ADVANCETM HRP Nr kat. K4067 500 ml Nr kat. K4068 110

ADVANCE
TM
HRP
Nr kat. K4067
Nr kat. K4068
Nr kat. K4069
Gotowy do uŜycia
Przeznaczenie
500 ml
110 ml
11 ml
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Opisywany system jest przeznaczony do stosowania z pierwotnymi przeciwciałami mysimi i króliczymi
wybranymi przez UŜytkownika, w celu jakościowej identyfikacji antygenów w preparatach tkanek prawidłowych
i zmienionych chorobowo utrwalanych w formalinie i zatapianych w parafinie. Identyfikację prowadzi się w
mikroskopie świetlnym. PoniŜej przedstawiono listę zalecanych produktów, które moŜna uzyskać od firmy Dako
w celu optymalnego zastosowania testu ADVANCETM HRP.
Wskazówki dotyczące interpretacji tego zjawiska przedstawiono w dokumencie „General Instructions for
Immunohistochemical Staining” („Instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych”).
(1) Zasada przeprowadzenia odczynu, (2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem,
(3) Przechowywanie, (4) Przygotowanie preparatu, (5) Wykonanie barwienia, (6) Kontrola jakości,
(7) Rozwiązywanie problemów, (8) Interpretacja wyniku barwienia, (9) Ograniczenia metody.
Streszczenie i
informacje ogólne
ADVANCE HRP jest systemem detekcji odczynów immunohistochemicznych (IHC) o bardzo duŜej czułości.
System jest przydatny w wykrywaniu antygenów występujących w niewielkich stęŜeniach. System nie zawiera
biotyny, dzięki czemu uzyskano lub znacznie zmniejszono nieswoisty odczyn wywołany endogennym
wiązaniem awidyny i biotyny w wątrobie, nerkach, tkance chłonnej i skrawkach mroŜakowych. Wszystkie
odczynniki wchodzące w skład systemu ADVANCE HRP są gotowe do uŜycia. PoniewaŜ opisywany system
jest niezwykle czułą metodą detekcji, optymalne rozcieńczenia przeciwciał pierwotnych mogą być kilkakrotnie
większe niŜ stosowane w tradycyjnych metodach – np. EnVision, ABC lub LSAB.1-5
Zasady procedury
Endogenna aktywność peroksydazy jest wyeliminowana przez inkubację próbki z właściwym odczynnikiem
blokującym aktywność endogennej peroksydazy. Następnie inkubuje się próbkę ze stosownymi, właściwie
rozcieńczonymi przeciwciałami pierwotnymi mysimi lub króliczymi, po czym wykonuje serię inkubacji
trwających po 30 min z preparatami ADVANCE™ HRP Link i ADVANCE™ HRP Enzyme. Po inkubacji z
roztworem substrat-chromogen przez 5–30 min barwienie jest zakończone.
Dostarczane
odczynniki
ADVANCETM HRP Link
Odczynnik zawiera wtórne przeciwciała skierowane przeciwko antygenom mysim i króliczym w buforze TrisHCl zawierającym białko stabilizujące i substancję o działaniu przeciwbakteryjnym.
ADVANCETM HRP Enzyme
Odczynnik zawiera przeciwciała polimeryzowane z peroksydazą chrzanową w buforze Tris-HCl zawierającym
białko stabilizujące i substancję o działaniu przeciwbakteryjnym.
Wszystkie odczynniki wchodzące w skład systemu ADVANCE HRP są specjalnie przystosowane do uŜywania
podczas testów immunohistochemicznych. Odczynniki są dostarczane w stanie gotowym do uŜycia.
Dodatkowe rozcieńczenie odczynników lub modyfikacje temperatury inkubacji odczynników moŜe doprowadzić
do uzyskania błędnych wyników.
