Oznaczanie aktywności właściwej PLE

Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 3
Rok akad. 2011/2012
Oznaczanie aktywności właściwej PLE
W reakcjach biotransformacji najczęściej wykorzystuje się preparaty enzymatyczne będące
mieszaninami różnych białek i substancji balastowych. Izolacja enzymu w postaci homogenicznej
z materiału biologicznego wiąże się z dużym nakładem pracy i wysokimi kosztami. Dlatego też ilość
enzymu w preparacie określa się na podstawie szybkości reakcji, którą on katalizuje a nie poprzez jego
masę. W określonych warunkach szybkość ta jest proporcjonalna do stężenia enzymu i można
przedstawić ją w jednostkach definiowanych jako taką ilość enzymu, która wywołuje określoną
szybkość reakcji (zwykle określoną przez ubytek substratu lub pojawienie się produktu).
Złożoność procesów enzymatycznych powoduje często, że szybkość reakcji nie zawsze jest
proporcjonalna do ilości enzymu w preparacie. Dlatego też najczęściej ocenia się bezpośrednio nie
stężenie enzymu, ale jego aktywność w badanych warunkach. Uzyskane wyniki można interpretować
ilościowo tylko z pewnymi zastrzeżeniami. Szybkość reakcji enzymatycznej jest funkcją wielu
czynników fizycznych i chemicznych, które mogą powodować przyspieszenie lub zahamowanie
reakcji (np. stopniowa inaktywacja enzymu czy inhibicja). Dodatkowo musimy brać pod uwagę fakt,
że rozważamy procesy odwracalne, w których wraz ze wzrostem stężenia produktów rośnie prędkość
reakcji w kierunku przeciwnym powodując zahamowanie właściwej przemiany. Najbezpieczniej jest
więc mierzyć początkową szybkość reakcji lub pomiary prowadzić w warunkach, kiedy szybkość
reakcji jest stała i niezależna od stężenia substratu, czyli przebiega wg kinetyki zerowego rzędu.
Rys 1. Zależność szybkości reakcji od stężenia substratu wg Michaelisa-Menten
1/7
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 3
Rok akad. 2011/2012
Realizację tego założenia osiąga się stosując odpowiednio wysokie stężenie substratu, które powoduje
całkowite wysycenie enzymu. Niezbędną do tego celu ilość substratu można oszacować na podstawie
wartości stałej Michaelisa-Menten (Km). Jeżeli stężenie substratu jest bliskie wartości Km lub mniejsze,
to reakcje enzymatyczne są reakcjami I rzędu. Szybkość reakcji nie jest wtedy proporcjonalna do ilości
enzymu, ponieważ zależy też od stężenia substratu (Rys 1). Z definicji tej stałej wynika, że szybkość
reakcji przy stężeniu substratu bliskiemu Km stanowi 50% szybkości maksymalnej, przy stężeniu
równym 10*Km – 90%, natomiast stężenie 100*Km zapewnia reakcję wg kinetyki zerowego rzędu,
w której szybkość jest w dość szerokim zakresie proporcjonalna do ilości enzymu (Rys 1).
Enzymy wykazują największą aktywność w optymalnych dla każdego z nich warunkach
temperatury i pH, a odchylenia od tych wartości mogą znacznie zmieniać przebieg reakcji. Związane
jest to ze zmianami energii aktywacji cząsteczek substratów oraz zmianami konformacyjnymi
wynikającymi z wpływu pH na stopień dysocjacji reszt aminokwasów, z których zbudowane jest
białko. Optymalne pH utrzymuje się za pomocą buforów, należy jednak pamiętać, że skład roztworu
może mieć wpływ na aktywność enzymu. Porównywanie wyników reakcji prowadzonych w różnych
buforach nie zawsze jest wiarygodne. Oznaczając aktywność danego enzymu konieczne jest zatem
równoczesne uściślenie stężenia substratu, temperatury pomiaru, rodzaju buforu i jego pH.
Ważnym punktem w określaniu aktywności enzymów jest wybór odpowiedniej metody
analitycznej. Do większości katalizowanych enzymatycznie reakcji można zastosować bezpośredni
pomiar zmian stężeń produktów lub substratów stosując klasyczne metody chemii analitycznej, czyli
analizę miareczkową, kolorymetrię, spektrofotometrię, chromatografię, ale także metody fizyczne,
np. pomiary lepkości, zmętnienia, polarymetrię. Jednak niektóre enzymy wymagają pośredniej
metody oznaczenia aktywności, najczęściej przez dodanie reagentów, które nie są substratami dla
enzymu, a są niezbędne do wizualizacji efektu reakcji.
