2. Iwona Markowska-Daniel - Państwowy Instytut Weterynaryjny

Afrykański pomór świń
diagnostyka laboratoryjna
znaczenie, możliwości i ograniczenia
Prof. dr hab. Iwona Markowska-Daniel
Krajowe Laboratorium Referencyjne w zakresie ASF
Zakład Chorób Świń
PIWet - PIB
Puławy, 26.03.2014 r.
Cel postępowania diagnostycznego
Postawienie rozpoznania
(ustalenie przyczyny problemu zdrowotnego)
BADANIE LABORATORYJNE
PODSTAWA DIAGNOZY
I ZWALCZANIA ASF
IZOLACJA WIRUSA
I SEKWENCJONOWANIE
Dwa wymiary badań
MIEJSCE
CZAS
2010-2011
2009
2011
20082011
2009- 2010
2010
2008
2008
Skąd zawleczono ASFV? Kiedy doszło do zakażenia?
Czy i dokąd przeniesiono?
Jak długo trwa?
Epidemiologia molekularna
Badania wirusologiczne
i serologiczne
Czynniki determinujące
postawienie prawidłowego rozpoznania:
 Wywiad (zebranie właściwych informacji);
 Badanie kliniczne (bardzo istotny element
wczesnego rozpoznania
termometr - ważne narzędzie);
 Badanie sekcyjne
(sekcjonować kilka zw., najpierw padłe);
Badanie laboratoryjne
zaczyna się już w chlewni !!!
Uwaga na dobór i pobór próbek
dobór próbek
jest zwykle nieodwracalny
WŁAŚCIWE POBRANIE
I PRZESŁANIE MATERIAŁU
WARUNKIEM SUKCESU
W BADANIU LABORATORYJNYM
Czynniki determinujące
postawienie prawidłowego rozpoznania:
 Pobranie właściwych próbek do badań:
(wartościowych epidemiologicznie, reprezentatywnych)
 rodzaj,
 liczba,
 czas od zakażenia do próbkobrania.
Jaki
materiał należy pobrać ?
3-5 ml
Materiał - przyżyciowo
 z dodatkiem EDTA,
gdy chodzi o wykrycie
obecności wirusa we krwi
(okres wiremii)
(dodatek heparyny utrudnia
reakcję PCR)
 bez dodatku EDTA,
gdy chodzi o wykrycie
obecności swoistych
dla ASFV przeciwciał.
Materiał - pośmiertnie
 śledzionę, migdałki, nerki,
węzły chłonne,
 w przypadku nietypowego
przebiegu choroby:
płuca lub szpik kostny.
 Próbki należy pobrać od
zwierząt poddanych
eutanazji (bezkrwawo)
w szczytowej fazie choroby.
Przykładowe błędy:
- przesyłanie:
całych zwłok zwierząt;
całej kończyny;
tylko kości od dzików odstrzelonych;
tkanek + kości;
niewłaściwych tkanek – tzn. wyłącznie
wątroby, żołądka, jelit, serca;
 krtani/ślinianek/węzłów chłonnych
ZAMIAST migdałków





Próbki powinny być tak zapakowane,
aby wykluczyć ich wylanie
strata materiału do badań; nieczytelność numerów
próbek, zniszczenie pisma przewodniego
jeden narząd/jeden pojemnik !
Nie przesyłać krwi
w tzw. igło-probówkach !
Przykładowe błędy:
- przesyłanie:
 krwi w słoikach;
 krwi w niezakręcanych probówkach;
 wielu próbek w 1 opakowaniu zbiorczym;
Protokół pobrania próbek
przykładowe błędy:
 brak zgodności z zawartością przesyłki;
 brak/błędy w identyfikacji próbek;
 brak wyszczególnienia narządów
(autoliza) – trudność w identyfikacji.
CZAS !!
Pakowanie materiału
Transport
przykładowe błędy:
 zamrażanie próbek krwi prowadzi do
hemolizy - wpływ na jakość próbki = wynik
badania;
 przesyłanie próbek
w piątek, popołudniu,
zwłaszcza od dzików
odstrzelonych.
