pobierz

Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 3, str. 361–374
STANDARDY – Standards
ANDRZEJ HELLMANN1, MAREK SIEMIĄTKOWSKI2,
JERZY HOŁOWIECKI3, WIESŁAW W. JĘDRZEJCZAK4,
TADEUSZ ROBAK5, ALEKSANDER SKOTNICKI6,
KRZYSZTOF WARZOCHA7, MIROSŁAW MAJEWSKI7
Rekomendacje dotyczące stosowania analizy mutacji
genu BCR-ABL u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową
Recommendations concerning use of analysis of mutations in the
BCR-ABL gene in patients with chronic myeloid leukemia
1
Katedra i Klinika Hematologii i Transplantologii, Akademia Medyczna w Gdańsku
Bristol-Myers Squibb
3
Katedra i Klinika Hematologii i Transplantacji Szpiku, Śląska Akademia Medyczna
4
Klinika Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych, Akademia Medyczna w Warszawie
5
Katedra i Klinika Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
6
Katedra i Klinika Hematologii, Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków
7
Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa
2
STRESZCZENIE
Mutacje genu BCR-ABL stanowią jedną z głównych przyczyn rozwoju oporności na imatynib
i inne inhibitory kinazy BCR-ABL. Rosnąca ilość danych wskazuje na celowość wykonywania
badania mutacji u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową. Wynik analizy mutacji genu BCRABL naleŜy zawsze interpretować w odniesieniu do sytuacji klinicznej chorego. U chorego leczonego imatynibem zmiana terapii moŜe być rozwaŜona w przypadku wykrycia mutacji genu
BCR-ABL, jedynie jeśli jednocześnie obserwuje się niepowodzenie leczenia imatynibem w dawce 400 mg/d lub wyŜszej, lub odpowiedź suboptymalną na imatynib. W takim przypadku, po
wykryciu mutacji związanej z całkowitą opornością na imatynib: M244V, G250E, Y253F,
Y253H, E255K, E255V, T315I, F359V, H396P, H396R zaleca się przerwanie leczenia imatynibem zamiast zwiększania dawki leku do 600-800 mg/d. W przypadku wykrycia mutacji T315I
nie zaleca się równieŜ zmiany leczenia na dazatynib lub nilotynib. Nie ma obecnie przekonujących danych, które uzasadniałyby zmianę leczenia w przypadku wykrycia mutacji genu BCRABL u chorych z dobrą odpowiedzią na imatynib ani rezygnacji z rozpoczęcia leczenia imatynibem jako leczenia I linii w przypadku wykrycia mutacji genu BCR-ABL w momencie rozpoznania przewlekłej białaczki szpikowej. Interpretując wyniki badania mutacji genu BCR-ABL naleŜy
pamiętać, Ŝe powyŜsza problematyka stanowi obecnie obszar intensywnych badań i dyskusji klinicznych, a dotychczasowe obserwacje mają najczęściej charakter retrospektywny i dotyczą małych grup chorych, co sugeruje ostroŜność w ocenie wyników. Przedstawione rekomendacje mają zatem wstępny charakter, oparty na obecnym stanie wiedzy i wymagają stałego uaktualniania
w miarę uzyskiwania nowych wyników badań.
SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka szpikowa – Mutacja – BCR-ABL – Rekomendacje
362 A. HELLMANN i wsp.
SUMMARY
Mutations in the BCR-ABL gene constitute one of the main causes of development of resistance
to imatinib and other BCR-ABL kinase inhibitors. Accumulating data indicate that testing for
mutations in this gene in patients with chronic myeloid leukemia is justified. Results of analysis
of mutations in the BCR-ABL gene should always be interpreted in relation to the clinical situation of a specific patient. In case of detecting a mutation in the BCR-ABL gene in a patient treated
with imatinib, a change of treatment may be considered only if treatment with imatinib at a dose
of 400 mg/d or higher has failed or the observed response to imatinib is suboptimal. On detecting a mutation related to complete resistance to imatinib (M244V, G250E, Y253F, Y253H,
E255K, E255V, T315I, F359V, H396P, H396R), cessation of treatment with imatinib is recommended rather than a dose increase to 600–800 mg/d. If the T3151 mutation is detected, a change
of treatment to dasatinib or nilotinib is also not advisable. At present no convincing data are
available that would justify a change of treatment if a mutation in the BCR-ABL gene is detected
in a patient well-responding to imatinib, or a resignation from introduction of imatinib as a firstline treatment if a mutation in the BCR-ABL gene is detected at the diagnosis of chronic myeloid
leukemia. When interpreting the results of testing for mutations in the BCR-ABL gene, one
should bear in mind that this particular subject is currently being intensively investigated and discussed, and the observations made so far are usually retrospective and based on small groups of
patients, which calls for caution in evaluation of the results. The recommendations presented
here should therefore be treated as presumptive, based on current knowledge and requiring continuous update with latest findings and developments in this field.
KEY WORDS: Chronic myeloid leukemia – Mutation – BCR-ABL – Recommendations
WSTĘP
W dniu 14.05.2007 w Warszawie odbyło się spotkanie panelu ekspertów z zakresu
hematologii. W czasie spotkania przedyskutowano dostępne dane literaturowe oraz
doświadczenia własne uczestników panelu dotyczące zastosowania analizy mutacji
genu BCR-ABL u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową (CML).
Spotkanie zostało zorganizowane na wniosek Bristol-Myers Squibb.
PoniŜszy dokument stanowi podsumowanie dyskusji panelu ekspertów oraz zawiera uzgodnienia dotyczące:
• Znaczenia mutacji genu BCR-ABL (na podstawie badań in vitro i in vivo)
• Wskazań do wykonania badania mutacji genu BCR-ABL
• Metodyki przeprowadzania badań mutacji genu BCR-ABL
• Interpretacji wyników i zaleceń terapeutycznych u chorych z wykrytymi mutacjami
genu BCR-ABL.
Uczestnicy spotkania
W panelu ekspertów udział wzięli:
prof. dr med. Andrzej Hellmann
prof. dr med. Jerzy Hołowiecki
prof. dr med. Wiesław W. Jędrzejczak
prof. dr med. Tadeusz Robak
prof. dr med. Aleksander Skotnicki
prof. dr med. Krzysztof Warzocha
Rekomendacje dot. Stosowania analizy mutacji genu BCR-ABL
363
dr Mirosław Majewski
oraz pracownicy Działu Medycznego Bristol-Myers Squibb.