Materiały wymagane,
ale niedostarczane
(118768-002)
Ściereczki wchłaniające
Tkanka kontrolna (kontrola dodatnia i ujemna)
Barwienie kontrastowe: środek oparty na roztworze wodnym, np. Automation Hematoxylin (nr kat. S3301),
Hematoxylin for IHC (nr kat. S3302) lub preparaty hematoksyliny: Mayer’s Hematoxylin (hematoksylina wg
Mayera) bądź Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (hematoksylina wg Mayera w modyfikacji Lillego)
(nr kat. S3309)
Szkiełka nakrywkowe
Woda destylowana
Etanol absolutny i roztwór o stęŜeniu 95%
Mikroskop świetlny (20x–800x)
Środki do zatapiania, np. Glycergel® Mounting Medium (nr kat. C0563), gotowy wodny preparat do zatapiania
Faramount Aqueous Mounting medium, Ready-to-use (nr kat. S3025) lub bezwodny preparat Ultramount
(nr kodu S1964)
Przeciwciała pierwotne i odczynnik do kontroli ujemnej
Szkiełka powlekane poli-L-lizyną lub szkiełka sylanizowane Silanized Slides (nr kat. S3003)
Naczynia lub kąpiele do barwienia
Minutnik (pomiar w odstępach 3–40 minut)
Butelki z roztworem płuczącym
Roztwór buforu płuczącego
Ksylen, toluen lub substytuty ksylenu
306008PL_002 s. 1/6
Materiały dodatkowe wymagane, ale niedostarczane
Roztwór wodorotlenku amonu o stęŜeniu 15 mmol/L rozcieńczony do 0,037 mol/L
Marker typu PAP Pen (nr kat. S2002)
Zalecane produkty
firmy Dako
Nr kat. Dako
S3800
S2001
S2003
Nazwa produktu
Autostainer Plus
Peroxidase Block
Dual Endogenous Enzyme Block
S3006
Wash Buffer 10x
For Automated and Manual IHC Use
AEC+ Ready-to-use
Liquid DAB+
Automation Hematoxylin
Hematoxylin for IHC
Mayer’s Hematoxylin or Lillie’s Modified
Mayer’s Hematoxylin
K3461/K3469
K3467/K3468
S3301
S3302
S3309
Typ produktu
Urządzenie
Odczynnik blokujący peroksydazę
Odczynnik blokujący endogenną
peroksydazę
Bufor płuczący
System substratów
Barwienie kontrastowe
Środki ostroŜności
1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników.
2. Nie naleŜy uŜywać odczynników po upływie terminu waŜności dla danego sposobu przechowywania. JeŜeli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane na wkładce informacyjnej do produktu,
UŜytkownik powinien sprawdzić ich jakość.
3. Nie naleŜy zastępować odczynników produktami pochodzącymi z innych partii lub z zestawów innych
producentów.
4. W przypadku ekspozycji na silne światło jakość odczynników enzymatycznych i substratów-chromogenów
moŜe ulec zmniejszeniu. Nie naleŜy przechowywać składników zestawu ani wykonywać barwienia w silnym
oświetleniu, takim jak bezpośrednie światło słoneczne.
5. Stosowanie innych od opisanych parametrów czasu inkubacji lub temperatur moŜe powodować błędne
wyniki badania; wszystkie zmiany tego rodzaju muszą zostać zweryfikowane przez UŜytkownika.
6. Podobnie jak w przypadku kaŜdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŜy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
7. NaleŜy stosować właściwe wyposaŜenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą
bądź oczami.
8. Niewykorzystany odczynnik naleŜy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi.
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8°C.
Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności odczynnika. Dlatego, równolegle z odczynami na
materiale pochodzącym od pacjentów, naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. JeŜeli wystąpi
nieoczekiwany odczyn, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, nasuwający
podejrzenie zakłóceń pracy systemu, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Przygotowanie
odczynników
Dla wygody zaleca się przygotowanie następujących odczynników przed rozpoczęciem barwienia.
Roztwory buforów płuczących
Zalecanym buforem płuczącym do diagnostyki IHC metodą ręczną i automatyczną jest preparat Tris Buffered
Saline with Tween (TBST, nr kat. S3006) o stęŜeniu 0,05 mol/L. Do barwienia metodą ręczną moŜna równieŜ
stosować bufory płuczące Tris buffered Saline (TBS, nr kat. S1968) o stęŜeniu 0,05 mol/L i Phosphate
Buffered Saline (PBS, nr kat. S3024) o stęŜeniu 0,02 mol/L. Nie zaleca się stosowania roztworów buforów
płuczących zawierających azydek sodu. Azydek sodu powoduje inaktywację peroksydazy (HRP), powodując
ujemny wynik odczynu. Przechowywać niewykorzystany bufor w temperaturze 2–8°C. W przy padku zmętnienia
bufor nie nadaje się do uŜycia.
Do spłukiwania substancji blokującej peroksydazę, substratu i barwienia kontrastowego moŜna stosować wodę
destylowaną.
