This copy is for personal use only

polski przeglĄd otorynolaryngologiczny 3 (2014) 254–258
Dostępne online www.sciencedirect.com
ScienceDirect
journal homepage: www.elsevier.com/locate/ppotor
Streszczenie pracy doktorskiej/Summary of doctoral thesis
Analiza amplifikowanych regionów chromosomów
zawierających potencjalne onkogeny w płaskonabłonkowym
nowotworze krtani
Analysis of amplified chromosomal regions containing potential oncogenes
in laryngeal squamous cell carcinoma
Słowa kluczowe:
amplifikacje
onkogeny
płaskonabłonkowy rak krtani
gen wiodący
Keywords:
Amplifications
Oncogenes
Laryngeal squamous cell carcinoma
Driver gene
Rozprawa na stopień naukowy doktora nauk medycznych
Poznań 13.06.2014
Promotor: prof. dr hab. Krzysztof Szyfter (Instytut Genetyki
Człowieka PAN, Poznań)
Recenzenci: prof. dr hab. Janusz Błasiak (Uniwersytet Łódzki)
dr hab. Jarosław Markowski (Śląski Uniwersytet Medyczny,
Katowice)
Nowotwór, w tym również rak krtani, powstaje pod wpływem zmian genetycznych i epigenetycznych zachodzących
w różnych genach, między innymi w protoonkogenach. Produkty białkowe protoonkogenów biorą udział we wzroście,
proliferacji, różnicowaniu i śmierci komórki. Jednym z mechanizmów prowadzących w komórkach rakowych do nadmiernej ekspresji protoonkogenów jest amplifikacja określonych
regionów chromosomowych. Stąd wykrycie genów amplifikowanych w rakach krtani może mieć znaczenie diagnostyczne,
prognostyczne i terapeutyczne dla pacjentów obarczonych
chorobą.
Geny do analizy zostały wybrane na podstawie wyników
uzyskanych metodą mikromacierzy array-CGH (wysokorozdzielcza hybrydyzacja porównawcza genomów) dla 11 linii
komórkowych płaskonabłonkowego raka krtani. W niniejszej
pracy skoncentrowano uwagę na regionach potencjalnie
zawierających protoonkogeny, gdzie odnotowano przyrost
liczby kopii DNA. Na tej podstawie wyselekcjonowano trzy
powtarzające się w różnych liniach regiony chromosomowe:
region 3q25–q29 (linie UT-SCC–6A, 22, 34, 57, 107, 11);
region 11q13 (linie UT-SCC–11, 22, 29, 57, 107) oraz
Tabela I – Zestawianie wyników z dodatkowymi kopiami
DNA analizowanych genów
Table I – The results of additional copy number DNA analysed
genes
Region
3q25–q29
11q13
22q11
*
Nazwa
genu
Liczba linii
komórkowych
oraz guzów krtani
z dodatkowymi
kopiami DNA
%
CCNL1
PIK3CA
THPO
MAP3K13
MUC20
MUC4
FADD
PPFIA1
CTTN
CRKL
MAPK1
53/80
46/80
31/80
41/80
22/80
7/80
46/80
44/80
34/80
15/80
8/80
66,3*
57,5*
38,8
51,3*
27,5
8,8
57,5*
55,0*
42,5
18,8
10
wyniki istotne statystycznie (p < 0,05).
polski przeglĄd otorynolaryngologiczny 3 (2014) 254–258
region 22q11 (linie UT-SCC–6A, 11). Region 3q25–q29 obejmuje 41,287,225 pz i zawiera 102 geny. Region 11q13.2–q13.3
obejmuje 1,426,358 pz i zawiera 11 genów. Region 22q11.21
obejmuje 985,480 pz i zawiera 15 genów. W celu ustalenia
regionu chromosomowego i wielkości obszaru posługiwano
się bazą Human Genome Browser NCBI 2006_hg18. Ponieważ
w każdym z wyselekcjonowanych regionów znajduje się
wiele genów, zatem wybór kandydatów do analizy oparto na
najwyższej wartości współczynnika log2ratio oraz danych
z literatury. W niniejszej pracy do dalszej analizy wybrano
sześć genów: CCNL1, PIK3CA, THPO, MAP3K13, MUC20, MUC4
z regionu 3q25–q29, trzy geny: CTTN, PPFIA1, FADD z regionu
11q13 oraz dwa geny: MAPK1, CRKL z regionu 22q11.
