WYTWARZANIE I ANALIZA PRODUKTÓW MLECZNYCH

Laboratorium – biotechnologia ogólna – dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.3
PRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO
Kwas cytrynowy
Kwas cytrynowy (2-hydroksy-1,2,3-propanotrikarboksylowy) o Mcz = 192 i temperaturze topnienia 153ºC po raz
pierwszy został wyizolowany z soku cytryn. W formie krystalicznej kwas ten występuje w postaci bezwodnej lub
jednowodnej. Jednowodna forma jest otrzymywana przez krystalizację w temperaturze poniżej 36,6ºC, powyżej tej
temperatury powstaje forma bezwodna.
Kwas cytrynowy występuje w przyrodzie w owocach cytrusowych i ananasach. Owoce te do niedawna były głównym
źródłem tego kwasu. Światowa produkcja kwasu cytrynowego przekracza 300 000 ton rocznie, co jest podyktowane
bardzo dużym zapotrzebowaniem na ten kwas ze strony przemysłu spożywczego, farmaceutycznego, chemicznego
oraz metalurgicznego. Jego wykorzystanie wynika m.in. z działania konserwującego na skutek obniżania wartości pH
środowiska. Jednocześnie jest związkiem nietoksycznym, o dobrych walorach smakowych i zapachowych.
Zastosowanie kwasu cytrynowego i jego pochodnych
 w produkcji i przetwórstwie żywności jest stosowany (za zgodą FAO/WHO) jako inhibitor enzymów, głównie
oksydaz powodujących utlenianie polifenoli, co objawia się ciemnieniem owoców i warzyw,
 wykorzystywany jest do produkcji napojów, słodyczy, owoców kandyzowanych i win, jako środek zakwaszający i
stabilizujący,
 tworzenie połączeo kompleksowych z jonami metali (Fe, Cu, Zn) zadecydowało o zastosowaniu jako stabilizatora
olejów; wiążąc metale katalizujące proces jełczenia tłuszczów, kwas cytrynowy przerywa reakcję tworzenia
nadtlenków i innych produktów powstałych w wyniku utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych w procesie
autooksydacji olejów,
 zdolnośd do wiązania metali ciężkich umożliwiła wykorzystanie kwasu cytrynowego do oczyszczania powierzchni
metali przed spawaniem lub pokrywaniem powłokami ochronnymi,
 w mleczarstwie, wodne roztwory kwasu cytrynowego są stosowane do usuwania z aparatury kamienia
mlecznego (osad z białka, tłuszczu i soli mineralnych mleka),
 w przemyśle farmaceutycznym stosowany jest jako środek dodawany do tabletek powodujący efekt musujący,
 w stacjach krwiodawstwa pochodne kwasu cytrynowego są stosowane jako środki zapobiegające krzepnięciu
krwi,
 w chemii gospodarczej sole kwasu cytrynowego wypierają trudno biodegradowane fosforany ze składu
detergentów,
 estry kwasy cytrynowego znalazły zastosowanie jako nietoksyczne plastyfikatory w cienkich powłokach
ochraniających żywnośd.
W 1893 roku Wehmer po raz pierwszy wykrył kwas cytrynowy w kulturach pędzlaków i nazwał je Citromyces pfefferianus, a
Curie w 1917 roku stworzył przemysłowe podstawy produkcji tego kwasu dzięki odkryciu, że Aspergillus niger rośnie dobrze i
wydziela duże ilości kwasu cytrynowego w pożywkach płynnych o pH 2,5-3,5. Wzrost pH powoduje przestawienie produkcji na
kwas glukonowy, a dalej na szczawiowy. Niska wartośd pH chroni pożywkę przed zakażeniami, głównie bakteryjnymi.