Przeciwciała pierwotne
UŜytkownik musi dokonać optymalizacji stęŜonych roztworów przeciwciał. Rozcieńczenia naleŜy
przygotowywać przy uŜyciu preparatu Antibody Diluent (nr kat. S0809) lub rozcieńczalnika zawierającego bufor
Tris-HCI o stęŜeniu 0,05 mol/L z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA). W przypadku większości przeciwciał
pierwotnych stosowanych z opisywanym systemem wystarczający czas inkubacji wynosi 30 minut.
Odczynnik do kontroli ujemnej
W idealnych warunkach odczynnik kontroli ujemnej zawiera przeciwciała, które nie wykazują swoistej
reaktywności z tkankami ludzkimi lub prawidłową bądź nieimmunizowaną surowicą w takim samym materiale
(roztworze), co rozcieńczone przeciwciała pierwotne. Odczynnik do kontroli ujemnej powinien zawierać
przeciwciała pochodzące od tego samego gatunku zwierzęcia i naleŜące do tej samej podklasy, co
przeciwciała pierwotne i rozcieńczone do takiego samego stęŜenia immunoglobulin lub białek, jak przeciwciała
pierwotne, przy uŜyciu tego samego rozcieńczalnika. Czas inkubacji odczynnika do kontroli ujemnej powinien
odpowiadać czasowi stosowanemu w przypadku przeciwciał pierwotnych.
(118768-002)
306008PL_002 s. 2/6
Barwienie kontrastowe
Po zastosowaniu chromogenu DAB powstaje produkt końcowy nierozpuszczalny w alkoholu, który moŜna
stosować z alkoholowym roztworem hematoksyliny. JeŜeli stosuje się substrat-chromogen AEC, powstaje
barwny, rozpuszczalny w alkoholu produkt końcowy. W takim przypadku naleŜy stosować środki do barwienia
kontrastowego oparte na roztworze wodnym, np. Automation Hematoxylin (nr kat. S3301), Hematoxylin for IHC
(nr kat. S3302), Mayer’s Hematoxylin bądź Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (nr kat. S3309). Po wykonaniu
barwienia kontrastowego hematoksyliną naleŜy wykonać dokładne płukanie preparatu wodą destylowaną, a
następnie zanurzyć skrawki w kąpieli zawierającej amoniak o stęŜeniu 0,037 mol/L lub podobny środek
róŜnicujący. W celu przygotowania wodnego roztworu amoniaku o stęŜeniu 0,037 mol/L naleŜy wymieszać
2,5 ml wodorotlenku amonu o stęŜeniu 15 mol/L (stęŜonego) z 1 litrem wody.
Niewykorzystany roztwór amoniaku o stęŜeniu 0,037 mol/L moŜna przechowywać w temperaturze pokojowej
(20–25°C) w szczelnie zamkni ętej butelce przez okres do 12 miesięcy.
Alternatywne procedury barwienia kontrastowego przedstawiono w wytycznych producenta.
Środki do zatapiania preparatu
Do zatapiania preparatu zaleca się stosowanie środka Glycergel Mounting Medium (nr kat. C0563) lub
wodnego środka zatapiającego Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (nr kat. S3025).
Preparat Glycergel naleŜy przed uŜyciem ogrzać do temperatury min. 50ºC. MoŜna takŜe stosować bezwodny
środek do trwałego zatapiania (np. Ultramount, nr kodu S1964).
Przygotowanie
materiału
System stosuje się do badania skrawków tkankowych utrwalanych w formalinie i zatapianych w parafinie,
preparatów mroŜakowych i rozmazów cytologicznych.
Przed rozpoczęciem odczynu IHC naleŜy wykonać utrwalenie i przeprowadzenie tkanki. Utrwalenie
zabezpiecza przed autolizą i rozkładem wycinków, utrzymuje antygenowość, zwiększa współczynnik
załamania światła przez struktury tkankowe i zwiększa odporność składników komórek na przeprowadzenie.
Przeprowadzenie tkanki polega na odwodnieniu, usunięciu środków odwadniających, przepojeniu substancją
zatapiającą, zatopieniu i wykonaniu wycinków. Utrwalacze najczęściej stosowane podczas przygotowania
tkanek do diagnostyki IHC przedstawiono w dokumencie „General Instructions for Immunohistochemical
Staining” („Instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych”). Podane informacje mają charakter
wyłącznie orientacyjny. Optymalna procedura powinna zostać ustalona i zweryfikowana przez UŜytkownika.
