Chromatograficzna analiza pozostałości hormonalnych

CHROMATOGRAFICZNA ANALIZA POZOSTAŁOŚCI
HORMONALNYCH STYMULATORÓW WZROSTU
W TKANKACH ZWIERZĘCYCH
AUTOR: Barbara Woźniak
PROMOTOR: prof. dr hab. Bolesław Wojtoń
RECENZENCI: prof. dr hab. Jan Żmudzki, prof. dr hab. Jan Uradziński
STRESZCZENIE
Skuteczna kontrola pozostałości hormonów anabolicznych w tkankach zwierzęcych
jest możliwa dzięki ciągłemu rozwijaniu nowych metod analitycznych oraz doskonaleniu
istniejących.
W przedstawionej pracy zaprezentowano kolejne etapy badań, które podjęto przy
opracowaniu i walidacji metod oznaczania hormonów anabolicznych w próbkach
pochodzenia zwierzęcego.
Na wstępie pracy scharakteryzowano trzy grupy hormonalnych stymulatorów wzrostu:
stilbenów, steroidów oraz zeranolu. Opisane zostały ich właściwości fizykochemiczne,
mechanizm działania, metabolizm. Omówiono również toksyczność hormonów, a w
szczególności zwrócono uwagę na ich kancerogenne i mutagenne właściwości. Nakreślono
też problem obecności hormonów w żywności pochodzenia zwierzęcego oraz występowania
pozostałości hormonów naturalnych i syntetycznych w tkankach zwierzęcych, które mogą być
następstwem implantacji zwierząt, jak też nielegalnego stosowania hormonów w celach
anabolicznych. Przedstawiono też zasady kontroli pozostałości hormonów obowiązujące w
krajach UE oraz kwestie związane z interpretacją wyników. Na podstawie dostępnego
piśmiennictwa przeanalizowano opublikowane metody oznaczania hormonów w próbkach
biologicznych i opisano nowe trendy w analityce tych związków. W dalszej kolejności
zaprezentowano aktualne wymagania analityczne dla metod potwierdzających, zasady ich
walidacji oraz kryteria oceny wyników.
W części doświadczalnej pracy główny nacisk położono na optymalizację warunków
detekcji hormonów, sposób ekstrakcji analitów z matrycy, dobór warunków oczyszczania
ekstraktów oraz przeprowadzania hormonów w lotne pochodne.
Wyniki
badań
optymalizacyjnych
wykorzystano
do
opracowania
skryningowej,
wielokierunkowej metody HPLC- DAD oznaczania hormonów w próbkach biologicznych
oraz czterech procedur potwierdzających opartych na chromatografii gazowej ze
spektrometrią mas z pojedynczym kwadrupolem do oznaczania stilbenów i steroidów
w próbkach moczu, mięśni i mleka, octanu medroksyprogesteronu w tkance tłuszczowej
zwierząt oraz 17β- estradiolu i testosteronu w surowicy bydlęcej.
Zastosowanie chromatografii cieczowej z detektorem diodowym do celów
skryningowych podyktowane było tym, że jest to metoda tańsza w porównaniu
z technikami spektrometrii mas, daje sposobność identyfikacji badanych związków poprzez
rejestrację ich widm w UV i umożliwia wykrywanie wielu związków jednocześnie, co jest jej
dodatkowym atutem. Analizę hormonów: dietylostilbestrolu, dienestrolu, heksestrolu, 19nortestosteronu, trenbolonu, zeranolu prowadzono na chromatografie cieczowym HP1100 z
detektorem DAD, przy czterech optymalnych dla poszczególnych związków długościach fali
wynoszących 230, 242, 265 i 340 nm. Spośród sześciu testowanych kolumn fazy odwróconej
najlepszy rozdział chromatograficzny uzyskano na kolumnie LiChrosorb RP-18 (250 x 4 mm,
5μm), stosując jako fazę ruchomą metanol z wodą zmieszany w proporcji 65: 35 (v/v), przy
przepływie fazy 1 ml/min i temperaturze kolumny 30°C.
W procedurach potwierdzających opartych o technikę GC-MS zastosowano jonizację
strumieniem elektronów (EI), dla której uzyskano najkorzystniejszą fragmentację pochodnych
hormonów, oraz monitorowanie wybranych jonów (SIM) ze względu na znacznie większą
intensywności jonów fragmentacyjnych uzyskiwanych w tym trybie, w porównaniu z trybem
full scan. Prawidłowy rozdział chromatograficzny badanych związków osiągnięto na
niepolarnej kolumnie HP5ms w programowanej temperaturze kolumny zaczynając od 120°C,
a kończąc na 310°C.