Producentami kwasu cytrynowego są wyselekcjonowane szczepy Aspergillus niger, A. wentii, A. clavatus oraz liczne drożdże z
rodzaju Candida (C. lipolytica, C. tropicalis, C. intermedia, C. guilliermondi), które syntezują kwas cytrynowy w środowisku
zawierającym n-alkany. Wśród szczepów z gatunku C. lipolytica został wyselekcjonowany szczep, u którego stwierdzono cykl
płciowy (został nazwany na cześd odkrywcy Yarrowia lipolytica) i który może wytwarzad kwas cytrynowy z n-parafin, dzięki
czemu znalazł szybko zastosowanie w przemyśle. Jednym z podstawowych aspektów przemawiających za stosowaniem
drożdży jest ich zdolnośd do wykorzystywania w charakterze źródła węgla szerokiej gamy surowców, zwłaszcza
niekonwencjonalnych. Jak wiadomo, używanie w procesach biotechnologicznych tanich odnawialnych surowców pozwala na
znaczne obniżenie kosztów produkcji. W ostatnich latach, wraz z rozwojem produkcji biopaliw (biodiesla), atrakcyjnym i
tanim surowcem stosowanym w procesach biotechnologicznych jest gliceryna. Szacuje się, że pod koniec 2010 r. na rynku
europejskim będzie dostępnych około 1 mln ton gliceryny, którą zagospodaruje się różnymi metodami, w tym także
metodami biotechnologicznymi. Jednak przetwarzanie glicerolu w użyteczne produkty w procesach biotechnologicznych
znajduje się dopiero w fazie badao laboratoryjnych. Odpadowa gliceryna została wykorzystana szczególnie w procesach
beztlenowych, m.in. do produkcji: 1,3 propanodiolu, dihydroksyacetonu, kwasu bursztynowego i wodoru. Wstępne badania,
wskazują, że odpadowy glicerol zapewnia otrzymanie, w hodowlach z udziałem mutantów octanowych Y. lipolytica, wysokich
ilości kwasu cytrynowego, dochodzących do 200 g/l. Ponadto wydajnośd kwasu cytrynowego z tego surowca była wyższa w
porównaniu do hodowli prowadzonych w podłożach glukozowych. Interesujący jest również fakt, iż obok kwasu
cytrynowego, w podłożach zawierających glicerol, szczep drożdży Y. lipolytica produkuje także duże ilości alkoholi cukrowych,
takich jak erytrytol i mannitol. Kwas cytrynowy wytwarzają także Penicillium citrinum, Mucor piriformis. Jednak w praktyce
przemysłowej największe znaczenie mają szczepy Aspergillus niger.
Proces produkcyjny
Produkcję kwasu cytrynowego prowadzi kilkoma metodami. Na początku najczęściej stosowano metodę powierzchniową,
potem wgłębną, a ostatnio – szczególnie w Japonii – stosuje się hodowlę na pożywkach stałych.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Laboratorium – biotechnologia ogólna – dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.3
PRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO
Metoda powierzchniowa
Oczyszczony melas rozcieocza się wodą do zawartości 15 – 17% cukru, zakwasza kwasem siarkowym do pH 6,3, dodaje
pewną ilośd żelazocyjanku potasowego, sterylizuje, ochładza do temp. 40ºC i przetłacza do komór fermentacyjnych,
odkażonych dwutlenkiem siarki lub formaliną.
Komory fermentacyjne zawierają ok. 80 płytkich tac fermentacyjnych, które napełnia się roztworem melasy buraczanej i
szczepi zarodnikami kultury A. niger, wyhodowanymi na podłożu z ziemniaczanym w probówkach i przeniesionymi następnie
do kolb z wodą wodociągową. Wodna zawiesina grzyba jest pistoletem natryskowym równomiernie rozprowadzana na
powierzchnię tac. Po około dwóch dniach powierzchnia pożywki pokrywa się białą grzybnią kiełkujących zarodników. W czasie
fermentacji tworzy się duża ilośd dwutlenku węgla, który usuwa się poprzez nawiew jałowego powietrza. Nadmierne
przewietrzanie wzmacnia jednak procesy oddechowe pleśni i zmniejsza wydajnośd fermentacji. Ponadto przyczynia się do
nadmiernego parowania pożywki. Proces fermentacji trwa 9 – 11 dni w temp. 30 – 34ºC. Po zakooczeniu procesu można
spuścid melasę a pozostałą warstwę kożucha grzybni podwarstwid świeżą pożywką. W zebranym płynie pohodowlanym
wytrąca się kwas szczawiowy (jako szczawian wapnia) i oddziela przez sączenie. Kwas cytrynowy jest wytrącany za pomocą
węglanu wapnia (cytrynian wapnia), krystalizuje i uwalnia przy użyciu kwasu siarkowego. Wydajnośd fermentacji wynosi 5070% w stosunku do użytego cukru. Suchy cytrynian zawiera 62 – 68% kwasu cytrynowego. Materiał odpadowy jakim jest
2
grzybnia pleśni (ok. 10 kg/1 m tac) może byd wykorzystana jako źródło białka (ok. 20%).