Procedura
POBIERANIA I PRZESYŁANIA PRÓBEK
DO LABORATORYJNYCH BADAŃ DIAGNOSTYCZNYCH
W KIERUNKU AFRYKAŃSKIEGO POMORU ŚWIŃ
OPRACOWAŁ(A):
SPRAWDZIŁ(A):
strona: 1 stron: 9
Edycja 1
Wersja 1
Obowiązuje od dnia:
ZATWIERDZIŁ(A):
Prof. dr hab. Iwona Markowska-Daniel
Prof. dr hab. Zygmunt Pejsak
Dr Janusz związek
Data i podpis
Data i podpis
Data i podpis
Niniejszy dokument został opracowany przez Krajowe Laboratorium Referencyjne ds. Afrykańskiego pomoru świń
Dokument jest przeznaczony dla Inspekcji Weterynaryjnej
Najważniejsze fakty istotne w diagnostyce ASF
 Brak szczepionek
obecność przeciwciał = zakażenie
 Brak przeciwciał neutralizujących wirusa
długotrwała wiremia (od 2 DPZ do końca życia)
 Wczesna odpowiedź humoralna
(obecność IgM od 4 DPZ, IgG od 8-10 DPZ)
Diagnostyka laboratoryjna
Nie jest możliwe
właściwe
wykorzystywanie laboratorium
bez znajomości
testów diagnostycznych
Diagnostyka laboratoryjna
 Brak idealnej metody
(żadna nie gwarantuje 100% czułości i swoistości)
 różne możliwości i ograniczenia (czułość,
specyficzność, szybkość, wydajność – skala,
łatwość wykonania, interpretacja wyniku, koszt);
 różne zastosowanie (podejrzenie/monitoring;
stado/badanie indywidualne)
Konieczność stosowania min.2 metod lab.
Techniki
TECHNIKA
LABORATORYJNA
Immunofluorescencja (DIF)
Chromatografia („pen-side”)
ELISA
IB
IPT
IIF
PCR
sekwencjonowanie
bezpośrednie
ELISA antygenowa
pośrednie
Izolacja i identyfikacja
CO WYKRYWAMY?
żywe wirusy
antygeny (białka) wirusowe
Przeciwciała
materiał genetyczny (DNA)
sekwencję nukleotydów
w analizowanym fragmencie genu
Izolacja - hodowle komórkowe
Identyfikacja - test hemadsorbcji
 nie wszystkie szczepy HA
 długi czas badania
 brak możliwości badań na dużą
skalę
 wymaga doświadczonego
 „złoty” standard
 czułość i specyficzność
personelu i dobrze
wyposażonego laboratorium
 test indywidualny
Czas badania: kilkanaście dni
ELISA do wykrywania antygenu
 szybkość
 łatwość wykonania
 duża skala badań/
badanie stada
 cena
 niska czułość (wynik + gdy dużo ASFV)
 konieczność badań potwierdzających
Czas badania – kilka godzin
Identyfikacja - IF
 szybkość
 czułość i specyficzność
 wykrywanie szczepów nie HA
 cena
 subiektywność wyniku
 wymaga doświadczonego personelu
 brak możliwości badań na dużą skalę
Czas badania – kilka godzin
Szybkie „pen-side” testy
(chromatografia)
 szybkość
 łatwość wykonania
 duża skala badań/
badanie stada
 konieczność badań potwierdzających
Czas badania – kilka minut
Badania serologiczne
 Bardzo duże znaczenie
(brak szczepionki, wczesna serokonwersja)
Pozwalają na:
 ustalenie (przybliżone) statusu immunologicznego
(stwierdzenie obecności Ig wskazuje na kontakt
z wirusem);
 ustalenie (przybliżone) czasu zakażenia,
 monitorowanie szerzenia się choroby.
 Surowice: świeże, schłodzone, zamrożone
 Krew - wirowanie
ELISA
Czas trwania badania ~ 3 - 4 godz.
Ok. 5% wyników fałszywie dodatnich
Zła jakość próbek surowic (krwi)
od dzików
wyniki niespecyficzne
W 2014 r. :
83 fałszywie +/ +/-
+
+/-
+
+/- +/- 0,5501-0,3501 X=0,55415
Badania próbek
w 2 powtórzeniach!
???
1.
2.
3.
4.