[(Ryc._1)TD$FIG]
255
Celem rozprawy doktorskiej była analiza wybranych
genów z wyżej wymienionych trzech regionów chromosomów, pod kątem sprawdzenia dodatkowych kopii DNA,
ekspresji oraz korelacji liczby kopii z ekspresją. Ponadto
określono związek amplifikacji i nadekspresji wybranych
genów z parametrami klinicznymi i stopniem złośliwości
guza. Powyższe cele zrealizowano przy wykorzystaniu
metody PCR w czasie rzeczywistym do matrycy DNA (określenie liczby kopii genu) oraz do matrycy cDNA (określenie
ekspresji mRNA).
Materiał do badań stanowił zestaw 17 ustabilizowanych
linii komórkowych wyprowadzonych z płaskonabłonkowych
raków krtani (prof. R. Grenmana, Turku, Finlandia) oraz 63
Ryc. 1 – Lokalizacja dodatkowych kopii genów regionu 3q25–29 w linii UT-SCC–6A. Strzałką przerywaną oznaczono
izochromosomy, strzałką ciągłą chromosomy pochodne.
(A) Sonda RP11–245C23–PIK3CA (czerwona), RP–171N2–MUC20 (zielona), CEP 3 (niebieska)
(B) Sonda RP11–245C23–PIK3CA (czerwona), RP11–2268P20–MUC4 (zielona), CEP 3 (niebieska)
(C) Sonda RP11–125E8–THPO (zielona), 3p telomer RP11–1186B18 (czerwona)
(D) Sonda RP11–2302E16–CCNL1 (zielona), 3p telomer RP11–1186B18 (czerwona)
Fig. 1 – Additonal copy number genes in 3q25-29 chromosomal region UT-SCC 6A cell line
256
polski przeglĄd otorynolaryngologiczny 3 (2014) 254–258
wycinki z guza pobrane podczas operacji laryngektomii
z płaskonabłonkowych raków krtani (dr Anna Bartochowska,
prof. W. Szyfter, Poznań, Polska).
Z przeprowadzonych doświadczeń wykonanych techniką
PCR w czasie rzeczywistym do matrycy DNA wynika, że
dodatkowe kopie DNA obserwowano istotnie statystycznie
częściej w grupie pacjentów w porównaniu z grupą kontrolną
dla genów: CCNL1, PIK3CA, MAP3K13 z regionu 3q25–q29 oraz
FADD i PPFIA z regionu 11q13 (Tab. I).
Analiza statystyczna uwzględniająca parametry kliniczne
TNM i histologiczne G dla grup z nadekspresją i z normalną
ekspresją genu PIK3CA wykazała, że w grupie o niskim
stopniu złośliwości (G1 + G2) obserwowano tendencję do
częstszej nadekspresji genu PIK3CA w porównaniu z guzami
[(Ryc._2)TD$FIG]
Ryc. 2 – Lokalizacja dodatkowych kopii genów regionu 3q25–29 w linii UT-SCC–22. Strzałką oznaczono chromosomy
pochodne.
Sonda 3p telomer RP–1186B16 (czerwona), sonda badana zielona:
(A) RP11–245C23–PIK3CA (B) RP11–2302E16–CCNL1
(C) RP11–125E8–THPO (D) RP11–171N2–MUC20
Fig. 2 – Additional copy number genes in 3q25-29 chromosomal region UT-SCC-22 cell line
polski przeglĄd otorynolaryngologiczny 3 (2014) 254–258
o najwyższym stopniu złośliwości (G3) (wynik na granicy
istotności statystycznej, p = 0,067).