Charakterystyka
wydajnościowa
Przeciwciała wchodzące w skład opisywanego produktu zostały poddane absorpcji w fazie stałej w celu usunięcia
przeciwciał wykazujących reaktywność krzyŜową z ludzkimi przeciwciałami (Ig). MoŜe jednak występować
niewielka reaktywność krzyŜowa z przeciwciałami pochodzącymi od innych gatunków. Przeciwciała skierowane
przeciw antygenom mysim i króliczym poddano oczyszczeniu za pomocą kolumnowej chromatografii
powinowactwa do przeciwciał – odpowiednio – mysich i króliczych. Sumaryczna aktywność, obejmująca wiązanie
z IgG i wszystkimi podklasami IgG oraz z IgM, jest skierowana przeciwko pierwotnym przeciwciałom mysim i
króliczym. Peroksydaza chrzanowa (HRP) obecna w polimerze została przygotowana z HRP o wysokoswoistej
aktywności. Nieskoniugowane cząsteczki usunięto metodą Ŝelowej chromatografii filtracyjnej.
Wykonanie odczynu
Uwagi dotyczące procedury
Przed przystąpieniem do wykonania odczynu UŜytkownik powinien uwaŜnie przeczytać podane instrukcje i
zapoznać się z produktem.
Dostarczane odczynniki i instrukcje opracowano z myślą o uzyskaniu optymalnych wyników. Dodatkowe
rozcieńczenie odczynników bądź nieprzestrzeganie czasu lub temperatury inkubacji moŜe spowodować
uzyskanie błędnych wyników.
Przed przystąpieniem do wykonania odczynu wszystkie odczynniki naleŜy doprowadzić do temperatury
pokojowej (20–25°C). Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze
pokojowej.
Podczas wykonywania barwienia nie moŜna dopuścić do wysychania skrawków tkankowych. Wysuszone
skrawki tkankowe mogą powodować nasilenie nieswoistego odczynu. NaleŜy osłonić szkiełka nakrywkowe
znajdujące się w miejscach naraŜonych na przeciągi. JeŜeli stosuje się długie czasy inkubacji, preparaty
powinny się znajdować w środowisku o odpowiedniej wilgotności.
Procedura automatyczna
Sposób programowania systemu Dako Autostainer / Autostainer Plus:
ETAP 1: Wybrać funkcję Protocol Template Auto Program (automatyczne programowanie wzoru protokołu).
ETAP 2: Umieścić odczynniki w statywie na odczynniki w aparacie, a następnie napełnić pojemnik na bufor
płuczący i butelki na wodę dejonizowaną.
ETAP 3: WłoŜyć preparaty do aparatu.
ETAP 4: Rozpocząć serię odczynów.
ETAP 5: Wyjąć preparaty z aparatu.
(118768-002)
306008PL_002 s. 3/6
Procedura ręczna
(Zobacz równieŜ powyŜszą listę kompatybilnych produktów firmy Dako, nadających się do stosowania na
poszczególnych etapach procedury.)
ETAP 1:
ETAP 2:
ETAP 3:
ETAP 4:
ETAP 5:
ETAP 6:
BLOKOWANIE ENDOGENNEJ PEROKSYDAZY
Strząsnąć nadmiar bufora. Posługując się chusteczką niepozostawiającą nitek ostroŜnie otrzeć
szkiełko wokół preparatu tak, by usunąć pozostałości płynu i utrzymywać odczynniki w obszarze
zgodnym z zaleceniami.
Nanieść wystarczającą ilość odczynnika Dual Endogenous Enzyme Block lub Peroxidase Block do
zakrycia próbki.
Inkubować przez 5–10 min z odczynnikiem Dual Endogenous Enzyme Block lub Peroxidase Block,
w zaleŜności od stęŜenia endogennego enzymu w analizowanej próbce.
OstroŜnie przepłukać wodą destylowaną lub roztworem buforowym z butelki na płyn płuczący (nie
naleŜy kierować strumienia płynu bezpośrednio na tkankę), a następnie umieścić preparat w
świeŜej kąpieli z buforem TBS.
PRZECIWCIAŁA PIERWOTNE LUB ODCZYNNIK DO KONTROLI UJEMNEJ
Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Nanieść optymalnie rozcieńczony
roztwór przeciwciał pierwotnych lub odczynnika do kontroli ujemnej, aŜ próbka zostanie zakryta.