Źródłem zanieczyszczeo mikrobiologicznych w powierzchniowej metodzie otrzymywania kwasu cytrynowego jest przede
wszystkim melasa buraczana. W surowcu tym występują głównie bakterie z rodzaju Bacillus, Pseudomonas, a także
Escherichia coli i Enterobacter aerogenes. Źródłem tych ostatnich bakterii oprócz melasy może byd także woda stosowana w
procesie technologicznym, jeśli nie spełnia wymagao określonych norma. Wszystkie drobnoustroje występujące jako
zanieczyszczenia są zdolne do redukcji azotanów (V) do azotanów (III), które działają hamująco na rozwój grzybni. Badania
wykazały, ze w podłożu melasowym, po niewłaściwie przeprowadzonej sterylizacji, mogą pozostad żywe bakterie z rodzaju
Lactobacillus i Leuconostoc, wywierające antagonistyczny wpływ na rozwój grzybni Aspergillus niger. Spośród pleśni
najczęstszym zanieczyszczeniem jest Penicillium purpurogenum i Penicillium rubrum. W procesie technologicznym konidia
tych pleśni dostają sie z powietrzem stosowanym do przewietrzania komór, a także wraz ze szczepionka konidiów Aspergillus
niger podczas jej rozpylania na powierzchnie pożywki. Pleśnie te są bogate w enzymy hydrolityczne, dzięki którym rozwijają
się na grzybni Aspergillus niger, powodując jej lizę. Aby uniknąd skutków zanieczyszczeo mikrobiologicznych, należy stosowad
aktywna szczepionkę grzybni Asperillus niger, szybko opanowująca środowisko i obniżającą wartośd pH do poziomu
hamującego rozwój mikroflory bakteryjnej. Podobnie jak w każdym procesie biotechnologicznym musi byd zapewniona
wysoka czystośd aparatury i komór fermentacyjnych oraz powietrza do ich przewietrzania, ponieważ w przeciwnym razie te
środowiska stad sie mogą źródłem zanieczyszczenia różna mikroflora, zakłócająca proces produkcji kwasu cytrynowego.
Metoda wgłębna
W chwili obecnej główny sposób produkcji kwasu cytrynowego. Dośd duże trudności napotkało przestawienie używanych
szczepów z rozwoju na powierzchni na rozwój wewnątrz cieczy z zachowaniem wydajności wytwarzania kwasu cytrynowego.
Obecnie nadal trwają badania nad dopracowaniem optymalnego składu pożywki i warunków fermentacji. Standardowo
fermentacja przebiega w kadziach zaopatrzonych w mieszadła i systemy napowietrzające, w temp. 30 – 32ºC w ciągu 10 dni.
Wydajnośd tej metody liczona na kwas w stosunku do użytego cukru przekracza 90%.
Metoda na pożywkach stałych
Najpowszechniej rozwinięta w Japonii, gdzie 20% ilości produkowanego kwasu cytrynowego pochodzi z hodowli na podłożu
stałym. Surowcem w tej metodzie mogą byd otręby, wytłoki z trzciny cukrowej, wadliwa melasa buraczana lub trzcinowa i
inne odpadowe surowce roślinne. Technologia ta budzi też duże nadzieje ze względu na znacznie niższe obciążenie produkcji
ściekami oraz wyższą tolerancję A. niger na obecnośd jonów metali i mikroelementów.
Wydzielanie kwasu cytrynowego z podłoża hodowlanego
Wydzielanie kwasu cytrynowego odbywa sie tzw. metodą cytrynianową. Polega ona na wytracaniu na gorąco cytrynianu
wapnia, traktując roztwór pofermentacyjny wodorotlenkiem wapnia. Wytworzony osad cytrynianu wapnia [Ca3(C6H5O7)2] po
oddzieleniu od masy reakcyjnej zadaje się roztworem H2SO4, w celu otrzymania kwasu cytrynowego w postaci wolnej.
