𝐸𝑆]
(7)
Szybkość reakcji enzymatycznej zależy przede wszystkim od stężenia kompleksu [ES]
i szybkości tworzenia się produktu, wzór (8):
𝑉 = 𝑉2 = 𝑘2 ∙ [𝐸𝑆]
(8)
Podstawiając równania (7 i 8) do równania (6) kolejny wzór na szybkość reakcji
enzymatycznej, wzór (9):
𝑉 = 𝑘3 ∙ [𝐸𝑝 ] ∙
[𝑆]
(9)
𝐾𝑚 + [𝑆]
gdzie: k3 = kcat , stała katalityczna.
Maksymalną szybkość reakcji Vmax uzyskuje się, gdy wszystkie miejsca enzymu
zostaną wysycone przez substrat, to znaczy, gdy [S]>>Km, czyli
[𝑆]
𝐾𝑚 + [𝑆]
jest bliskie
jedności. Stąd:
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑘3 ∙ [𝐸𝑝 ]
(10)
Przez podstawienie równania (10) {21} do (9){20} otrzymuje się równanie
Michaelis’a-Menten’a, wzór (11):
𝑉 = 𝑉𝑚𝑎𝑥 ∙
[𝑆]
𝐾𝑚 + [𝑆]
(11)
7
Stałej Michaelisa (Km) jest takim stężeniem substratu, przy którym szybkość reakcji
osiąga połowę swojej maksymalnej wartości. Stała kataliczna (kcat) to liczba obrotów
jednego miejsca aktywnego enzymu w czasie jednej sekundy.
Stosowanie enzymów w formie natywnej wiąże się z wysokimi kosztami prowadzenia
procesów, szczególnie wtedy gdy konieczne jest stosowanie preparatu enzymatycznego o
wysokim stopniu oczyszczenia. Immobilizacja pozwala na wielokrotne stosowanie enzymów
w środowiskach organicznych. Łatwe jest oddzielenie biokatalizatora od mieszaniny
reakcyjnej po zakończeniu procesu, dzięki czemu uzyskuje się produkt o wysokiej czystości.
Zdeaktywowane enzymy są nieszkodliwe dla środowiska, łatwo ulegają biodegradacj.
Tabela 1. Metody unieruchomiania biokatalizatorów
Fizyczne
oparte na adsorpcji i adhezji
(wykorzystuje oddziaływania
międzycząsteczkowe)
pułapkowanie wewnątrz struktury
polimerów
wykorzystanie półprzepuszczalnych
membran lub układów fazowych
pułapkowanie we włóknach




Chemiczne
 tworzenie wiązań kowalencyjnych
(peptydowe, estrowe)
 sieciowanie kryształów i agregatów
białek
 sieciowanie enzymów z nośniakami
Zalety


zachowanie struktury enzymu
łatwość i niski koszt prowadzenia
immobilizacji

stabilność układu-enzym nośnik

utrata aktywności enzymu przez
zmianę konformacji białka
wysoki koszt (szczególnie tworzenie
wiązań kowalencyjnych enzymnośnik)
Wady

wymywanie biokatalizatora ze złoża

Podstawowym parametrem technologicznym, który pozwala ocenić celowość stosowania
wybranej metody immobilizacji, jest stabilność operacyjna enzymu. Określa ona czas pracy,
po którym zachodzi utrata połowy początkowej aktywności biokatalizatora.
Liczba znanych dotychczas enzymów znacznie przekracza 3000, dlatego też w oparciu o
raport komitetu (Nomenclature Committee powołanego przez Międzynarodową Unię
Biochemiczną w 1984 roku) dokonano ich klasyfikacji. Każdemu enzymowi przypisano
8
odpowiednią nazwę oraz czteroczęściowy rozróżnialny numer. Wszystkie enzymy zostały
podzielone na sześć klas głównych ze względu na typ katalizowanej reakcji (pierwsza cyfra
numeru EC oznacza klasę enzymu)