Jedną z najbardziej popularnych metod bezpośrednich jest metoda spektrofotometryczna oparta
na pomiarach absorbancji przy długości fali 340 nm charakterystycznej dla zredukowanego koenzymu
NAD(P)H biorącego udział w wielu reakcjach enzymatycznych. Forma utleniona NAD(P) przy tej
długości fali nie pochłania promieniowania. Jako przykład może posłużyć oznaczenie
Rys 2. Redukcja pirogronianu katalizowana przez dehydrogenazę mleczanową
2/7
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 3
Rok akad. 2011/2012
aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH), enzymu którego poziom jest wskaźnikiem przy
diagnozowaniu np. zawału serca (Rys 2.).
Bardzo popularnym podejściem jest zastosowanie jednego lub kilku dodatkowych enzymów
katalizujących reakcję jednego z produktów do związku, który może być oznaczony. Także w tym
przypadku często stosuje się koenzymy nikotynoadeninowe. Na przykład aktywność heksokinazy
może zostać oznaczona dzięki sprzężeniu reakcji fosforylacji glukozy z reakcją utlenienia 6-fosforanu
glukozy katalizowanej przez dehydrogenazę 6-fosforanu glukozy (Rys 3).
Rys 3. Metoda oznaczenia aktywności heksokinazy
Szybkość reakcji mierzona ilością przereagowanego związku (ubytek substratu lub pojawienie się
produktu) w jednostce czasu w przeliczeniu na określoną ilość preparatu enzymatycznego lub
badanego materiału jest miarą aktywności enzymu. Natomiast jednostki, w których wyraża się tę
aktywność często są umowne i porównywanie wyników uzyskanych różnymi metodami bywa
problematyczne. Konieczne było więc wprowadzenie bezwzględnej międzynarodowej jednostki
standardowej (U) aktywności enzymów i dokładne określenie warunków standardowego oznaczenia.
Jednostką (U) każdego enzymu jest taka jego ilość, która katalizuje przemianę 1 µmola substratu (lub 1
µmola
odpowiednich
grup
chemicznych)
w
ciągu
1
min,
w
temp.
30oC
i w optymalnych warunkach (pH i stężenia substratu). Tak zdefiniowane wartości aktywności różnych
(ale podobnych) enzymów można ze sobą porównywać.
Podstawową wielkością charakteryzującą aktywność enzymatyczną bezpośrednio związaną
z czystością preparatu enzymatycznego jest aktywność właściwa. Definiuje się ją jako liczbę
jednostek enzymu na 1 mg białka. Zwykle stężenie enzymu podaje się w jednostkach na 1ml roztworu
lub 1mg preparatu, chociaż można też stosować jednostki większe (1000ml lub g). Przy
porównywaniu aktywności oprócz stałości warunków ważne jest, aby porównywane aktywności
obliczane były dla reakcji tego samego substratu, tzn. np. aktywność właściwa PLE będzie inna dla
maślanu p-nitrofenylu i inna dla laurynianu p-nitrofenylu.
W użyciu znajduje się także jednostka katal (kat), oznaczająca taką ilość enzymu, która
katalizuje przemianę 1 mola substratu w ciągu 1 sekundy, w optymalnych warunkach. Relacja między
jednostką aktywności a katalem jest następująca: 1U = 16,7 nkat. Aktywność molekularna (liczba
obrotów) jest to liczba jednostek na 1 µmol enzymu i może zostać wyznaczona tylko w przypadku,
kiedy znana jest masa cząsteczkowa enzymu.
3/7
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 3
Rok akad. 2011/2012
Metody oznaczania aktywności PLE
Aktywność preparatów PLE określa się na podstawie bezpośredniego pomiaru szybkości reakcji
hydrolizy estrów. Najczęściej wykorzystuje się następujące metody:
a) hydroliza octanu n-butylu
O
+
O
O
PLE
H2O
+
OH
OH
bufor pH 7,20
aceton
W wyniku hydrolizy octanu n-butylu powstają równomolowe ilości butanolu i kwasu octowego,
który powoduje obniżenie pH środowiska reakcji. Zmiany te można obserwować na pH-metrze.