Wytracony gips oddziela sie przez filtracje, roztwór zaś zagęszcza i wydziela czysty produkt przez krystalizacje. Handlowy kwas
cytrynowy wyodrębniony ta metoda jest związany z jedna cząsteczka wody (C6H5O7xH2O). Metoda cytrynianowa jest bardzo
uciążliwa dla przemysłowej produkcji kwasu cytrynowego, z uwagi na duże zużycie kwasu siarkowego, wodorotlenku wapnia,
a także wytwarzanie w tym procesie nadmiernych ilości gipsu. W Instytucie Technologii Przemysłu Chemicznego i
Spożywczego Akademii Ekonomicznej we Wrocławiu została opracowana metoda wydzielania i oczyszczania kwasu
cytrynowego tzw. metoda bezcytrynianowa. Może byd ona wykorzystana tylko w tych przypadkach, w których do biosyntezy
kwasu cytrynowego stosowane są substraty o wysokiej czystości, tj.: glukoza, skrobia, maczki cukrowe, a wiec głównie we
wgłębnej hodowli Aspergillus niger. Metoda bezcytrynianowa polega na:
dezaktywacji grzybni w temp. 70°C i oddzieleniu od roztworu hodowlanego,
oczyszczeniu filtratu garbnikami i ziemia okrzemkowa,
odbarwieniu na kolumnie węglowej,
zatężeniu w wyparce próżniowej do 72% zawartości kwasu cytrynowego,
krystalizacji kwasu cytrynowego w temp. 7°C.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Laboratorium – biotechnologia ogólna – dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.3
PRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO
Wydajnośd krystalizacji kwasu cytrynowego wynosi około 50%. Odciek miedzykrystaliczny po odbarwieniu węglem aktywnym
oczyszcza sie na jonitach (kationit i anionit). Proces oczyszczania jest tak prowadzony, aby oczyszczony odciek odpowiadał
wymaganiom stawianym przez normę na spożywczy kwas cytrynowy w płynie. Poważnym problemem ekologicznym jest gips
wytwarzany w procesie oczyszczania kwasu cytrynowego. Zagospodarowanie gipsu jako materiału budowlanego jest możliwe
dopiero po odpowiednim oczyszczeniu. Roztwór hodowlany po oddzieleniu grzybni zawiera obok głównego metabolitu, jakim
jest kwas cytrynowy, wiele cennych enzymów, głównie enzymy pektynolityczne, proteolityczne, a także glukanazy, co stwarza
możliwośd ich przemyslowego pozyskiwania. Ponadto źródłem wielu enzymów (proteinazy, amylazy, pektynazy, oksydaza
glukozowa), które mogą byd wydzielane dla celów handlowych, jest grzybnia Aspergillus niger. Wytwarzana w dużych
ilościach w procesach biosyntezy kwasu cytrynowego może byd także wykorzystana na cele paszowe, ponieważ zawiera
ponad 40% białka w suchej masie, z czego polowa to białko dobrze przyswajalne. Ponadto zawiera liczne mikroelementy.
Szczepy Aspergillus niger stosowane do produkcji kwasu cytrynowego
Szczepy A. niger stosowane w przemysłowej produkcji kwasu cytrynowego otrzymane zostały w wyniku mutagenizacji oraz
skriningowych selekcji szczepów naturalnych. Jako mutageny stosowane są czynniki fizyczne (promieniowanie UV o dł. λ=260
nm), chemiczne lub kombinacje obu. Wykorzystuje się także techniki rekombinacji genetycznej. Selekcja szczepów o cennych
właściwościach technologicznych prowadzona jest pod kątem dalszego zastosowania w ściśle określonych warunkach
produkcyjnych. Uzyskane mutanty należy zabezpieczyd przed degradacją cech materiału biologicznego, np. poprzez
liofilizację, przechowywanie konidiów z jałowym piaskiem, węglem aktywnym lub cytrynianem wapnia. Jednak mimo takich
metod zabezpieczenia często dotychczasowy metabolizm ukierunkowany na syntezę kwasu cytrynowego zmienia się na
oksydacyjny, w wyniku czego powstaje biomasa. Stąd konieczna jest ciągła selekcja odmian o pożądanych cechach.