CZĘSTOŚĆ WYSTĘPOWANIA MUTACJI GENU BCR-ABL
Częstość występowania mutacji domeny kinazowej genu BCR-ABL zaleŜy od fazy
CML oraz stopnia odpowiedzi na leczenie. U chorych z wczesną fazą przewlekłą mutacje BCR-ABL występują sporadycznie. Branford i wsp. (2003) nie stwierdzili obecności mutacji u 40 chorych z wczesną fazą przewlekłą (<12 mies. od rozpoznania),
podczas gdy mutacje zaobserwowano u 22% chorych w późnej fazie przewlekłej
(14/64) i 33% chorych w fazie akceleracji (13/40) (analiza mutacji metodą sekwencjonowania, badanie obejmowało chorych zarówno z dobrą odpowiedzią jak i brakiem
odpowiedzi na imatynib). W innym badaniu, przed rozpoczęciem leczenia imatynibem
stwierdzono obecność mutacji u 37% chorych w fazie akceleracji (10/27), 24% w kryzie mieloidalnej (5/19) oraz u Ŝadnego z 20 chorych w fazie przewlekłej (Willis i wsp.,
2005). Z przeglądu piśmiennictwa wynika natomiast, Ŝe w przypadku wtórnej oporności na imatynib mutacje genu BCR-ABL występują u 50-90% chorych (cf. Deininger
i wsp., 2005), podczas gdy u chorych z całkowitą odpowiedzią cytogenetyczną na leczenie imatynibem mutacje obserwowano u 15% (32/211) chorych (Branford i wsp.,
2004). Ryzyko wystąpienia mutacji zwiększa się w miarę upływu czasu od rozpoznania do rozpoczęcia leczenia imatynibem, w przypadku okresu krótszego niŜ 4 lata mutacje zaobserwowano u 9% chorych, natomiast przy okresie powyŜej 4 lat mutacje
wykryto juŜ u 41% chorych (p<0,0001) (Branford i wsp., 2003). Częstość występowania poszczególnych mutacji jest róŜna, najczęściej występuje mutacja T315I (ok. 20%
chorych z obecnością mutacji, 37/177), E255K (ok. 20%) i M351T (ok. 15%). Inne
stosunkowo często występujące mutacje to Y253H (7%), Q252H (5%), F317L (4%),
F359V (4%), Y253F (3%), H396R (3%), E355G (3%) (Deininger i wsp., 2005). U niektórych chorych moŜe występować więcej niŜ jedna mutacja. Do tej pory opisano występowanie mutacji punktowych domeny kinazowej genu BCR-ABL powodujących
zamianę ponad 40 aminokwasów (Hughes i wsp., 2006).
ZNACZENIE PREDYKCYJNE MUTACJI BCR-ABL. WPŁYW MUTACJI
GENU BCR-ABL NA ROZWÓJ OPORNOŚCI NA IMATYNIB I INNE LEKI
Z GRUPY INHIBITORÓW KINAZY BCR-ABL
Mutacje genu BCR-ABL mogą prowadzić do rozwoju oporności na imatynib przynajmniej w trzech mechanizmach: poprzez wpływ na miejsca kontaktowe uniemoŜliwiając tworzenie mostków wodorowych pomiędzy imatynibem i kinazą (np. mutacja
T315I), poprzez uniemoŜliwienie konformacyjnego dopasowania pętli P kinazy do
imatynibu (wiąŜącego się z kinazą w oddzielnym miejscu) (mutacje „pętli P”) oraz
poprzez przesunięcie równowagi pomiędzy obecnością kinazy BCR-ABL w konformacji aktywnej i nieaktywnej w kierunku konformacji aktywnej, w której niemoŜliwe
364 A. HELLMANN i wsp.
jest stereochemiczne dopasowanie cząsteczki kinazy do imatynibu (mutacje „pętli A”)
(Cowan-Jacob i wsp., 2004).
Nie rozstrzygnięta pozostaje kwestia, w jakim stopniu mutacje są obecne w komórkach nowotworowych przed rozpoczęciem leczenia imatynibem, które mogłoby
następnie prowadzić do wyselekcjonowania klonów opornych, a w jakim stopniu sama
obecność onkogenu BCR-ABL prowadzi do zwiększenia ryzyka wystąpienia mutacji.
Za pierwszym mechanizmem przemawia fakt, Ŝe leczenie imatynibem nie prowadzi do
całkowitego usunięcia komórek macierzystych w fazie spoczynkowej zawierających
gen BCR-ABL (Copland i wsp., 2006; Jørgensen i wsp., 2007; Roeder i wsp., 2006).
PrzeŜycie tych komórek, nawet pomimo całkowitego zahamowania fosforylacji CRKL
zaleŜnej od BCR-ABL, moŜe wskazywać na moŜliwość selekcji klonu opornego i wyjaśniać mechanizm wznowy CML w przypadku uzyskania całkowitej odpowiedzi cytogenetycznej w czasie leczenia imatynibem, a tym bardziej w przypadku przerwania
terapii tym lekiem. Na znaczenie drugiego mechanizmu wskazują badania dokumentujące wzrost ilości wolnych rodników oraz upośledzenie mechanizmów naprawczych
DNA w komórkach zawierających gen BCR-ABL (p. praca przeglądowa Penserga
i wsp., 2007). Prawdopodobnie oba powyŜsze mechanizmy mają, choć trudno określić
w jakim stopniu, wpływ na rozwój oporności na imatynib. Nie moŜna równieŜ obecnie
wykluczyć wpływu imatynibu na powstawanie mutacji genu BCR-ABL.