Inkubować przez 30* (±1) minut.
OstroŜnie przepłukać roztworem buforowym z butelki na płyn płuczący (nie naleŜy kierować
strumienia płynu bezpośrednio na tkankę), a następnie umieścić preparat w świeŜej kąpieli z
buforem na 5 minut.
ADVANCETM HRP Link
Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Nanieść wystarczającą ilość
preparatu ADVANCETM HRP Link, by zakryć próbkę. Inkubować przez 30* (±1) minut. Przemyć
preparaty jak podczas etapu 2.
ADVANCETM HRP Enzyme
Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Nanieść wystarczającą ilość
preparatu ADVANCETM HRP Enzyme, aby zakryć próbkę. Inkubować przez 30* (±1) minut.
Przemyć preparaty jak podczas etapu 2.
ROZTWÓR CHROMOGEN-SUBSTRAT
Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Nanieść gotowy roztwór
chromogen-substrat, aŜ próbka zostanie zakryta. Inkubować przez 5–30 min (AEC+) lub 5–10 min
(DAB+).
OstroŜnie przepłukać szkiełka wodą dejonizowaną. Umieścić odpady roztworu substrat-chromogen
w pojemniku na materiały niebezpieczne w celu właściwego usunięcia. Umieścić szkiełka po
przepłukaniu w świeŜej kąpieli z wody destylowanej.
BARWIENIE KONTRASTOWE HEMATOKSYLINĄ (opcjonalnie)
Zanurzyć preparaty w kąpieli z roztworu hematoksyliny. Długość okresu inkubacji zaleŜy od
stęŜenia stosowanego roztworu hematoksyliny. Przepłukiwać w kąpieli z wody destylowanej lub
dejonizowanej przez 2–5 minut.
* W celu zwiększenia wydajności zaleca się stosowanie krótszych czasów inkubacji ze zmienionym
rozcieńczeniem przeciwciał pierwotnych. Dla osiągnięcia najwyŜszej czułości zaleca się czas trwania inkubacji
wynoszący 30 min.
Kontrola jakości
RóŜne metody obróbki tkanek i procedur technicznych stosowanych w laboratorium UŜytkownika mogą
powodować istotne róŜnice wyników. Wymaga to regularnego wykonywania wewnętrznej kontroli jakości oraz
procedur wymienionych poniŜej. NaleŜy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi kontroli jakości
wydanymi przez College of American Pathologists (CAP) Certification Program immunohistochemicznej oraz
publikacjami 6–8, wyszczególnionymi w Piśmiennictwie. Informacje dotyczące czułości i immunoreaktywności
przedstawiono w kartach specyfikacji poszczególnych przeciwciał.
Dalsze informacje na temat dodatnich i ujemnych prób kontrolnych przedstawiono w dokumencie „General
Instructions for Immunohistochemical Staining” („Instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych”).
Interpretacja odczynu
Wskazówki dotyczące interpretacji odczynu przedstawiono w dokumencie „General Instructions for
Immunohistochemical Staining” („Instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych”).
Ograniczenia ogólne
Informacje dotyczące ogólnych ograniczeń przedstawiono w dokumencie „General Instructions for
Immunohistochemical Staining” („Instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych”).
W przypadku stosowania starych lub niebuforowanych utrwalaczy lub ekspozycji na temperaturę
przekraczającą 60oC podczas przygotowania preparatów moŜe nastąpić zmniejszenie czułości odczynu.
Endogenna aktywność peroksydazy lub podobnym charakterze moŜe występować w hemoproteinach – np.
hemoglobinie, mioglobinie, cytochromach i katalazie – oraz w eozynofilach.9,10 Tego rodzaju aktywność moŜna
zahamować stosując inkubację z preparatem Peroxidase Block (5 min) lub Dual Endogenous Enzyme Block
(5–10 min) przed wprowadzeniem przeciwciał pierwotnych. Ten odczynnik moŜna stosować do rozmazów krwi
i szpiku kostnego oraz preparatów mroŜakowych. NaleŜy jednak pamiętać, Ŝe procedura nie usuwa
czerwonawobrązowego zabarwienia wywołanego obecnością hemoprotein. MoŜna równieŜ stosować roztwór
(118768-002)
306008PL_002 s. 4/6
alkoholowy nadtlenku wodoru. Ta procedure powoduje jednak denaturację niektórych antygenów.