Biochemiczne uwarunkowania nadprodukcji kwasu cytrynowego u Aspergillus niger
Nadprodukcja kwasu cytrynowego u niektórych odmian Aspergillus niger jest wynikiem zakłócenia cyklu Krebsa na skutek
braku lub niskiej aktywności enzymów odpowiedzialnych za jego dalszą konwersję. Efekt ten jest warunkowany genetycznie,
ale poprzez odpowiednie warunki hodowli można zintensyfikowad aktywnośd produkcyjną szczepów, zapewniając wysoką
wydajnośd kwasu cytrynowego. Kwas cytrynowy jest jednym z etapów cyklu Krebsa, którego głównym zadaniem jest
utlenianie związków organicznych, a nie wydzielanie ich do podłoża. Fermentacja cytrynowa, polega na gromadzeniu się
znacznych ilości kwasu cytrynowego wskutek
zablokowania enzymu biorącego udział w tlenowym
rozkładzie cukrów. Jeśli weźmiemy pod uwagę, że
niektóre metale (cynk, mangan, żelazo) są
aktywatorami pewnych enzymów, to ich brak w
pożywce powoduje blokowanie i powstają warunki,
w których wytworzony kwas cytrynowy nie może
byd zmetabolizowany i jest gromadzony w podłożu.
Jest to korzystne z punktu widzenia mikrobiologii
technicznej i znalazło praktyczne wykorzystanie w
przemyśle.
Produkcja kwasu cytrynowego jest w wysokim
stopniu uzależniona od składu pożywki. Korzystne
warunki procesu:
- wysokie stężenie cukru (ok. 10% w hodowli
wgłębnej i 16% w powierzchniowej)
+2
+2
+2
- niedobór jonów metali: Mn , Zn , Fe (< 0,1 mg/
100 cm3)
- ograniczona ilośd związków azotu i fosforu
(limitacja wzrostu grzybni)
- niska wartośd pH (ok. 2,4-2,6)
- dobre natlenienie środowiska (dot. procesu
wgłębnego na pożywkach syntetycznych).
Rys. 1. Szlaki metaboliczne przemiany glukozy do kwasu cytrynowego u Aspergillus niger: l – synteza cytrynianowa, 2,3hydrataza akonitanowa, 4 - dehydrogenaza izocytrynianowa, 5 - dehydrogenaza 2-ketoglutaranowa, 6 - liaza
izocytrynianowa; pogrubione linie oznaczają miejsca osłabionej aktywności enzymatycznej.
Kwas cytrynowy powstaje w początkowych przemianach cyklu Krebsa, w wyniku kondensacji acetylo-CoA i szczawiooctanu,
katalizowanej przez syntaze cytrynianowa (rys. 1). W procesie rozwoju grzybni (trofofaza), a następnie produkcji kwasu
cytrynowego (idiofaza) heksozy asymilowane są w dwóch szlakach metabolicznych EMP (glikoliza) i pentozo fosforanowym
(HMP). Ten ostatni szlak uaktywnia sie w fazie intensywnego rozwoju grzybni, po czym ustępuje glikolizie w fazie produkcji
kwasu cytrynowego. Zatem głównym regulatorem szybkości glikolizy jest fosfofruktokinaza, która staje sie jednocześnie
regulatorem biosyntezy kwasu cytrynowego. Enzym ten jest wrażliwy na obecnośd cytrynianu w środowisku, ale u szczepów
+
Aspergillus niger w procesie produkcji kwasu cytrynowego represja ta jest znoszona nadmiarem jonów NH 4 w komórkach, w
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Laboratorium – biotechnologia ogólna – dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.3
PRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO
2+
wyniku zakłóconych przemian białkowych spowodowanych niedoborem w podłożu jonów Mn . Mechanizmem regulującym
biosyntezę kwasu cytrynowego jest także ograniczenie syntezy ATP, który jest inhibitorem fosfofruktokinazy. Dowodzi to
istnienia w grzybni alternatywnej tlenowej drogi oddechowej, jałowej energetycznie, a wiec nie blokującej glikolizy. Ten typ
oddychania tlenowego, często występujący u roślin, nie został jeszcze dokładnie zbadany u szczepów Aspergillus niger.