Na podstawie badań in vitro moŜna oszacować, w jakim stopniu zmniejsza się
moŜliwość hamowania kinazy BCR-ABL przez imatynib lub inne inhibitory z tej grupy. W przypadku mutacji: M244V, L248V, G250E, Q252H, Y253F, Y253H, E255K,
E255V, D276G, T315I, F317L, F359V, V379I, A380T, L387M, H396P, H396R,
F486S wartość IC50 podczas oceny hamowania fosforylacji BCR-ABL lub hamowania
proliferacji komórkowej przekracza uśrednione minimalne stęŜenie imatynibu w stanie
stacjonarnym w surowicy (mean trough plasma level) (1460 nM przy dawkowaniu
400 mg/d) (Baccarani i wsp., 2005; O’Hare i wsp., 2005, Martinelli i wsp., 2005), a zatem zastosowanie imatynibu w dawce 400 mg w warunkach klinicznych moŜe, w przypadku obecności tych mutacji, zmniejszać aktywność kinazy BCR-ABL jedynie
o mniej niŜ połowę. NaleŜy podkreślić, iŜ spośród wymienionych powyŜej mutacji
w przypadku M244V, G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F359V, H396P,
H396R wartość IC50 ponad 2-krotnie przekracza uśrednione minimalne stęŜenie imatynibu w stanie stacjonarnym w surowicy uzyskiwane przy dawkowaniu imatynibu
400 mg na dobę (ibidem), naleŜy się zatem spodziewać, Ŝe zwiększenie dawki imatynibu do 600-800 mg prawdopodobnie nie spowoduje w odpowiednim stopniu zahamowania aktywności kinazy BCR-ABL i przełamania oporności. Wydaje się zatem
uzasadnione rozpoznanie całkowitej oporności na imatynib w stosowanym w klinice
zakresie dawek (400–800 mg) w przypadku wykrycia obecności mutacji M244V,
G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F359V, H396P, H396R. Kryterium
tak zdefiniowanej oporności na imatynib (2 x IC50) naleŜy uznać za niezbyt rygorystyczne w świetle ostatnich doniesień odnoszących się do wartości IC90 (O’Hare
i wsp., 2005). Przyjęcie tego ostatniego kryterium skutkowałoby podwyŜszeniem wymaganego minimalnego stęŜenia leku, powyŜej którego dochodzi do hamowania ak-
Rekomendacje dot. Stosowania analizy mutacji genu BCR-ABL
365
tywności kinazy BCR-ABL (o 90%) do stęŜenia przekraczającego tolerowane dawki
leku, a tym samym uznania równieŜ innych mutacji BCR-ABL jako tych, które mogą
warunkować oporność na imatynib w przedziale dawek 400–800 mg/d.
Przedstawione powyŜej dane muszą być przyjmowane z pewną rezerwą, gdyŜ pochodzą z badań in vitro, jednak zarówno w przypadku imatynibu (p. praca przeglądowa
Deiningera i wsp., 2005) jak i ostatnio dazatynibu (Nicolini i wsp., 2007) wykazano
ich zgodność z działaniem leków w warunkach klinicznych.
Mutacja T315I wiąŜe się z opornością nie tylko na imatynib, ale równieŜ na dazatynib i nilotynib. Wartości IC50 dla kaŜdego z tych leków w przypadku obecności
mutacji T315I wielokrotnie przekraczają uzyskiwane u chorych stęŜenia leku w surowicy (O’Hare i wsp., 2005). Badanie Soverini i wsp. (2006) sugeruje moŜliwość rozwoju pierwotnej lub wtórnej oporności na dazatynib równieŜ w przypadku obecności
mutacji F317L. Dane te naleŜy jednak interpretować z ostroŜnością, z uwagi na fakt, Ŝe
raport dotyczy opisu jedynie 5 przypadków, a wartości IC50 dazatynibu w przypadku
mutacji F317L (<10nM) (O’Hare i wsp., 2005) są zbliŜone do minimalnego stęŜenia
dazatynibu w surowicy i znacznie niŜsze od stęŜenia maksymalnego (Cmin=9 nM,
Cmax= ok. 60nM dla dawki 2 x 70mg). Nie moŜna zatem wykluczyć, Ŝe oporność
u tych chorych rozwinęła się w innym mechanizmie, co podkreślają równieŜ sami autorzy pracy.
Podsumowując, w przypadku wykrycia mutacji M244V, G250E, Y253F, Y253H,
E255K, E255V, F359V, H396P, H396R zwiększanie dawki imatynibu nie prowadzi do
przełamania oporności i uzasadnione jest zastosowanie dazatynibu lub włączenie do
badania klinicznego z nowymi inhibitorami kinazy tyrozynowej BCR-ABL, natomiast
obecność mutacji T315I wiąŜe się z dodatkowo z opornością na dazatynib i nilotynib
i naleŜy szukać alternatywnych rozwiązań (alloprzeszczep komórek krwiotwórczych,
badania kliniczne itp).
ZNACZENIE PROGNOSTYCZNE MUTACJI. WPŁYW MUTACJI GENU
BCR-ABL NA ZMIANĘ POTENCJAŁU TRANSFORMUJĄCEGO KLONU
NOWOTWOROWEGO ORAZ NA ROKOWANIE
Mutacje punktowe genu BCR-ABL mogą powodować nie tylko rozwój oporności
na inhibitory BCR-ABL (wartość predykcyjna), ale równieŜ w sposób niezaleŜny zmieniać rokowanie (wartość prognostyczna) wskutek zwiększenia (gain of function) lub
zmniejszenia (loss of function) aktywności róŜnych procesów komórkowych. W pracy
Griswolda i wsp. (2006) wykazano, Ŝe mutacje genu BCR-ABL mogą prowadzić zarówno do zwiększenia jak i zmniejszenia proliferacji zmutowanych komórek w porównaniu do komórek zawierających niezmutowany allel BCR-ABL. Do zwiększenia proliferacji w warunkach in vitro dochodzi w przypadku mutacji Y253F i E255K, w przypadku mutacji T315I proliferacja zmutowanego klonu zaleŜy od warunków badania,
natomiast wystąpienie mutacji M351T prowadzi do zmniejszenia proliferacji komórek
nowotworowych. Podobnie, w przypadku oceny potencjału transformacyjnego progenitorów linii B-limfoidalnej, mutacje Y253F i E255K nasilały transformację komór-
366 A. HELLMANN i wsp.
kową, mutacje M351T i H396P zmniejszały, a mutacja T315I nie zmieniała transformacji komórkowej w porównaniu do niezmutowanych komórek BCR-ABL+ (ibidem).