Wykorzystując powyższe wyniki wykonane metodą PCR
w czasie rzeczywistym, sprawdzono korelację liczby kopii
DNA i ich ekspresji przez wykonanie analizy zależności przy
użyciu testu Pearsona. Wykazano silną korelację pomiędzy
liczbą kopii DNA a ekspresją mRNA dla genów CRKL (0,994)
oraz FADD (0,585) zarówno w liniach komórkowych, jak
i w guzach krtani. Obydwa geny, CRKL i FADD, które
wykazały najsilniejszą korelację, poddano analizie statystycznej obejmującej dane kliniczne pacjentów (TNM i G).
Zaobserwowano tendencję do częstszego występowania
dodatkowych kopii DNA genu FADD (wynik na granicy
istotności statystycznej, p = 0,065) w grupie o niskim stopniu
złośliwości (G1 + G2) w porównaniu z guzami o najwyższym
stopniu złośliwości (G3).
Dla wybranych genów wykonano dodatkowe analizy:
fluorescencyjną hybrydyzację in situ (dla genów regionu 3q25–
q29), pirosekwencjonowanie i sekwencjonowanie metodą
Sangera (dla genu PIK3CA) oraz analizę immunohistochemiczną (dla białka CRKL).
Fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) wykonano
w celu lokalizacji nadliczbowych kopii badanych genów oraz
określenia aberracji chromosomowych. Szczegółowa analiza
wykazała heterogenność aberracji w obrębie regionu 3q25–
q29 (Ryc. 1 i 2). Najczęściej obserwowano: 1) chromosomy
pochodne powstające w wyniku translokacji chromosomu
3 z innymi chromosomami, 2) izochromosomy ramion
q chromosomu 3 oraz 3) zmiany liczby prawidłowych chromosomów pary 3.
Kolejną analizą dodatkową objęto genPIK3CA, gdyż wykazano, że z pośród wszystkich analizowanych genów najczęściej ulega nadekspresji. Wykazano również jego silną korelację pomiędzy liczbą kopii DNA a ekspresją mRNA w liniach
komórkowych, której nie potwierdzono w wycinkach guzów
krtani. Poszukiwano zatem mutacji aktywujących, które
mogą być, oprócz wykazanej amplifikacji, mechanizmem
[(Ryc._3)TD$FIG]
257
powodującym obserwowaną nadekspresję. W celu znalezienia mutacji wykonano reakcję pirosekwencjonowania fragmentu eksonu 9, gdyż zawiera on literaturowo potwierdzone
dwie najczęściej występujące w genie PIK3CA mutacje
1624G>A (E542K) i 1633G>A (E545K). Znaleziono heterozygotyczną mutację 1633G>A w jednym z badanych przypadków
wycinka guza (MK 15) (Ryc. 3). Mutacja ta została następnie
potwierdzona metodą sekwencjonowania techniką Sangera.
Przy jednoczesnym braku dodatkowych kopii DNA genu
PIK3CA można wnioskować, że wykryta mutacja aktywująca
odpowiada za nadekspresję tego genu w badanym przypadku. Otrzymane wyniki pozwalają wnioskować, że amplifikacja i mutacja aktywująca to dwa niezależne mechanizmy
prowadzące do nadekspresji genu PIK3CA.
Analizę immunohistochemiczną wykonano dla genuCRKL.
Poziom i lokalizację białka kodowanego przez ten gen oceniono z uwagi na najsilniejszą korelację pomiędzy liczbą kopii
DNA i ekspresją mRNA tego genu. Wykonane analizy immunohistochemiczne potwierdziły wysoki poziom białka
w liniach komórkowych o silnej amplifikacji i wysokiej nadekspresji mRNA. Dodatkowo wykazano częstszą lokalizację
jądrową w liniach wykazujących wyższy poziom białka, co
może stanowić o jego aktywności. Następnie sprawdzono
poziom białka CRKL na materiale pochodzącym z wycinków
guza krtani. We wszystkich analizowanych przypadkach
zaobserwowano słaby odczyn cytoplazmatyczny białka CRKL,
a w 25% również dodatni jądrowy odczyn oznaczanego białka.