5.
???
P/13/10002/6
P/13/10003/13
P/13/10003/18
P/13/10173/2
P/13/10173/3
X
ELISA
najbardziej powszechne zastosowanie
 szybkość
 łatwość wykonania
 duża skala badań/ badanie stada
 cena
 ograniczona specyficzność (dziki)
 konieczność badań potwierdzających
Test immunoblotting (IB)
Czas trwania badania ~ 3 - 4 godz.
IB
 wysoka czułość i specyficzność
 szybkość
 łatwość wykonania
 brak zestawów komercyjnych
 mała skala badania
 subiektywizm w ocenie wyniku
(doświadczenie w interpretacji)
Test immunoperoksydazowy (IPT)
 wysoka czułość
i specyficzność
 szybkość
 łatwość wykonania
 brak zestawów komercyjnych
 subiektywizm w ocenie wyniku
Czas trwania badania – kilka godz.
Rekomendacja: PCR i genotypowanie
Izolacja
DNA
Amplifikacja DNA (PCR)
Czas trwania badania ~ 3 - 6 godz.
(zależnie od rodzaju próbki - krew, tkanki)
Brak zestawów komercyjnych dopuszczonych do stosowania
Amplifikacja DNA (RT PCR)
Fernandez-Pinero J. et al. 2012;
FastStart Universal Probe Master Kit (Roche)
King DP et al. 2003; (Qiagen)
PCR
najbardziej powszechne zastosowanie
 szybkość
 czułość i specyficzność
wykrywa nawet fragmenty
genomu
 przydatność do badania
wielu matryc
oraz materiału nieświeżego
 badania na b. dużą skalę
 czułość
laboratorium
zanieczyszczone DNA =
wyniki fałszywie (+)
 specyficzność
niewłaściwie dobrane
startery =
wyniki fałszywie (-)
Zagrożenia związane z badaniami
laboratoryjnymi
 Krew/surowica
materiał potencjalnie wysoce zakaźny;
 Ryzyko rozwleczenia wirusa wraz
z transportem próbek;
 Ryzyko „ucieczki” wirusa z laboratorium
Środki
ostrożności
Państwowy Instytut Weterynaryjny
Państwowy Instytut Badawczy
w Puławach
www.piwet.pulawy.pl
KLR w zakresie ASF
8.02 - 1.03.2011 r.
5 powiatów woj. W-M
Gatunek
Badanie
Świnie
liczba
próbek
+
Molekularne
(PCR)
12
Serologiczne
(ELISA)
Ogółem
liczba wykonanych badań
Dziki
wynik
wynik
-
liczba
próbek
+
0
12
80
0
80
232
0
232
8
0
8
244
0
244
88
0
88
244
0
244
88
0
88
-
Ogółem
liczba przebadanych
zwierząt
∑= 322
1.01. - 31.12.2012 r.
Gatunek
Badanie
Świnie
liczba
próbek
+
Molekularne
(PCR)
208
Serologiczne
(ELISA)
Ogółem
liczba wykonanych badań
Dziki
wynik
wynik
-
liczba
próbek
+
0
208
1282
0
1282
12
0
12
1247
0
1247
220
0
220
2529
0
2529
208
0
208
1282
0
1282
-
Ogółem
liczba przebadanych
zwierząt
∑= 3507 próbek – 1490 zwierząt
1.01.- 31.12.2013 r.
Gatunek
Świnie
Badanie
liczba
próbek
+
Molekularne
(PCR)
1672
Serologiczne
(ELISA)
Ogółem
liczba wykonanych badań
Dziki
wynik
wynik
-
liczba
próbek
+
0
1672
11693
0
11693
191
0
191
824
0
824
1863
0
1863
12517
0
12517
1672
0
1672
11693
0
11693
-
Ogółem
liczba przebadanych
zwierząt
∑= 15821 próbek – 13318 zwierząt
Próbki badane testem PCR w 2013 r.
9203
10000
DZIKI
9000
ŚWINIE
8000
7000
6000
5000
4000
3000
144
37 1
3
0
Kość długa
582
Mostek
Płuca
Węzły
chłonne
200
Wątroba
452
401
142
Migdałki
Nerka
Surowica
Krew
481
61
Śledziona
329 276
1000
0
942
857
691
2000
7
∑= 15821, w tym od 70 padłych dzików
1
1.01. - 23.03.2014 r.