EC1 Oksydoreduktazy

EC2 Transferazy

EC3 Hydrolazy

EC4 Liazy

EC5 Izomerazy

EC6 Ligazy
Kolejne liczby oznaczają podklasy, podpodklasy oraz numer enzymu w podpodklasie.
Candida antarctica Lipase B sklasyfikowana jest jako EC 3.1.1.3. Oznacza to, że należy do
klasy hydrolaz (EC3), podklasy esteraz działających na wiązania estrowe (EC 3.1),
podpodklasy hydrolaz estrów kwasów karboksylowych (EC 3.1.1). Czwarta cyfra (3)
oznacza, że enzym zajmuje trzecie miejsce w podpodklasie (lipaza triacylogliceroli).
Rys 1. Struktura 3-D Candida Antartica Lipaza B (źródło: http://www.ebi.ac.uk/pdbesrv/view/entry/3icw/taxonomy.html)
Wielką zaletą polimeryzacji enzymatycznej jest możliwość prowadzenia reakcji w
łagodnych warunkach. Po raz pierwszy enzymatyczną polimeryzację z otwarciem pierścienia
zastosowano w syntezie poli(-kaprolaktonu)1. W reakcjach otrzymywania związków
wielkocząsteczkowych najczęściej stosowanymi enzymami są lipazy2,3, w obecności których
szybkość reakcji może być 109–1015 razy większa niż szybkość reakcji w tych samych
warunkach bez użycia enzymu. Najdokładniej została opisana polimeryzacja z otwarciem
pierścienia siedmioczłonowego ε-kaprolaktonu. W późniejszych latach okazało się, że
prowadząc kopolimeryzację węglanu trimetylenu z ε-kaprolaktonem można w znacznym
9
stopniu poprawić właściwości mechaniczne uzyskanego poliestru nie zmieniając jego
biodegradowalności4. Zakłada się, że polimeryzacja enzymatyczna składa się z dwóch
etapów: inicjowania i propagacji. W pierwszym etapie następuje atak nukleofilowy reszt
serynowych lipazy na karbonylowy atom węgla cyklicznego węglanu. Tworzy się kompleks
monomeru aktywowanego z enzymem. Następnie z tym kompleksem może reagować
odpowiedni nukleofil, np. cząsteczka wody. Następuje wówczas zapoczątkowanie łańcucha.
Jeśli w układzie reakcyjnym są obecne inne nukleofile, takie jak amina, alkohol, to mogą
również uczestniczyć w zapoczątkowaniu łańcucha. Etap propagacji czyli wzrostu łańcucha
polega na tym, że końcowa grupa hydroksylowa z łańcucha poli(węglanu trimetylenu) atakuje
karbonylowy atom węgla kompleksu aktywnego, co prowadzi do cząsteczki wydłużonej o
jedną jednostkę powtarzalną (Schemat 62).
Inicjowanie
O
O
OH
lipaza
+
O
O
lipaza O
OH
2
O
lipaza
O
O
2
OH
O
O
HO
+
OH
2
H2O
+
HO
2
lipaza
O
O
OH
lipaza
O
OH
2
O
+
HO
2
O
O
HO
OH
2
2
OH
+ CO2
+
lipaza
lipaza
OH
OH
OH
O
Propagacja
lipaza
O
O
2
OH
+
O
O
HO
2
2
O
n
OH
O
HO
OH
O
O
2
2
n +1
+
O
Schemat 62. Polimeryzacja enzymatyczna węglanu trimetylenu.
W polimeryzacji sześcioczłonowych węglanów cyklicznych można zastosować
również inne aktywne enzymy, np.: Rhizomucor miehei5, Pseudomonas fluorescens6,
Pseudomonas cepacia7, Candida cylinderacea8, Mucor meihei9. Wybrane przykłady
polimeryzacji enzymatycznej zostały przedstawione w tabeli 1.
10
Tabela 1. Wybrane przykłady polimeryzacji enzymatycznej z wykorzystaniem lipaz
Enzym
Candida antartica lipase B
((Novozyme-435))
Mucor meihei (lipozyme)
Pseudomonas cepacia
(lipase PS, PS-30)
Pseudomonas
fluorescens lipase
Monomer
węglan diwinylu + 1,4-butanodiol
Lit.
sebacynian diwinylu + glukoza
kwas adypinowy + glicerol
kwas azelainowy + 1,8 – oktanodiol
kwas sebacynowy + 1,4 – butanodiol
kwas bursztynowwy + 1,4 – butanodiol
węglan trimetylenu
ε – kaprolakton
α-methylo - ε – kaprolakton
11
kwas sebacynowy + 1,4 – butanodiol
adypinian diwinylu + glicerol
adypinian diwinylu + 1,2,4-butanotriol
19
kwas sebacynowy + oksacyklononan-2-on
22
węglan trimetylenu
ε – kaprolakton
ω-pentadekalakton
23
adypinian diwinylu + 1,4 – butanodiol
26
węglan trimetylenu
walerolakton
oksacyklononan-2-on
27
10
12
13
14
15
16
17
18
20
21
24
25
28
29
Polimery otrzymane z udziałem hematyny, która jest enzymem powstającym w
wyniku rozpadu hemoglobiny, mogą być stosowane w medycynie bez konieczności jej
usuwania z produktu polimeryzacji
Jako katalizatory polimeryzacji z otwarciem pierścienia zostaną zastosowane dwa wybrane
preparaty enzymatyczne. Aktywności dostępnych preparatów enzymatycznych:



Lipaza immobilizowana z Mucor miehei
Lipaza z Pseudomonas fluorescens Amano
Immobilizowana lipaza z Rhizomucor miehei
aktywność 63 U/g
aktywność 20 000 U/g
aktywność 381 U/g
11