Odmiareczkowując powstały kwas 0,1 M roztworem wodorotlenku sodu, można sporządzić wykres
zależności ilości (µmol) dodanego NaOH od czasu reakcji [min]. Wartość aktywności właściwej
wyznacza się z nachylenia prostoliniowego fragmentu wykresu (tgα).
b) hydroliza maślanu p-nitrofenylu
O
O
N
O
+
OH
PLE
H2O
O
bufor pH 7,20
acetonitryl
O
O
+
N
OH
O
Aktywność hydrolityczną wyznacza się spektrofotometrycznie. Maślan p-nitrofenylu hydrolizuje
pod wpływem enzymu do kwasu masłowego i p-nitrofenolu, którego stężenie wyznacza się przy
długości fali 410 nm na podstawie krzywej wzorcowej. Wartość aktywności właściwej określa się
z nachylenia prostoliniowego fragmentu wykresu funkcji ilości p-nitrofenolu [µmol] w zależności od
czasu [min].
Współczynnik oczyszczania enzymów
Często w oczyszczaniu enzymów nie wystarcza zastosowanie jednej metody i zachodzi potrzeba
zaangażowania różnych chemicznych i fizycznych procesów frakcjonujących. Każdy etap ma za
zadanie usunięcie możliwie najwięcej innych zanieczyszczeń białkowych. Wydajność każdego etapu
jest wyrażona liczbą określającą, jaki procent ogólnej wyjściowej aktywności enzymatycznej
został odzyskany na danym etapie oczyszczania, a stopień oczyszczenia enzymu wyraża się
przez współczynnik oczyszczania, czyli stosunek aktywności w aktualnym roztworze do
aktywności w materiale wyjściowym. Oba te czynniki należy brać pod uwagę podczas procedury,
ponieważ często można uzyskać bardzo wysoki stopień oczyszczenia, niestety przy niskiej wydajności,
albo odwrotnie.
Przykładowe obliczenia: Osocze zawierało 80 mg białka/ml. W optymalnych warunkach 0,1 ml
osocza wytwarzało 0,25 µmola produktu/min. Po przeprowadzeniu adsorpcji białek z 2 l osocza na
4/7
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 3
Rok akad. 2011/2012
DEAE-Sephadex, wyeluowano je i otrzymano 240 ml roztworu o stężeniu 55 mg/ml, którego
0,05 ml wytwarzało 1 µmol produktu/min. Po dodaniu 240 ml nasyconego roztworu siarczanu
amonu wytrącony osad odwirowano i rozpuszczono w 150 ml buforu, uzyskując roztwór białka
o stężeniu 15 mg/ml. 0,05 ml tego roztworu wytwarzało 1,5 µmola produktu/min. Obliczyć procent
odzysku enzymu i współczynnik oczyszczenia enzymu na poszczególnych etapach.
Osocze zawierało:
a) U/ml = (0,25 µmol/min)/0,1 ml = 2,5 µmol/ml/min = 2,5 U/ml
b) Ogólna ilość białka w 2 l osocza = 2000 ml*80mg/ml = 160000 mg
c) Ogólna liczba jednostek w 2l osocza = (2,5 U/ml)*2000 ml = 5000 U
d) Aktywność właściwa = (2,5 U/ml)/(80 mg/ml) albo 5000U/160000 mg= 0,03125 U/mg
Roztwór po adsorpcji białek i ich wyeluowaniu zawierał:
a) U/ml = (1 µmol/min)/0,05 ml = 20 U/ml
b) Ogólna ilość białka w 240 ml roztworu = 240 ml*55 mg/ml = 13200 mg
c) Ogólna liczba jednostek w 240 ml = (20 U/ml)*240 ml = 4800 U
d) Aktywność właściwa = (20 U/ml)/(55 mg/ml) albo 4800 U/13200 mg= 0,3636 U/mg
Procent odzysku enzymu:
Ogólna liczba U w 240 ml roztworu enzymu
Ogólna liczba U w 2l osocza
⋅ 100% =
4800
⋅ 100% = 96%
5000
Współczynnik oczyszczenia enzymu:
Wspólczynnik oczyszczenia enzymu =
aktywnsc wlasciwa roztworu enzymu
aktywnosc wlasciwa osocza
=
0,3636
= 11,6
0,03125
Roztwór po wysoleniu siarczanem amonu zawierał:
a) U/ml = (1,5 µmol/min)/0,05 ml = 30 µmol/ml/min = 30 U/ml
b) Ogólna ilość białka w 150 ml roztworu = 150 ml*15mg/ml = 2250 mg
c) Ogólna liczba jednostek w 150 ml = (30 U/ml)*150 ml = 4500 U
d) Aktywność właściwa = (30 U/ml)/(15 mg/ml) albo 4500 U/2250 mg = 2 U/mg
Procent odzysku enzymu:
Ogólna liczba U w 150 ml roztworu enzymu
Ogólna liczba U w 2l osocza
⋅ 100% =
4500
⋅ 100% = 90%
5000
Współczynnik oczyszczenia enzymu:
Wspólczynnik oczyszczenia enzymu =
aktywnosc wlasciwa roztworu enzymu
aktywosc wlasciwa osocza
=
2
= 64
0,03125
5/7
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 3
Rok akad. 2011/2012
Część doświadczalna
Każda grupa ma za zadanie wyznaczyć aktywność właściwą dwóch preparatów: surowego oraz
wysolonego.