Tkanki pochodzące od osób z zakaŜeniem wirusem zapalenia wątroby typu B i zawierające antygen
powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) mogą wykazywać nieswoiste barwienie w reakcji z
peroksydazą chrzanową.11
Prawidłowe i nieimmunizowane surowice pochodzące od tego samego gatunku zwierzęcia, od którego
pochodzą przeciwciała wtórne stosowane podczas etapów hamowania aktywności enzymatycznej, mogą
powodować wyniki fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie z uwagi na obecność autoprzeciwciała lub
przeciwciał naturalnych.
Odczynniki dostarczane w zastawie mają optymalne rozcieńczenia. Zwiększanie rozcieńczenia moŜe
powodować utratę detekcji antygenów.
Rozwiązywanie
problemów
Problem
Zbyt silny odczyn
Na brzegach preparatu
widoczne barwienie tła.
Tło widoczne w dodatnich
preparatach kontrolnych
Tło widoczne w ujemnych
preparatach kontrolnych
Odczyn nieswoisty.
Brak odczynu
Zbyt długi czas testu
(118768-002)
Komentarz
ADVANCE HRP jest wysokoczułym systemem detekcji, pozwalającym
na stosowanie przeciwciał pierwotnych o wyŜszych rozcieńczeniach.
JeŜeli rozcieńczenie przeciwciał jest zbyt małe, odczyn będzie zbyt
silny. NaleŜy wykonać seryjne rozcieńczenie przeciwciał pierwotnych
dobierając wartość rozcieńczenia znajdującą się w obrębie plateau,
przed punktem opadania wykresu.
Tkanka uległa wysuszeniu. Stosując barwienie techniką ręczną naleŜy
umieścić preparaty w komorze nawilŜającej.
Zwiększyć rozcieńczenie przeciwciał pierwotnych (zobacz punkt „Zbyt
silny odczyn”, powyŜej)
StęŜenie odczynnika do kontroli ujemnej powinno odpowiadać stęŜeniu
przeciwciał pierwotnych o optymalnie dobranym mianie. JeŜeli tak nie
jest naleŜy zwiększyć rozcieńczenie odczynnika do ujemnej próby
kontrolnej.
Płukanie odgrywa zasadnicze znaczenie. JeŜeli płukanie po którym
następuje 5-minutowa inkubacja jest niedostateczne, naleŜy dodatkowo
dwukrotnie przepłukać preparaty, zanurzając kaŜdorazowo na 5 min.
Zasadnicze znaczenie dla uzyskania odczynu ma właściwa kolejność
stosowania preparatów ADVANCETM HRP Link i ADVANCETM HRP
Enzyme: naleŜy się upewnić, Ŝe zastosowano właściwą kolejność
etapów.
Roztwór przeciwciał pierwotnych był zbyt rozcieńczony. Sporządzić
seryjne rozcieńczenia przeciwciał w celu ustalenia właściwego
rozcieńczenia.
System ADVANCE HRP pozwala na prowadzenie testów z wysoką
czułością, krótkimi czasami inbukacji lub testów łączących obie te
cechy. JeŜeli wymagany jest krótszy sumaryczny czas badania, naleŜy
zastosować przeciwciała pierwotne o wyŜszym stęŜeniu.
306008PL_002 s. 5/6
Piśmiennictwo
1. Guesdon JL, et al. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem
Cytochem 1979; 27:1131
2. Warnke R and Levy R. Detection of T and B cell antigens with hybridoma monoclonal antibodies.
A biotin-avidin-horseradish peroxidase method. J Histochem Cytochem 1980; 28:771
3. Petrusz P and Ordronneau P. Immunohistochemistry of pituitary hormones. Polak MT and
van Noorden S, eds. Immunocytochemistry: Practical applications in pathology and biology.
Bristol-Wright-PSG 1983; 212
4. Nagle RB, et al. Immunohistochemical demonstration of keratins in human ovarian neoplasms.
A comparison of methods. J Histochem Cytochem 1983; 31:1010
5. Giorno R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction.
Diag Immunol 1984; 2:161
6. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilber DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special
report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836
7. National Committee for Clinical Laboratory Standard. Internal quality control testing: principles and
definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4
8. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control.
Biotech & Histochem 1991; 66:194
9. Escribo LM, Gabriel LC, Villa E, Navarro JL. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and
adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213
10. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press
1990; 46
11. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to
hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol
1980; 73:626
Edition 06/10
(118768-002)
306008PL_002 s. 6/6