Interesujące, Ŝe nie zawsze zmiana aktywności kinazy BCR-ABL mierzona fosforylacją białek efektorowych korelowała ze zmianą stopnia proliferacji i potencjałem transformacyjnym. Przykładowo, wystąpienie mutacji E255K prowadziło do zmniejszenia
aktywności kinazy, a jednocześnie do wzrostu potencjału transformacyjnego i nasilenia
proliferacji, co sugeruje moŜliwość aktywacji innych szlaków sygnałowych w komórce. Wzrost onkogenności mutantów BCR-ABL ze zmianami w miejscach 253 i 255
pętli P moŜe tłumaczyć niekorzystne znaczenie rokownicze tych mutacji, i to w mechanizmie niezaleŜnym od warunkowania oporności na imatynib.
Jak wiadomo, na podstawie wielu doniesień klinicznych, mutacje genu BCR-ABL
w locus kodującym pętlę P oraz mutacja T315I wiąŜą się z niekorzystnym rokowaniem
u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową. W przypadku pierwotnej lub wtórnej
oporności na imatynib wykrycie mutacji „pętli P” zwiększało ryzyko zgonu u chorych
w fazie przewlekłej CML (HR=1,86; p=0,012), a wykrycie mutacji T315I zwiększało
ryzyko progresji u chorych w fazie przewlekłej (HR=2,14; p=0,037) oraz ryzyko zgonu
u chorych w zaawansowanej fazie CML (HR=3,37; p=0,013) w porównaniu z obecnością innych mutacji (Nicolini i wsp., 2006). Podobnie w pracy Branford i wsp. (2003),
wykrycie mutacji „pętli P” zwiększało ryzyko zgonu u chorych z późną fazą przewlekłą lub fazą akceleracji w porównaniu do wystąpienia innego typu mutacji (p=0,0024).
WyŜsze ryzyko progresji (p=0,032) oraz zgonu (p=0,045) u chorych z późną fazą
przewlekłą i pierwotną opornością na imatynib w przypadku wykrycia mutacji „pętli
P” w porównaniu do innych mutacji zaobserwowała równieŜ Soverini i wsp. (2005).
METODY ANALIZY MUTACJI GENU BCR-ABL
Do analizy mutacji genu BCR-ABL moŜe być wykorzystywanych wiele metod,
w tym m.in. sekwencjonowanie, denaturujące HPLC (D-HPLC), PCR z wykorzystaniem allelospecyficznych oligonukleotydów (ASO-PCR). Metody analizy mutacji
róŜnią się między sobą czułością i swoistością (Hughes i wsp., 2006). Wykrycie mutacji za pomocą sekwencjonowania jest moŜliwe dopiero w przypadku, gdy liczba zmutowanych komórek w klonie nowotworowym przekracza 15–25%. W przypadku
D-HPLC górna granica czułości badania wynosi 10%, a czułość ASO-PCR jest na
poziomie 0,01% (Hughes i wsp., 2006). NaleŜy pamiętać, Ŝe komórki ze zmutowanym
genem BCR-ABL nie muszą wcale zdominować klonu białaczkowego, co moŜe wynikać np. ze zmniejszenia aktywności kinazy BCR-ABL i potencjału proliferacyjnego
komórek (Griswold i wsp., 2006). Z danych klinicznych wynika równieŜ, Ŝe wykrycie
mutacji metodą ASO-PCR u chorych przed rozpoczęciem terapii imatynibem nie koreluje z późniejszą odpowiedzią na leczenie w przewlekłej białaczce szpikowej (Willis
i wsp., 2005). Dlatego teŜ metody analizy mutacji charakteryzujące się wysoką czułością mogą prowadzić do uzyskania wyników dodatnich, ale nieistotnych z klinicznego punktu widzenia. Przyjmuje się, Ŝe czułość w metodzie sekwencjonowania oraz
w D-HPLC jest odpowiednia do wykrycia tych zmutowanych klonów komórek
Rekomendacje dot. Stosowania analizy mutacji genu BCR-ABL
367
BCR-ABL+, które mogą mieć znaczenie kliniczne (Hughes i wsp., 2006). Badanie
D-HPLC pozwala na stwierdzenie obecności mutacji bez identyfikacji jej rodzaju,
a zatem wymaga następowego sekwencjonowania w przypadku wykrycia obecności
mutacji w chromatogramie. Do celów naukowych natomiast moŜna wykorzystywać
inne metody (np. ASO-PCR) charakteryzujące się znacznie większą czułością. Obecnie
prowadzone są badania nad moŜliwością oceny liczby komórek ze zmutowanym genem BCR-ABL w stosunku do liczby komórek z genem BCR-ABL nie zawierającym
tych mutacji metodą real-time PCR.
W przypadku sekwencjonowania zaleca się wykorzystanie RNA, do oznaczeń naleŜy pobrać 20 ml krwi obwodowej (antykoagulant EDTA lub cytrynian) lub, jeŜeli
istnieje taka moŜliwość, 2-3 ml szpiku (większa czułość badania) pobranego na EDTA
lub cytrynian. Materiał powinien być transportowany w pojemniku z wkładem chłodzącym i dostarczony do laboratorium w ciągu 24 godzin od pobrania od chorego.
Skierowanie na badanie mutacji powinno zawierać dane kliniczne i laboratoryjne chorego, co pozwoli pracowni wydać wynik z jego wstępną interpretacją. Z uwagi na stosunkowo krótki fragment kodujący domenę kinazową genu BCR-ABL zazwyczaj jest
moŜliwe sekwencjonowanie całego odcinka w jednej reakcji. Wynik analizy mutacji
wydany przez pracownię powinien zawierać informacje o typie mutacji oraz informację czy mutacja jest związana z całkowitą opornością na imatynib (M244V, G250E,
Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F359V, H396P, H396R), częściową opornością na imatynib (L248V, Q252H, D276G, F317L, V379I, A380T, L387M, F486S),
opornością na dazatynib (T315I), opornością na nilotynib (T315I) lub teŜ, Ŝe w danym
przypadku nie ma obecnie stosownych danych literaturowych. Przy opisie mutacji
naleŜy równieŜ zaznaczyć, czy jest to mutacja w obszarze kodującym pętlę P (aminokwasy 244-255).
Sekwencjonowanie nie jest ukierunkowane na wykrycie jednej (lub kilku) określonej mutacji np. T315I, powyŜsza metoda pozwala na jednoczasowe wykrycie wszystkich mutacji obecnych w badanym fragmencie DNA.