Oznaczenie aktywności właściwej preparatów PLE
Odczynniki: wzorcowe roztwory p-nitrofenolu; 20% roztwór acetonitrylu w buforze fosforanowym;
bufor fosforanowy pH 7,20; preparat PLE; 12mM roztwór maślanu p-nitrofenylu w acetonitrylu
Sprzęt: zlewka 150 ml; mieszadło magnetyczne; spektrofotometr; próbówki wirówkowe; cylinder
miarowy, pipety.
Wykonanie:
a) wyznaczenie krzywej wzorcowej dla p-nitrofenolu (pNP)
Do 10 próbówek odpipetować kolejno od 100 do 1000µl wzorcowego roztworu p-nitrofenolu
i DOPEŁNIĆ do 5 ml 20% roztworem acetonitrylu w buforze fosforanowym pH 7.2. Dokładnie
wymieszać i zmierzyć absorbancję względem 20% roztworu acetonitrylu w buforze fosforanowym
przy λ=410nm. Obliczyć stężenie p-nitrofenolu we wzorcowych roztworach (µmol/ml).
b) oznaczenie aktywności właściwej PLE surowego
Do próbówki typu Falcone o poj. 15ml odważyć 300 mg surowego PLE i dokładnie wymieszać z 4 ml
buforu pH 7.2. Odwirowywać przez 10 min (12000 obr/min). Zlać supernatant do zlewki, zmierzyć
jego objętość. 1 ml supernatantu odpipetować do kolbki miarowej na 10 ml i uzupełnić do kreski
buforem fosforanowym. Zlewkę o poj. 150 ml zawierającą 50 ml buforu fosforanowego i 12,5 ml
12mM roztworu maślanu p-nitrofenylu umieścić na mieszadle magnetycznym. Pobrać 3 ml mieszaniny
i wyzerować spektrofotometr. Szybko dodać 500µl roztworu PLE i jednocześnie uruchomić stoper.
Po ok. minucie pobrać 3 ml mieszaniny, zmierzyć absorbancję i nie wyjmując kuwety
z spektrofotometru, odczytywać co 20 sekund wartość absorbancji. Reakcję prowadzić ok. 7 min
(max. absorbancja wynika z krzywej wzorcowej pNP).
c) oznaczenie aktywności właściwej PLE wysolonego
Na podstawie oznaczonej na poprzednich ćwiczeniach zawartości białka w preparatach PLE obliczyć
ilość preparatu wysolonego potrzebną do oznaczenia aktywności, tak aby ilość białka w obu
preparatach była taka sama (może się okazać, że trzeba będzie przygotować roztwór). Preparat dodać
do zlewki zawierającej 50 ml buforu Tris i 12,5 ml 12mM roztworu próbnika w acetonitrylu i dalej
postępować tak samo jak w przypadku PLE surowego.
Opracowanie wyników:
a) Sporządzić krzywą wzorcową dla p-nitrofenolu (A=f(stężenie[µmol/ml])).
b) Sporządzić wykresy funkcji ilości uwolnionego p-nitrofenolu [µmol] w zależności od czasu
reakcji [min] (stężenie = f(czas)), pamiętając o uwzględnieniu objętości mieszaniny reakcyjnej.
6/7
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 3
Rok akad. 2011/2012
c) Obliczyć aktywności (A) korzystając z współczynników nachylenia prostoliniowych
fragmentów wykresów (tgα), pamiętając o rozcieńczeniach w [U/1mg preparatu]
d) Korzystając z wyznaczonych wcześniej zawartości białka obliczyć aktywności właściwe PLE
surowego i wysolonego [U/mg białka]
7/7