Jednakże nie uzyskano statystycznie istotnych zależności
pomiędzy grupami z obecnością ekspresji jądrowej i jej
brakiem.
Przeprowadzone badania pozwalają wskazać geny wiodące (driver gene) w każdym z silnie amplifikowanych regionów. Gen PIK3CA uznano za wiodący dla regionu 3q25–q29.
Nadekspresja PIK3CA w badanych przypadkach raka krtani
może być spowodowana dwoma niezależnymi mechanizmami: obecnością dodatkowych kopii DNA lub rzadziej mutacją aktywującą 1633G>A. Ponadto analiza przeprowadzona
Ryc. 3 – Pirogram przedstawiający zmianę odczytu w miejscu potencjalnej mutacji 1633G>A, z wycinka guza pacjenta MK15
Fig. 3 – Pirogram with the potential mutation site 1633G>A (MK15 tumor)
258
polski przeglĄd otorynolaryngologiczny 3 (2014) 254–258
w oparciu o fluorescencyjną hybrydyzację in situ pozwoliła na
wskazanie kilku mechanizmów powstawania dodatkowych
kopii genów, z których najczęstszym było występowanie
chromosomów pochodnych zawierających badany fragment
chromosomu pary 3. Za gen wiodący amplifikacji regionu
11q13 uznano gen FADD, natomiast dal regionu 22q11 rolę tę
pełni gen CRKL. Jako główny mechanizm nadekspresji genów
FADD i CRKL wskazano występowanie dodatkowych kopii
tych genów. Natomiast zaobserwowana lokalizacja jądrowa
białka CRKL w liniach komórkowych i w wycinkach guza
może sugerować patogenną aktywację tego białka w przebiegu choroby nowotworowej.
Przeprowadzone badania poszerzają rozumienie biologii
molekularnej raków krtani poprzez wykazanie roli określonych genów w przebiegu choroby.
Tekst pracy liczy: 129 stron i zawiera 39 tabel, 25 rycin
oraz 178 pozycji piśmiennictwa.
Konflikt interesu/Conflict of interest
Nie występuje.
Projekt pt. ,,Wsparcie stypendialne dla doktorantów na
kierunkach uznanych za strategiczne z punktu widzenia
rozwoju Wielkopolski’’ realizowanego w latach 2012–2013
przez Wojewódzki Urząd Pracy w Poznaniu w ramach
Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki finansowanego ze
środków Europejskiego Funduszu Społecznego przyznany
doktorantce M. Kostrzewskiej-Poczekaj.
Etyka/Ethics
Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami
Deklaracji Helsińskiej, dyrektywami EU oraz ujednoliconymi
wymaganiami dla czasopism biomedycznych.
Magdalena Kostrzewska-Poczekaj*
Instytut Genetyki Człowieka Polskiej Akademii Nauk,
Poznań, Polska
*Adres do korespondencji: Instytut Genetyki Człowieka Polskiej
Akademii Nauk, ul. Strzeszyńska 32,60-479 Poznań, Polska.
Tel.: +48 61 657 91 00; fax: +48 61 823 32 35
Adres email: [email protected]
Finansowanie/Financial support
Grant Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr
N 401 192 32/4031 (kierownik: prof. med. dr hab. Krzysztof
Szyfter)
Grant Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr NN
403 455 939 (kierownik: mgr inż. Magdalena KostrzewskaPoczekaj)
Otrzymano: 15.10.2014
Zaakceptowano: 21.10.2014
Dostępne online: 01.11.2014
http://dx.doi.org/10.1016/j.ppotor.2014.10.006
2084-5308/