KLINICZNE WSKAZANIA DO ANALIZY MUTACJI
Z klinicznego punktu widzenia wykonanie analizy mutacji uzasadnione jest u chorych w fazie przewlekłej CML z brakiem odpowiedzi lub odpowiedzią suboptymalną
na leczenie imatynibem w dawce 400 mg/d lub wyŜszej, a takŜe w przypadku utraty
uzyskanej uprzednio odpowiedzi na imatynib. Analiza mutacji jest takŜe wskazana
u wszystkich chorych z noworozpoznanym CML w fazie akceleracji lub kryzy blastycznej.
PowyŜsze zalecenia są zbieŜne z zaleceniami European LeukemiaNet (Baccarani
i wsp., 2006), opublikowanymi w USA przez NCCN (NCCN, 2007) oraz innymi
uzgodnieniami (Hughes i wsp., 2006; Hellmann i wsp., 2007).
NaleŜy pokreślić zasadność wykonania badania mutacji juŜ w przypadku spełnienia pierwszego z moŜliwych kryteriów.
368 A. HELLMANN i wsp.
Na podstawie badania IRIS moŜna próbować wstępnie szacować populację chorych, u których naleŜałoby rozwaŜyć wykonanie analizy mutacji. W powyŜszym badaniu, w ciągu 5 lat 31% chorych przerwało leczeniem imatynibem w dawce 400 mg/d,
w tym u 7% chorych stwierdzono utratę odpowiedzi hematologicznej lub większej
odpowiedzi cytogenetycznej, a u 7% chorych progresję choroby do fazy akceleracji lub
kryzy blastycznej (ze szczytem występowania w 2. roku terapii). Ponadto, w okresie
5 lat leczenia imatynibem nie uzyskano całkowitej odpowiedzi cytogenetycznej u 13%
chorych (Druker i wsp., 2006).
Nie ma przekonujących danych, które uzasadniałyby wykonanie analizy mutacji
genu BCR-ABL u chorych z dobrą odpowiedzią na leczenie imatynibem. Takie wskazanie byłoby uzasadnione dopiero w przypadku udowodnienia związku pomiędzy wykryciem mutacji u chorego z dobrą odpowiedzią na imatynib a rozwojem oporności.
Tymczasem dostępne w tym zakresie dane są niejednoznaczne (Branford i wsp., 2003;
Chu i wsp., 2005) lub wskazują na brak korelacji pomiędzy obecnością mutacji u chorego z całkowitą odpowiedzią cytogenetyczną a wznową choroby (Sherbenou i wsp.,
2007).
Z podobnych względów nie ma obecnie wskazań do przeprowadzania badania mutacji u chorych z fazą przewlekłą CML przed rozpoczęciem leczenia imatynibem. Nie
udowodniono dotychczas związku pomiędzy wykryciem mutacji u tych chorych a uzyskaniem odpowiedzi na leczenie imatynibem. Willis i wsp. (2007) wykazali nawet, Ŝe
ryzyko niepowodzenia leczenia lub zgonu w przebiegu terapii imatynibem nie róŜni się
u chorych z wykluczoną lub wykrytą mutacją przed rozpoczęciem leczenia imatynibem.
WPŁYW BADANIA MUTACJI NA DALSZE LECZENIE CHORYCH NA
PRZEWLEKŁĄ BIAŁACZKĘ SZPIKOWĄ
Wynik analizy mutacji genu BCR-ABL naleŜy zawsze interpretować w odniesieniu
do sytuacji klinicznej chorego. U chorych leczonych imatynibem zmiana terapii moŜe
być rozwaŜona w przypadku wykrycia mutacji genu BCR-ABL jedynie, jeśli jednocześnie obserwuje się niepowodzenie leczenia imatynibem w dawce 400 mg/d lub większej, lub odpowiedź suboptymalną na imatynib. W takich przypadkach, po wykryciu
mutacji warunkujących całkowitą oporność na imatynib: M244V, G250E, Y253F,
Y253H, E255K, E255V, F359V, H396P, H396R zaleca się przerwanie leczenia imatynibem zamiast zwiększania dawki leku do 600-800 mg/d i zastosowanie dazatynibu lub
włączenie do badania klinicznego z nowymi inhibitorami kinazy tyrozynowej BCRABL. W przypadku wykrycia mutacji T315I nie zaleca się równieŜ zwiększania dawki
imatynibu ani zmiany leczenia na dazatynib lub nilotynib, naleŜy natomiast rozwaŜyć
moŜliwość alloprzeszczepu komórek krwiotwórczych lub kwalifikacji do badania klinicznego. Nie ma obecnie przekonujących danych, które uzasadniałyby zmianę leczenia w przypadku wykrycia mutacji BCR-ABL u chorych z dobrą odpowiedzią na imatynib ani rezygnacji z rozpoczęcia leczenia imatynibem jako leczenia I linii w przy-
Rekomendacje dot. Stosowania analizy mutacji genu BCR-ABL
369
padku wykrycia mutacji BCR-ABL w momencie rozpoznania przewlekłej białaczki
szpikowej.
NaleŜy podkreślić, Ŝe analizę mutacji oraz moŜliwość zmiany aktualnego leczenia
w zaleŜności od uzyskanego wyniku badania naleŜy rozwaŜyć juŜ w przypadku wystąpienia pierwszej moŜliwej sytuacji klinicznej wskazującej na brak odpowiedzi, utratę
odpowiedzi lub odpowiedź suboptymalną na leczenie imatynibem.
Oprócz danych z badań in vitro publikowanych jest coraz więcej danych wskazujących, Ŝe u chorych po niepowodzeniu leczenia imatynibem i z wykrytą mutacją genu
BCR-ABL moŜna uzyskać dobrą odpowiedź na leczenie po zmianie terapii na inny
inhibitor kinazy BCR-ABL (Cortes i wsp., 2007; Guilhot i wsp., 2007; Hochhaus
i wsp., 2007; Kantarjian i wsp., 2006; 2007).