Gatunek
Świnie
Badanie
Molekularne
Serologiczne
liczba
próbek
Dziki
wynik
+
-
747
0
747
676
0
1423
747
liczba
próbek
wynik
+
-
4616
2
4614
676
1419
1
0
1423
6035
0
747
4616
Świniodziki
wynik
liczba
próbek
+
-
1
0
1
1418
1
0
1
3
6032
2
0
2
2
4614
1
0
1
Ogółem
Liczba wykonanych
badań
Ogółem
Liczba przebadanych
zwierząt
∑= 11156 próbek – 5363 zwierzęta
Od 14.02 zbadano 708 świń i 1665 dzików - wszystkie ujemne
Próbki badane testem PCR od 1.01 do 23 .03. 2014 r.
3769
4000
DZIKI
3500
ŚWINIE
3000
ŚWINIODZIKI
2500
2000
1500
730
714
655
585
1000
1
500
52 1 0
9 0
6 0
135
5 1
198
6 0
8 0
7 0 0
74 4 0
Kość
Mostek
Płuco
Węzły chłonne
Migdałki
Śledziona
Nerki
Surowica
Krew
0
W 2014 r. zbadano 11.156 próbek,
w tym od 267 padłych dzików (35 z woj. podlaskiego)
Pierwszy przypadek ASF w Polsce (PCR+)
Drugi przypadek ASF w Polsce (PCR+)
Genotyp II
100% homologii
z ASFV
z Litwy
i Białorusi
17.02.2014 r.
Badania serologiczne 5 świń z gospodarstwa
w Grzybowszczyźnie
Wszystkie wyniki ujemne
23.02.2014 r.
Badanie serologiczne 623 świń ze 118
gospodarstw z 57 miejscowości
z woj. podlaskiego
Wszystkie wyniki ujemne
Liczba zwierząt przebadanych w poszczególnych woj.
w latach 2011-2014
(stan na dzień 23.03.2014 r.)
Województwa
2011
świnie
dziki
2012
świnie
2013
dziki
Dolnośląskie
Kujawsko-Pomorskie
189
Lubelskie
179
świnie
dziki
1
1001
49
287
737
3241
Lubuskie
15
Łódzkie
Małopolskie
4
Mazowieckie
1
160
2014 (1.01-23.03)
świnie
dziki
dziki
1
1063
11
56
60
343
70
2027
996
18
87
65
86
47
2
29
5447
15
152
137
162
1082
312
1
Podkarpackie
2
301
112
897
5
190
119
1388
Podlaskie
8
140
327
1835
640
1350
975
3325
Pomorskie
49
449
64
49
513
Śląskie
15
140
52
15
192
35
18
102
1176
95
355
2016
105
879
122
124
1001
Świętokrzyskie
Warmińsko-Mazurskie
244
88
9
657
Wielkopolskie
Zachodniopomorskie
Razem
19
274
244
88
208
1282
1672
11693
4616
RAZEM = 20 551 ZWIERZĄT
1
53
9
747
świniodziki
372
412
283
Opolskie
świnie
62
354
669
świniodziki
2011-2014
283
1
2871
17679
1
www.piwet.pulawy.pl
Podsumowanie:
Diagnostyka laboratoryjna prowadzona
w kompetentnym laboratorium jest podstawą
monitorowania sytuacji i zwalczania ASF.
Jakość materiału determinuje wiarygodność
wyniku badania.
Nie ma idealnej metody, dlatego niezbędne
jest dysponowanie technikami alternatywnymi.
W przyszłości planuje się poszerzenie badań
diagnostycznych o nowe matryce
(płyn ustny i sok mięśniowy).
Obiecującym narzędziem wczesnej diagnostyki ASF są „pen-side” testy.
W Europie
od zakażenia
do rozpoznania choroby w terenie
1-3 m-cy !!!
w laboratorium - kilka (naście) godz.
Rozpoznanie:
w ciągu tygodnia - koszt 2 mln Euro
w ciągu 2 tygodni - 22 mln Euro
Dziękuję za uwagę