Wykazano natomiast jego istnienie w grzybni Neurospora crasa oraz u drożdży z rodzajów Candida i Rhodotorula, najczęściej
podczas przejścia z fazy logarytmicznego wzrostu do fazy stacjonarnej. Alternatywna droga oddechowa ujawnia sie w
momencie osłabienia oddychania z udziałem oksydazy cytochromowej, wtedy indukowana jest synteza oksydazy
alternatywnej, układu enzymatycznego katalizującego przenoszenie elektronów na tlen.
Indukcje tej oksydazy w komórkach grzybni może wywoład:
nagromadzenie sie NADH,
zmniejszenie zapotrzebowania na ATP,
niedobór ADP w mitochondriach,
niedobór jonów Cu+2 niezbędnych do funkcjonowania oksydazy cytochromowej.
Wymienione czynniki sprawiają, ze cytoplazmatyczny koenzym NADH powstający w procesie glikolizy jest utleniany z
udziałem oksydazy alternatywnej szlakiem, w którym energia nie wydziela sie w postaci ATP, lecz energii cieplnej. Mechanizm
ten uruchamia sie przy rozkojarzeniu fosforylacji oksydatywnej. Oksydaza alternatywnego oddychania cechuje sie, w
odróżnieniu od oksydazy cytochromowej, niskim powinowactwem do tlenu. Oznacza to, ze działalnośd tego enzymu wymaga
znacznie wyższego stężenia tlenu w środowisku niż droga cytochromowa. Badania wykazały, ze dopiero stężenie tlenu
powyżej 21% powoduje wzrost aktywności oddychania alternatywnego. We wgłębnym procesie otrzymywania kwasu
cytrynowego, w fazie produkcji przy intensywnym napowietrzaniu, może byd wiec wzbudzana ta droga oddechowa.
Zakłócenie procesu wynikające z braku dopływu tlenu może spowodowad utratę tej aktywności i przywrócenie oddychania z
udziałem oksydazy cytochromowej. Efektem tych zmian jest zahamowanie syntezy kwasu cytrynowego na korzyśd produkcji
biomasy. Takie zjawisko obserwuje sie podczas awarii systemu natleniania w przemysłowej produkcji kwasu cytrynowego
metodą wgłębną. Do poznanych innych mechanizmów regulujących syntezę kwasu cytrynowego należy osłabienie przemian
enzymatycznych w cyklu Krebsa na etapach:
2+
2+
hydratazy akonitanowej (hamowanej deficytem jonów Mn i Fe ),
mitochondrialnej dehydrogenazy izocytrynianowej (hamowanej cytrynianem),
+
dehydrogenazy 2-ketoglutaranowej (hamowanej wysokim stężeniem cukru i jonami NH4 ).
Biosynteza kwasu cytrynowego u Aspergillus niger związana jest także z cyklem kwasów dikarboksylowych - glioksalowym
(rys. 1). Cykl ten przez reakcje anaplerotyczne (uzupełniające) dostarcza kwasu szczawiowego, który jest prekursorem kwasu
cytrynowego.
Wykonanie dwiczenia (cz. 1)
1. Przygotowanie podłoża
1.1. Podłoże inokulacyjne
3
3
W kolbie o pojemności 250-300 cm przygotowad 50 cm podłoża inokulacyjnego zawierającego:
glicerol - 50,0 g
glukoza - 50,0 g
ekstrakt drożdżowy – 3,0 g
ekstrakt słodowy – 3,0 g
bactopepton - 5,0 g
3
woda – 1000 cm
Składniki przeliczyd tak aby otrzymad wymaganą ilośd podłoża inokulacyjnego. Doprowadzid pH do wartości 5,5. Podłoże
przygotowad do sterylizacji w autoklawie.
1.2. Podłoże produkcyjne
3
3
W kolbie 250-300 cm przygotowad 100 cm podłoża produkcyjnego o składzie:
glicerol – 100,0 g
NH4Cl – 3,0 g
MgSO4 ·7H2O – 1,0 g
KH2PO4 – 0,2 g
ekstrakt drożdżowy – 1,0 g
3
woda – 1000 cm
2.