Najwięcej danych klinicznych dotyczy dazatynibu. W badaniu START-R oceniano
skuteczność i tolerancję leczenia dazatynibem w porównaniu do imatynibu w dawce
800 mg u chorych z fazą przewlekłą CML po niepowodzeniu leczenia imatynibem
w dawce dobowej 400–600 mg (Kantarjian i wsp., 2007). Mutacje warunkujące wzrost
oporności na imatynib (5x wzrost IC50) wykryto przed rozpoczęciem leczenia w badaniu u 25 chorych (27%) w grupie z dazatynibem i 7 chorych (15%) w grupie z imatynibem 800 mg/d. W okresie obserwacji 15 miesięcy (mediana) większą odpowiedź
cytogenetyczną (MCyR) uzyskano u 48% chorych leczonych dazatynibem i 14%
otrzymujących imatynib w duŜych dawkach. Całkowitą odpowiedź hematologiczną
(CHR) zaobserwowano u 84% chorych w grupie z dazatynibem i 29% chorych w grupie z imatynibem (ibidem). W innym badaniu wykazano obecność mutacji warunkujących głęboką oporność na imatynib (5x wzrost IC50) u 26% (46/180) chorych w fazie
przewlekłej po niepowodzeniu leczenia imatynibem w dawce 400–800 mg. Zastosowanie dazatynibu pozwoliło na uzyskanie CHR u 87% chorych, a MCyR u 46% chorych (Hochhaus i wsp., 2007). U chorych rozpoczynających leczenie dazatynibem
w fazie akceleracji po niepowodzeniu terapii imatynibem w dawce 400-800 mg/d mutacje genu BCR-ABL rozpoznano u 60% chorych (60/100), w tym mutacje „pętli P”
u 30 chorych. Większą odpowiedź hematologiczną odnotowano u 73% chorych z obecnością mutacji i u 73% chorych z mutacją „pętli P”, natomiast większą odpowiedź
cytogenetyczną uzyskało odpowiednio 30% i 23% chorych (Guilhot i wsp., 2007).
Dostępne są juŜ równieŜ dane dotyczące leczenia dazatynibem u chorych z kryzą mielo- lub limfoidalną, która wystąpiła w trakcie terapii imatynibem. U takich chorych
przed rozpoczęciem leczenia dazatynibem wykryto mutacje w 49% (54/110) przypadków, w tym mutacje „pętli P” u 28 chorych (25%). Większą odpowiedź hematologiczną uzyskano u 30% i 32% chorych, odpowiednio z obecnością dowolnej mutacji
i u chorych z mutacją „pętli P”, natomiast większą odpowiedź cytogenetyczną na leczenie dazatynibem opisano odpowiednio u 33% i 32% chorych (Cortes i wsp., 2007).
W przypadku nilotynibu wyniki badań in vitro wskazują głównie na mutację T315I
jako mogącą warunkować oporność na lek (O’Hare i wsp., 2005; Weisberg i wsp.,
2006). Natomiast dostępne obecnie wyniki badań klinicznych ograniczają się do badania I fazy (z zakresem dawek 50 – 1200 mg/d), w którym nie wykazano korelacji pomiędzy obecnością mutacji „pętli P” lub mutacji „poza pętlą P” a uzyskaniem odpo-
370 A. HELLMANN i wsp.
wiedzi hematologicznej lub cytogenetycznej u chorych z wcześniejszą opornością na
imatynib (brak osobnej analizy wyników dla mutacji T315I, którą wykryto jedynie
u 2% chorych) (Kantarjian i wsp., 2006).
REKOMENDACJE
• Z klinicznego punktu widzenia wykonanie analizy mutacji uzasadnione jest w następujących przypadkach (słownik skrótów na końcu opracowania):
Faza przewlekła CML u chorych leczonych imatynibem w dawce 400 mg/d lub wyŜszej
1. Brak odpowiedzi na leczenie
− 3. miesiąc – brak odpowiedzi hematologicznej lub progresja
− 6. miesiąc – brak CHR lub brak odpowiedzi cytogenetycznej (CyR) (> 95%
Ph+)
− 12. miesiąc – brak MCyR (> 35% Ph+)
− 18. miesiąc – brak CCyR (> 0% Ph+)
2. Odpowiedź suboptymalna
− 3. miesiąc – brak CHR
− 6. miesiąc – brak MCyR (> 35% kom Ph+)
− 12. miesiąc – brak CCyR (> 0% kom Ph+)
− 18. miesiąc – brak MMolR (mniejsza niŜ o 3 log redukcja transkryptu BCRABL, lub jego ilość większa niŜ 0,1%)
3. Progresja choroby w trakcie leczenia imatynibem (do fazy akceleracji bądź kryzy
blastycznej)
4. Utrata uzyskanej uprzednio odpowiedzi
− utrata odpowiedzi hematologicznej (utrata CHR)
− utrata odpowiedzi cytogenetycznej (utrata MCyR bądź CCyR)
− utrata odpowiedzi molekularnej (utrata MMolR) (10-krotny wzrost ilości transkryptu BCR-ABL, potwierdzony w kolejnym badaniu PCR w okresie 1 miesiąca; np. z 0,1% do 1%)
Faza akceleracji lub kryzy blastycznej w momencie rozpoznania CML
– u wszystkich chorych z noworozpoznanym CML w fazie akceleracji lub kryzy blastycznej
• Nie ma klinicznych wskazań do wykonywania analizy mutacji u chorych z dobrą
odpowiedzią na leczenie imatynibem.
• Nie ma klinicznych wskazań do badania mutacji u chorych z fazą przewlekłą CML
przed rozpoczęciem leczenia imatynibem.
• Wynik analizy mutacji genu BCR-ABL naleŜy zawsze interpretować w odniesieniu
do sytuacji klinicznej chorego. U chorego leczonego imatynibem zmiana terapii moŜe być rozwaŜona w przypadku wykrycia mutacji genu BCR-ABL jedynie jeśli jednocześnie obserwuje się niepowodzenie leczenia imatynibem lub odpowiedź suboptymalną na imatynib.
Rekomendacje dot. Stosowania analizy mutacji genu BCR-ABL
371
• W przypadku wykrycia mutacji warunkujących całkowitą oporność na imatynib tj.