Biorąc pod uwagę ocenę intensywności otrzymanych jonów fragmentacyjnych oraz
specyficzność widma mas, spośród siedmiu sprawdzanych metod derywatyzacji hormonów
z zastosowaniem trzech czynników: HFBA, MSTFA i BSTFA, dla stilbenów i steroidów
wybrano derywatyzację z HFBA, natomiast dla trenbolonu zastosowano dwuetapową
derywatyzację, kolejno z mieszaniną MSFTA /I2, a następnie z samym MSTFA.
Dla wszystkich badanych hormonów, z wyjątkiem heksestrolu, uzyskano co najmniej cztery
jony diagnostyczne, spełniając tym samym kryteria identyfikacji związków. Heksestrol
przeprowadzano w dwie pochodne w celu uzyskania czterech punktów identyfikacyjnych,
stanowiących kryterium dla metod potwierdzających.
Przeprowadzone badania trwałości pochodnych hormonów wykazały, że pochodne HFBA są
znacznie trwalsze niż pochodne MSTFA i nie tracą właściwości nawet po miesięcznym
przechowywaniu w temperaturze poniżej -18°C.
Do ekstrakcji hormonów z próbek moczu i mleka zastosowano eter dietylowy,
natomiast z próbek mięśni hormony izolowano metanolem w obecności buforu octanowego.
Dalsze oczyszczanie próbek prowadzono stosując ekstrakcję ciecz - ciecz oraz ekstrakcje do
fazy stałej na kolumienkach C18 i NH2. Octan medroksyprogesteronu z próbek tłuszczu
ekstrahowano eterem naftowym, oczyszczanie prowadzono stosując ekstrakcję do fazy stałej
na kolumience C18, po uprzednim odtłuszczeniu ekstraktu poprzez wymrażanie. Do izolacji
hormonów naturalnych: 17β- estradiolu i testosteronu z próbek surowicy użyto mieszaniny
rozpuszczalników, eteru ter-butylowo-metylowego i naftowego (30:70, v/v). Tak dobrany
układ rozpuszczalników okazał się bardzo efektywny, ponieważ uzyskane ekstrakty były
wystarczająco czyste do wykonania analizy metodą GC-MS, bez konieczności dalszego
oczyszczania.
Przeprowadzone
z
zastosowaniem
przygotowanych
metod
badania
wpływu
gatunkowości próbek, rodzaju matrycy i techniki detekcji na wynik analizy wykazały,
że czynniki te nie rzutują w istotny sposób na wynik badania.
Opracowane procedury zostały w pełni zwalidowane zgodnie z wymaganiami
określonymi w Decyzji Rady 2002/657/EC, spełniają międzynarodowe kryteria analityczne
i umożliwiają oznaczanie hormonów poniżej ustalonych minimalnych poziomów oznaczania.
Przedstawione metody zostały zweryfikowane w międzynarodowych badaniach biegłości,
które potwierdziły, że wyniki uzyskiwane przy ich użyciu są wiarygodne i porównywalne
z wynikami otrzymywanymi przez laboratoria referencyjne innych państw europejskich.
Opracowane skryningowe i potwierdzające metody przygotowano w formie procedur
badawczych i wdrożono do badań diagnostycznych i kontrolnych pozostałości hormonów
prowadzonych w kraju.
Metody potwierdzające po poddaniu ich procesowi akredytacji uzyskały status metod
akredytowanych nadany im przez PCA.
Wyniki prowadzonych w latach 2005-2007 badań z zastosowaniem opracowanych
metod wskazują, że anaboliki pochodzenia hormonalnego nie są stosowane w kraju
do stymulacji wzrostu zwierząt rzeźnych.
SUMMARY
An efficient control of anabolic hormone residues in animal tissues is possible due to a
sustained development of new analytical methods and improvement of the methods used.
In the present work successive stages of the studies undertook to work out and validate
methods of anabolic hormones detections in sample of animal origin were demonstrated.
At the beginning of the work three groups of hormonal growth stimulators: stilbenes,
steroids and zeranol including their physicochemical properties, the mechanism of action, and
metabolism were characterized. In addition, the toxicity of hormones mainly focused at their
cancerogenic and mutagenic properties. Moreover, issues involving the presence of hormones
in the food of animal origin and the occurrence of natural and synthetic hormones in animal
tissues as a result of animal implantation, and also illegal use of hormones for anabolic
purpose were discussed. Furthermore, the rules of the hormone residue controls applied in the
UE countries and questions connected with the interpretation of results were put forward.