Immobilizowana lipaza z Rhizopus oryzae
Immobilizowana lipaza z Pseudomonas cepacia
Lipaza G z Penicillium camemberti Amano
aktywność 367 U/g
aktywność 941 U/g
aktywność 50 000 U/g
Wykonanie ćwiczenia:
Wykonanie ćwiczenia będzie polegało na otrzymaniu polimerów z użyciem
odpowiednich enzymów. Jako monomery będą stosowane:
 węglan trimetylenu,
 ε – kaprolakton
 walerolakton
Opracowanie wyników:
1. Na podstawie wyników uzyskanych ze spektroskopii magnetycznego rezonansu
jądrowego wyznaczyć konwersje monomeru.
2. Na podstawie spektroskopii w podczerwieni podać charakterystyczne pasma absorpcji
występujące w monomerze i polimerze.
3. Na podstawie wyników uzyskanych z analizy GPC przeprowadzić dyskusję na temat
wpływu warunków prowadzenia procesu polimeryzacji na ciężar uzyskanych
polimerów.
Literatura
1
A. Kumar, R. A. Gross: Biomacromolecules, 2000, 1, 133
2
T. F. Al-Azemi, J. P. Harmon, K. S. Bisht, Biomacromolecules, 2000, 1, 493
3
B. Al-Duri, R. Goddard, J. Bosley, J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 2001, 11, 825
4
J. K. Oh, D. J. Siegwart, K. Matyjaszewski, Biomacromolecules, 2007, 8, 3326
5
F. Deng, R. A. Gross, Int. J. Biomol., 1999, 25, 153
6
D. A. Abramowicz, C. R. Keese, U.S. Patent 4,892,822 1990
7
R. A. Gross, A. Kumar, U.S. Patent 6,486,295 2002
8
R. A. Gross, A. Kumar, B. Kalra, Chem. Rev., 2001, 101, 2097
9
K. S. Bisth, F. Deng, R. A. Gross, D. L. Kaplan, G. J. Swift, J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 1363
10
Dordick, J. S.; Martin, B.; Linhardt, R. J. U.S. Patent 5,474,915 1995
12
11
Kitagawa, M.; Tokiwa, Y. Biotechnol. Lett. 1998, 20, 627
12
Kumar , A. , Kulshrestha , A.S. , Gao , W. ,and Gross , R.A. ( 2003 ) Macromolecules , 2003, 36,
8219 – 8221
13
Feder , D. , and Gross , R.A. ( 2010 ) Biomacromolecules ,2010 11,690 – 697
14
Uyama , H. , Inaka , K. , and Kobayashi , S. Polym. J. , 2000, 32, 440 – 443
15
Azim , H. , Dekhterman , A. , Jiang , Z. ,and Gross , R.A. ( 2006 ) Biomacromolecules , 2006, 7,
3093 – 3097
16
Bisht , K.S. , Svirkin , Y.Y. , Henderson ,L.A. , Gross , R.A. , Kaplan , D.L. , and Swift , G.
Macromolecules , 1997, 30, 7735 – 7742
17
Cordova , A. , Iversen , T. , and Hult , K.( 1999 ) . Polymer , 40 ( 24 ), 6709 – 6721 .1999
18
van Buijtenen , J. , van As , B.A.C. ,Verbruggen , M. , Roumen , L. ,Vekemans , J.A.J.M. , Pieterse ,
K. ,Hilbers , P.A.J. , Hulshof , L.A. , Palmans ,A.R.A. , and Meijer , E.W. J. Am. Chem. Soc. , 2007,
129, 7393 –7398
19
Linko, Y.-Y.; Wang, Z.-L.; Seppala, J. J. Biotechnol. 1995, 40, 133
20
Kline, B. J.; Beckman, E. J.; Russell, A. J. J. Am. Chem. Soc.1998, 120, 9475
21
Hmamouchi, M.; Prud’homme, R. J. Polym. Sci. Polym. Chem.Ed. 1991, 29, 1281
22
Kobayashi, S.; Uyama, H.; Namekawa, S. Polym. Degrad. Stab. 1998, 59, 195
23
Matsumura , S. , Tsukada , K. , and Toshima , K. ( 1997 ) . Macromolecules , 1997, 30,3122 – 3124
Namekawa , S. , Suda , S. , Uyama , H. ,and Kobayashi , S.. Int. J. Biol.Macromol. , 1999 25 145 –
151
24
25
Bisht , K.S. , Henderson , L.A. ,Gross , R.A. , Kaplan , D.L. , and Swift ,G. . Macromolecules , 1997
30, 2705 – 2711
26
Uyama , H. , and Kobayashi , S. ( 1994 ) . Chem. Lett. , 1994 23, 1687 – 1690
27
Bisht , K.S. , Svirkin , Y.Y. , Henderson ,L.A. , Gross , R.A. , Kaplan , D.L. , and Swift , G.
Macromolecules , 1997, 30, 7735 – 7742.
28
Kobayashi , S. , Takeya , K. , Suda , S. ,and Uyama , H. ( 1998 ) Macromol. Chem. Phys. , 1998, 99,
1729 – 1736
29
Kobayashi , S. , Uyama , H. , Namekawa ,S. , and Hayakawa , H. ( 1998 ) Macromolecules , 1998,
31, 5655 – 5659
13