M244V, G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, F359V, H396P, H396R oraz jednoczesnego wykluczenia mutacji T315I zaleca się, u chorego z brakiem odpowiedzi
lub odpowiedzią suboptymalną na imatynib, przerwanie leczenia tym lekiem zamiast zwiększania jego dawki do 600–800 mg/d oraz zastosowanie dazatynibu lub
włączenie do badania klinicznego z nowymi inhibitorami kinazy tyrozynowej BCRABL. Znaczące osłabienie działania imatynibu obserwuje się równieŜ w przypadku
mutacji: L248V, Q252H, D276G, F317L, V379I, A380T, L387M, F486S.
• W przypadku wykrycia mutacji T315I u chorego z niepowodzeniem leczenia imatynibem zaleca się odstawienie leku, i nie zaleca się zmiany leczenia na dazatynib lub
nilotynib. Taki chory powinien być moŜliwie szybko poddany allotransplatacji komórek krwiotwórczych, a w razie obecności przeciwwskazań do tego leczenia lub
braku dawcy próbie leczenia interferonem alfa lub chemioterapii. Wprawdzie nie ma
badań bezpośrednio potwierdzających słuszność takiego postępowania, ale w tej sytuacji znajdują zastosowanie standardy leczenia przewlekłej białaczki szpikowej
wypracowane przed wprowadzeniem inhibitorów kinaz tyrozynowych.
• Nie ma obecnie przekonujących danych, które uzasadniałyby zmianę leczenia
w przypadku wykrycia mutacji BCR-ABL u chorych z dobrą odpowiedzią na imatynib ani rezygnacji z rozpoczęcia leczenia imatynibem jako leczenia I linii w przypadku wykrycia mutacji BCR-ABL w momencie rozpoznania przewlekłej fazy,
przewlekłej białaczki szpikowej.
• NaleŜy podkreślić, Ŝe analizę mutacji oraz moŜliwość zmiany aktualnego leczenia
w zaleŜności od uzyskanego wyniku badania naleŜy rozwaŜyć juŜ w przypadku wystąpienia pierwszej moŜliwej sytuacji klinicznej wskazującej na brak odpowiedzi,
utratę odpowiedzi lub odpowiedź suboptymalną na leczenie imatynibem.
• Za podstawową metodę w rutynowej diagnostyce klinicznej mutacji punktowych
genu BCR-ABL u chorych z CML naleŜy uznać sekwencjonowanie. MoŜliwe jest
równieŜ zastosowanie D-HPLC do wstępnego badania w celu wykrycia mutacji.
Dzięki ograniczonej czułości powyŜszych badań nie są wykrywane małe liczebnie
klony komórek zawierających zmutowany gen BCR-ABL, co ogranicza ryzyko wykrycia mutacji nieistotnych z klinicznego punktu widzenia. Badanie D-HPLC pozwala na stwierdzenie obecności mutacji bez identyfikacji jej rodzaju, a zatem wymaga następowego sekwencjonowania w przypadku wykrycia obecności mutacji
w chromatogramie. Do celów naukowych moŜna wykorzystywać inne metody (np.
ASO-PCR) charakteryzujące się znacznie większą czułością.
• W przypadku sekwencjonowania zaleca się wykorzystanie RNA, do oznaczeń naleŜy pobrać 20 ml krwi obwodowej (antykoagulant EDTA, cytrynian) lub, jeŜeli istnieje taka moŜliwość, 2-3 ml szpiku (większa czułość badania) pobranego na EDTA
lub cytrynian. Materiał powinien być transportowany w pojemniku z wkładem chłodzącym i dostarczony do laboratorium w ciągu 24 godzin od pobrania od chorego.
Skierowanie na badanie mutacji powinno zawierać dane kliniczne i laboratoryjne
chorego, co pozwoli pracowni wydać wynik z jego wstępną interpretacją.
372 A. HELLMANN i wsp.
UWAGI KOŃCOWE
Pojawiająca się w ostatnim okresie coraz większa ilość danych przedklinicznych
i klinicznych wskazuje na celowość wykonywania badania mutacji genu BCR-ABL
oraz wartość kliniczną wyniku takiego badania w modyfikacji leczenia chorych na
przewlekłą białaczkę szpikową. W przypadku niektórych mutacji wiadomo, Ŝe ich
wystąpienie moŜe warunkować wystąpienie całkowitej oporności na imatynib
(M244V, G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F359V, H396P, H396R).
Mutacja T315I moŜe równieŜ odpowiadać za rozwój całkowitej oporności na dazatynib
i nilotynib. NaleŜy jednocześnie pamiętać, Ŝe wynik analizy mutacji genu BCR-ABL
powinien być za kaŜdym razem interpretowany w odniesieniu do sytuacji klinicznej
chorego. Niepowodzenie terapii danym lekiem przy obecności jednej z powyŜszych
mutacji uzasadnia bowiem wniosek, Ŝe komórki ze zmutowanym allelem zdominowały
klon białaczkowy, co stanowi podłoŜe obserwowanego braku skuteczności prowadzonej terapii.
Interpretując wyniki badania mutacji genu BCR-ABL naleŜy pamiętać, Ŝe powyŜsza problematyka stanowi obecnie obszar intensywnych badań i dyskusji klinicznych,
a dotychczasowe obserwacje mają najczęściej charakter retrospektywny i dotyczą małych grup chorych, co sugeruje ostroŜność w ocenie wyników. W przyszłości dane
z kolejnych badań powinny pozwolić na weryfikację przedstawionych rekomendacji
oraz na identyfikację nowych oraz poszerzenie wiedzy klinicznej na temat juŜ istniejących mutacji, a tym samym na lepszą ocenę rokowania i bardziej celowane leczenie
w wybranych przypadkach klinicznych.
Słownik skrótów
ASO-PCR – PCR z wykorzystaniem allelospecyficznych oligonukleotydów (ASO-PCR)
CCyR – całkowita odpowiedź cytogenetyczna
CHR – całkowita odpowiedź hematologiczna
CML – przewlekła białaczka szpikowa
CyR – odpowiedź cytogenetyczna
D-HPLC – denaturujące HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa)
HR – odpowiedź hematologiczna
HR – współczynnik ryzyka (przy wynikach analizy statystycznej)
MCyR – większa odpowiedź cytogenetyczna
MMolR – większa odpowiedź molekularna
PFS – przeŜycie wolne od progresji
OS – całkowite przeŜycie
PIŚMIENNICTWO
1. Baccarani i wsp., Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet. Blood, 2006; 108: 1809–1820.
Rekomendacje dot. Stosowania analizy mutacji genu BCR-ABL
373
2. Branford i wsp., Detection of BCR-ABL mutations in patients with CML treated with imatinib is
virtually always accompanied by clinical resistance, and mutations in the ATP phosphate-binding loop (Ploop) are associated with a poor prognosis. Blood, 2003; 102: 276–283.