Basing on the available literature, the published methods of hormone determination in
biological samples were analyzed and new trends in the analysis of these compounds were
described. Later, present analytical requirements for confirmatory methods, the rules of their
validation and criteria of the estimation of results were shown.
In the experimental part, a main emphasis was put on optimization of hormone
detection conditions, the way of analyte extraction from a matrix, selection of the condition of
extract purification and converting hormones into volatile derivatives.
Results of operational research were used to elaborate the multi-residue screening
HPLC-DAD method for hormone detection in biological samples and four confirmatory
procedures which were based on gas chromatography with mass spectrometry with a single
quadrupole for detection of stilbenes and steroids in urine sample, muscles and milk,
medroxyprogesterone acetate in animal fat tissue and 17 β – estradiol and testosterone
in cattle serum.
The use of liquid chromatography with diode array detector for screening reasons was
dictated by the fact that this method is a cheaper in comparison to mass spectrometry
techniques, gives possibility to identify tested compounds by their UV spectrum registration
and enables to detect simultaneously several compounds, which seems to be an additional
benefit. The analysis of diethylstilbestrol, dienestrol, hexestrol, nortestosterone, trenbolone,
zeranol was carried out using the HP1100 liquid chromatography with a DAD detector at four
optimal valve lengths (230 nm, 242 nm, 265 nm, and 340 nm) for selected compounds. Of six
tested columns of inversed phase the best separation was achieved on an LiChrosorb RP-18
column (250 x 4 mm, 5μm) using a mixture of methanol and water (65:35, V/V) as a mobile
phase (1 mL/min) and at a column temperature of 30oC.
The confirmatory procedures based on the GC-MS technique included ionization with
an electron impact (EI) which permitted the most efficient selectivity of hormone derivates,
and selected ions monitoring (SIM) for reasons of much more intense ion partition obtained
by this method in comparison to that achieved by a full scan one. The regular chromatography
selectivity of examined compounds was obtained on a non-polar HP-5ms column at a
programmed column temperature ranging from 120oC to 310oC.
Of seven examined methods of hormone derivatization with the use of three derivative
agents such as HFBA, MSTFA, and BSTFA, the following methods were selected
considering intensity of the ions, that were obtained and mass spectrum specificity: for
stilbenes and steroids derivatization with HFBA, whereas for trenbolone a two-step
derivatization involving an MSTA/I2 mixture and then only MSTFA. Except for hexestrol, at
least four diagnostic ions fulfilling the criteria of the compound identification were achieved
for all tested hormones. Hexestrol was covered into two derivatives, to obtain four
identification points that were regarded as a criterion for the confirmatory methods.
Investigations into the stability of the hormone derivatives showed that HFBA derivatives are
much more stable then MSTFA ones and do not lose property even after a one month storing
at a temperature below –18oC.
The hormones were extracted from urine and milk samples with the use of diethyl
ether whereas from muscle sample with the use of methanol and acetate buffer. Further
sample purification was performed using liquid-liquid extraction and C18 and NH2 columns.
Medroxyprogesterone acetate was extracted from fat samples by petroleum ether, then
purified by solid phase extraction on C18 columns, after extract degreasing by freezing. The
natural hormones 17 β–estradiol and testosterone were isolated from serum using tert-butylmethyl ether and petroleum ether (30:70 V/V). Such well-matched solvents were very
effective because the extracts obtained were sufficiently pure to perform the analysis using the
GC-MS method without further purification.
The investigations performed with the use of elaborated methods to evaluate the
species – specific of the sample, matrix effects and detection technique on the analysis effect
indicate that the factors do not affect significantly the results obtained.
The elaborated procedures were completely validated according to requirements of
Commission Decision 2002/657/EC, they fulfill international analytical criteria and permit the
hormone determination below determined minimum detection levels. The method presented
were verified by the international proficiency testing that supported that results achieved by
the methods are reliable and comparable with those obtained by reference laboratories in other
European countries.
The worked out screening and confirmatory methods were prepared as procedures and
introduced to diagnostic and control examinations of hormone residues performed in Poland.
The reference methods achieved the status of accredited methods certified by the PCA.
Results of the examinations carried out in the years 2005 to 2007 with the use of the
methods developed indicate, that anabolic of hormonal origin are not use in Poland to
stimulate growth of slaughter animals.