Składniki przeliczyd tak aby otrzymad wymaganą ilośd podłoża produkcyjnego. Doprowadzid pH do wartości 5,5. Podłoże
przygotowad do sterylizacji w autoklawie.
Posiew Candida lipolytica
Wyjałowione podłoże inokulacyjne zaszczepid hodowlą drożdży C. lipolytica. Hodowle prowadzid na wytrząsarce
0
rotacyjnej, w warunkach tlenowych w temperaturze 30 C.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Laboratorium – biotechnologia ogólna – dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.3
PRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO
Wyjałowione podłoże produkcyjne zaszczepid 5 ml zawiesiny komórek drożdży namnożonych w hodowli inokulacyjnej.
0
Hodowle prowadzid na wytrząsarce rotacyjnej, w warunkach tlenowych w temperaturze 30 C.
Wykonanie dwiczenia (cz. 2)
3. Oznaczanie kwasowości ogólnej
Kwasowośd ogólna jest to suma wszystkich kwasów organicznych, jakie tworzą się podczas fermentacji cytrynowej,
wśród których najwięcej powstaje kwasu cytrynowego (ponad 90%), reszta to głównie kwas szczawiowy i glukonowy.
Wykonanie:
Pobrad 20ml płynu pohodowlanego z hodowli produkcyjnej i przefiltrowad w zestawie do filtracji próżniowej używając
sączków celulozowych o rozmiarach porów 0,45 µm. Następnie 2ml filtratu przenieśd do kolby stożkowej o pojemności
3
50 cm . Dodad 20ml wody destylowanej i miareczkowad 0,1 N NaOH wobec fenoloftaleiny (3-4 krople) do pierwszego
trwałego różowego zabarwienia.
3
3
Wynik podad w cm 0,1 N NaOH/100 cm pożywki.
3
Aktywna kultura powinna wykazywad kwasowośd ogólną odpowiadającą 30 – 40 cm 0,1 N NaOH na 2ml roztworu
3
3
(wymagania normatywne mieszczą się w granicach 20 – 25 cm 0,1 N NaOH na 2 cm roztworu).
3
Wyliczyd ilośd wytworzonego kwasu cytrynowego wiedząc, że 1 cm 0,1 N NaOH odpowiada 7 mg kwasu cytrynowego
jednowodnego lub 6,4 mg bezwodnego.
4. Kolorymetryczna metoda oznaczania kwasu cytrynowego (metoda Furtha-Herrmanna)
Metoda kolorymetrycznego oznaczania kwasu cytrynowego polega na specyficznej i bardzo czułej reakcji zachodzącej
pomiędzy stosowanymi odczynnikami: bezwodnikiem kwasu octowego, pirydyną i kwasem cytrynowym. W wyniku
reakcji w badanym roztworze powstaje barwny kompleks, którego zabarwienie, zmieniające się od żółtego do brązowego
zależy od stężenia kwasu cytrynowego. Dokładnośd metody wynosi ok. 3,5% i zależy od szybkości dodawania ściśle
określonych objętości odczynników oraz temperatury, która podczas oznaczania powinna byd utrzymywana na stałym
3
poziomie 32ºC przez 30 minut. Stężenie kwasu cytrynowego w 1 cm powinno zawierad się w granicach 0,1 – 0,5 mg.
4.1. Sporządzanie roztworów wzorcowych do wykreślenia krzywej wzorcowej
Roztwór barwny (A)
3
do cylindra miarowego o objętości 100 cm wprowadzid 10ml podłoża produkcyjnego (wyjałowionego, nie
3
3
3
zawierającego komórek drożdży) i uzupełnid wodą destylowaną do 100 cm (1 cm roztworu zawiera 0,1 cm
wyjściowego roztworu pożywki syntetycznej).
Roztwór (B)
3
3
W kolbie miarowej o objętości 500 cm rozpuścid 2,5 g kwasu cytrynowego w 500ml wody destylowanej (1 cm
roztworu zawiera 5 mg kwasu cytrynowego).
3
Do zestawu kolbek miarowych (6x50 cm ) dodad 2ml roztworu barwnego (A) oraz odpowiednią ilośd roztworu B (tabela
1). Dopełnid do kreski wodą destylowaną.