3. Branford i wsp., The frequency of detection of BCR-ABL mutations in imatinib treated patients
with chronic phase CML who attain a complete cytogenetic response (CCR) does not diminish with increasing duration of CCR but the associated loss of response is usually gradual. Blood, 2004; 104: abs
271.
4. Chu i wsp., Detection of BCR-ABL kinase mutations in CD34+ cells from chronic myelogenous
leukemia patients in complete cytogenetic remission on imatinib mesylate treatment. Blood, 2005; 105:
2093–2098.
5. Copland i wsp., Dasatinib (BMS-354825) targets an earlier progenitor population than imatinib in
primary CML but does not eliminate the quiescent fraction. Blood, 2006; 107: 4532–4539.
6. Cortes i wsp., Dasatinib induces complete hematologic and cytogenetic responses in patients with
imatinib-resistant or –intolerant chronic myeloid leukemia in blast crisis. Blood, 2007 (przed drukiem,
dostęp online).
7. Cowan-Jacob i wsp., Imatinib (STI571) resistance in chronic myelogeneous leukemia: molecular
basis of the underlying mechanisms and potential strategies for treatment. Mini. Rev. Med. Chem., 2004;
4: 285–299.
8. Deininger i wsp., The development of imatinib as a therapeutic agent for chronic myeloid leukemia. Blood, 2005; 105: 2640–2653.
9. Druker i wsp., Five-year follow-up of patients receiving imatinib for chronic myeloid leukemia. N.
Engl. J. Med., 2006; 355: 2408–2417.
10. Griswold i wsp., Kinase domain mutants of BCR-ABL exhibit altered transformation potency,
kinase activity, and substrate utilization, irrespective of sensitivity to imatinib. Moll. Cell. Biol., 2006; 26:
6082–6093.
11. Guilhot i wsp., Dasatinib induces significant hematologic and cytogenetic responses in patients
with imatinib-resistant or -intolerant chronic myeloid leukaemia in accelerated phase. Blood, 2007 (przed
drukiem, dostęp online).
12. Hellmann i wsp., Aktualne uzgodnienia dotyczące stosowania dazatynibu u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową lub ostrą białaczkę limfoblastyczną z obecnością chromosomu Ph. Acta Haematol.
Pol., 2007; 38: 123–138.
13. Hochhaus i wsp., Dasatinib induces notable hematologic and cytogenetic responses in chronicphase chronic myeloid leukemia after failure of imatinib therapy. Blood, 2007; 109: 2303–2309.
14. Hughes i wsp., Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors:
review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and
kinase domain mutations and for expressing results. Blood, 2006; 108: 28–37.
15. Jørgensen i wsp., Nilotinib exerts equipotent anti-proliferative effects to imatinib, functions as an
ABCG2 inhibitor, but does not induce apoptosis in CD34+ CML cells. Blood, 2007 (przed drukiem,
dostęp online).
16. Kantarjian i wsp., Nilotinib in Imatinib-Resistant CML and Philadelphia Chromosome–Positive
ALL. N. Engl. J. Med., 2006; 354: 2542–2551 (suppl.).
17. Kantarjian i wsp., Dasatinib or high-dose imatinib for chronic-phase chronic myeloid leukemia after failure of first-line imatinib: a randomized phase-II trial. Blood, 2007 (przed drukiem, dostęp online).
18. Martinelli i wsp., New tyrosine kinase inhibitors in chronic myeloid leukemia. Haematologica,
2005; 90: 534–541.
19. Nicolini i wsp., Mutation status and clinical outcome of 89 imatinib mesylate-resistant chronic
myelogenous leukemia patients: a retrospective analysis from the French intergroup of CML (Fi(ϕ)-LMC
GROUP). Leukemia, 2006; 20: 1061–1066.
20. Nicolini i wsp., BCR-ABL mutant kinetics in CML patients treated with dasatinib. Leuk. Res.,
2007 (przed drukiem, dostęp online).
374 A. HELLMANN i wsp.
21. NCCN, National Comprehensive Cancer Network, Practice Guidelines in Oncology, Chronic
Meylogenous Leukemia, v. 2.2007, www.nccn.org (dostęp: 05.2007).
22. O’Hare i wsp., In vitro activity of BCR-ABL inhibitors AMN107 and BMS-354825 against clinically relevant imatinib-resistant Abl kinase domain mutants. Cancer Res., 2005; 65: 4500-5.
23. Penserga i wsp., Fusion tyrosine kinases: a result and cause of genomic instability. Oncogene,
2007; 26: 11–20.
24. Roeder i wsp., Dynamic modeling of imatinib-treated chronic myeloid leukemia: functional insights and clinical implications. Nature Med., 2006; 12: 1181–1184.
25. Sherbenou i wsp., Mutations of the BCR-ABL-kinase domain occur in a minority of patients with
stable complete cytogenetic response to imatinib. Leukemia, 2007; 21: 489–493..
26. Soverini i wsp., ABL mutations in late chronic phase chronic myeloid leukemia patients with upfront cytogenetic resistance to imatinib are associated with a greater likelihood of progression to blast
crisis and shorter survival: a study by the GIMEMA Working Party on chronic myeloid leukemia. J. Clin.
Oncol., 2005; 23: 4100–4109.
27. Weisberg i wsp., AMN107 (nilotinib): a novel and selective inhibitor of BCR-ABL. Brit. J. Cancer, 2006; 94: 1765 – 1769.
28. Willis i wsp., High-sensitivity detection of BCR-ABL kinase domain mutations in imatinib-naive
patients: correlation with clonal cytogenetic evolution but not response to therapy. Blood, 2005; 106:
2128–2137.
Praca wpłynęła do Redakcji 27.08.2007 r. i została zakwalifikowana do druku 31.08.2007 r.
Adres Autora:
Prof. dr med. Andrzej Hellmann
Katedra i Klinika Hematologii i Transfuzjologii
Akademia Medyczna w Gdańsku
ul. Dębinki 7
80-211 Gdańsk