TABELA 1. Roztwory wzorcowe kwasu cytrynowego
3
Lp. 50 cm roztworu wzorcowego zawiera
Uwagi
3
3
3
Roztwór A *cm ]
Roztwór B *cm ]
Woda dest. [cm ]
1
2
3
4
5
6
2
2
2
2
2
2
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
48,0
47,0
46,0
45,0
44,0
43,0
Próba ślepa = 0 mg kwasu cytr.
3
1 cm = 0,10 mg kw. cytr.
3
1 cm = 0,20 mg kw. cytr.
3
1 cm = 0,30 mg kw. cytr.
3
1 cm = 0,40 mg kw. cytr.
3
1 cm = 0,50 mg kw. cytr.
5. Wykonanie oznaczeo do krzywej wzorcowej
Do 6 probówek szklanych przenieśd po 1ml kolejnych roztworów wzorcowych, dodad najpierw 1,3ml pirydyny, a
0
następnie 5,7ml bezwodnika kwasu octowego, szybko wymieszad (vortex) i wstawid na 30 min. do wody o temp. 30 C.
Pomiar absorbancji wykonad w ciągu 30 minut od wyjęcia próbek z łaźni, przy długości fali 420 nm. Średnie wyniki z
trzech powtórzeo pomiarów absorbancji dla każdego ze stężeo kwasu cytrynowego użyd do wykreślenia krzywej
wzorcowej.
6. Oznaczenie kwasu cytrynowego w płynie pohodowlanym
3
Pobrad 2 ml przefiltrowanego płynu pohodowlanego z hodowli produkcyjnej do kolby miarowej o pojemności 500 cm i
uzupełnid wodą destylowaną do kreski. Całośd wymieszad. Przenieśd 1 ml roztworu do szklanej probówki i dalej
postępowad jak w punkcie powyżej.
Stężenie kwasu cytrynowego w hodowli odczytad z wykresu krzywej wzorcowej.
7. Pomiar absorbancji
przed rozpoczęciem pomiaru należy otworzyd pokrywę spektrofotometru – urządzenie nagrzewa się 15 minut!!!
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Laboratorium – biotechnologia ogólna – dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.3
PRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO
-
po 15 minutach za pomocą pipety automatycznej wypełniamy szklaną kuwetę w 2/3 objętości roztworem wzorcowym –
próba ślepa (0g kw. cytrynowego)
trzymając kuwetę staramy się nie dotykad przeźroczystych ścianek naczynia !!!
w celu dokonania pomiaru naciskamy przycisk A, wpisujemy długośd fali (420 nm), potwierdzamy naciskając A i
umieszczamy kuwetę w urządzeniu, po chwili odczytujemy wynik absorbancji dla próby kontrolnej
pomiar powtarzamy 3 razy, za każdym razem wyciągając i ponownie wkładając kuwetę (urządzenie reaguje na nacisk
wywołany ciężarem kuwety) – nie naciskamy żadnych przycisków !!!
wynik koocowy podajemy jako średnią trzech pomiarów
analogiczne pomiary wykonujemy dla kolejnych stężeo kw. cytrynowego, po każdym pomiarze dokładnie płuczemy
kuwetę wodą destylowana i delikatnie suszymy w bibule
podobnie wykonujemy oznaczenie kw. cytrynowego w płynie pohodowlanym
po pomiarach kuwety dokładnie płuczemy wodą destylowaną i pozostawiamy do wysuszenia na bibule
urządzenie wyłączamy zamykając pokrywę spektrofotometru
8. Opracowanie wyników
Wyniki pomiarów przestawid w formie sprawozdania (opis makroskopowy grzybni, zawartośd kw. cytrynowego,
kwasowośd ogólna). Wyciągnąd wnioski z uzyskanych wyników.
9. Zagadnienia teoretyczne:
metody otrzymywania kwasu cytrynowego i jego wydzielanie z podłoża hodowlanego
mikroorganizmy produkujące kwas cytrynowy
uwarunkowania produkcji kwasu cytrynowego u Aspergillus niger
przykłady zastosowania kwasu cytrynowego
11. Literatura
Kowal K., Libudzisz Z.; Mikrobiologia techniczna; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000
Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 1998
Schlegel H.; Mikrobiologia ogólna; Wyd. PWN; Warszawa; 2000
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba