LightCycler® SeptiFast mecA Test MG

LightCycler® SeptiFast mecA Test MG
Do stosowania z urządzeniem LightCycler® 2.0
(numer seryjny 1415001 oraz numery późniejsze)
Do stosowania w diagnostyce in vitro
DO STOSOWANIA Z:
LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG
2 x 15 Tests
LightCycler® SeptiFast Kit MG
54 Tests
SeptiFast Lys Kit MG
100 Tests
SeptiFast Prep Kit MG
10 Tests
SeptiFast Software Set
REF : 04 488 814 001
REF : 04 469 046 001
REF : 04 404 432 001
REF : 04 404 459 001
REF : 04 705 220 001
PRZEZNACZENIE
Test LightCycler® SeptiFast mecA Test MG służy do amplifikacji kwasów nukleinowych in vitro oraz jest przeznaczony do detekcji
i identyfikacji DNA mecA w ludzkiej krwi z dodatkiem K-EDTA za pomocą urządzenia LightCycler® 2.0. Test ten jest używany jako pomoc
w wykrywaniu metycylinoopornych szczepów Staphylococcus aureus. Omawiany test stosuje się w odniesieniu do obrazu klinicznego,
uznanych analiz mikrobiologicznych i/lub innych wskaźników laboratoryjnych jako pomoc w postępowaniu u osób, u których podejrzewa się
zakażenie krwi MRSA.
Test wykorzystuje się u pacjentów, u których wynik badania za pomocą testu LightCycler® SeptiFast Test MG na obecność Staphylococcus
aureus jest dodatni.
PODSUMOWANIE ORAZ OPIS TESTU
Staphylococcus aureus jest jednym z najczęściej izolowanych patogenów w zakażeniach krwi (1). W wielu regionach (2) częstość
występowania metycylinoopornych szczepów szpitalnych stale zwiększa się, a narastające zagrożenie stanowią nowo pojawiające szczepy
pozaszpitalne (3). Metycylinooporność łączy się ze znamiennie większym odsetkiem zgonów w porównaniu z bakteriemią wywołaną przez
metycylinowrażliwe szczepy Staphylococcus aureus (4,5) (MSSA). Wskazywano, że metycylinooporne szczepy Staphylococcus aureus
(MRSA) w nieproporcjonalnie dużym stopniu przyczyniają do niewłaściwego leczenia empirycznego, np. na oddziałach intensywnej opieki
medycznej (6,7) oraz powodują znaczne zwiększenie kosztów leczenia (8).
Niezwykle istotne jest usprawnienie podejmowania decyzji dotyczącej wyboru antybiotyków stosowanych we wczesnym okresie choroby (9).
Test LightCycler® SeptiFast mecA Test MG stanowi dodatkowe narzędzie ułatwiające podejmowanie decyzji dotyczącej wyboru antybiotyków. Test LightCycler® SeptiFast mecA Test MG może ułatwić wczesne postawienie diagnozy i wybór odpowiedniej antybiotykoterapii.
Omawiana metoda oparta na analizie kwasu nukleinowego wykrywa gen mecA, który współodpowiada za wysoki poziom metycylinooporności.
ZASADY PROCEDURY
Test stosuje się do wykrywania DNA mecA u pacjentów, u których wynik testu LightCycler® SeptiFast Test MG na obecność Staphylococcus
aureus był dodatni. Sposób przygotowania próbki opisano w ulotce dołączonej do opakowania testu LightCycler® SeptiFast Test MG. Do
testu LightCycler® SeptiFast mecA Test MG stosuje się jednakową objętość eluatu pochodzącego z testu LightCycler® SeptiFast Test MG.
Procedura wykonania testu LightCycler® SeptiFast Test MG obejmuje przygotowanie próbki poprzez jej mechaniczną lizę i oczyszczenie
DNA. Następnie docelowy DNA jest powielany w czasie rzeczywistym przy użyciu techniki PCR w trzech równoległych reakcjach (bakterie
Gram-dodatnie, bakterie Gram-ujemne i grzyby) oraz wykrywany za pomocą swoistych sond H. Identyfikacja gatunków oraz próbek
kontrolnych jest przeprowadzana automatycznie przez oprogramowanie.
Aby uzyskać szczegółowe informacje, proszę zapoznać się z ulotką dołączoną do opakowania testu LightCycler® SeptiFast Test MG
(P/N: 04 469 046 001).
Wybór sekwencji docelowej
Jako region docelowy amplifikacji, detekcji i identyfikacji wybrano sekwencję 314 bp w genie mecA (10). Produktem genu mecA jest białko
PBP2a (lub PBP2'), które jest dodatkowym białkiem wiążącym penicyliny, występującym w ludzkich i innych szczepach Staphylococcus, tj.
S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. cohnii lub S. sciuri. Gen mecA współodpowiada za wysoki poziom metycylinooporności
szczepów wykazujących ekspresję mecA.
Geny mecA różnych gatunków bakterii Staphylococcus są bardzo konserwatywne. Dlatego na podstawie sekwencji nie można odróżnić
genów mecA różnych gatunków.
Amplifikacja PCR w czasie rzeczywistym oraz detekcja
Amplifikacja
Przed amplifikacją PCR ryzyko skażenia amplikonów można zmniejszyć, używając enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylaza). Enzym ten
rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę, ale nie niszczy łańcuchów DNA zawierających dezoksytymidynę.
Przetwarzane próbki są dodawane do mieszaniny amplifikacyjnej zawierającej polimerazę Taq aktywowaną w dużej temperaturze
w kapilarach LightCycler® (100 µl) MG, w których zachodzi amplifikacja PCR. Amplifikacja docelowego DNA oraz kontroli odczynnika (RC)
zachodzi z udziałem swoistych primerów.
1
Detekcja produktów reakcji PCR w czasie rzeczywistym za pomocą sond H
Amplikon jest wykrywany z wykorzystaniem fluorescencji, za pomocą pary sond H. Oznaczone barwnikiem fluorescencyjnym
sondy H hybrydyzują z wewnętrzną sekwencją amplifikowanego fragmentu podczas fazy hybrydyzacji cyklu amplifikacji. Urządzenie
LightCycler® 2.0 mierzy emitowaną fluorescencję w jednym z czterech różnych kanałów detekcji.
Po zakończeniu amplifikacji przeprowadzana jest analiza krzywej topnienia. Temperatura topnienia TM zależy od długości, sekwencji i stopnia
homologii pomiędzy sondą a docelowym DNA.
Automatyczna identyfikacja genu mecA i kontroli
Temperatury topnienia (TM) próbek i kontroli są analizowane przez oprogramowanie przeznaczone do identyfikacji (SeptiFast Identification
Software), a następnie generowany jest raport.
ODCZYNNIKI
LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG
P/N: 04 488 814 001
[1a] RM 1a (mieszanina reakcyjna 1a)
5,5 IU/µl polimeraza FastStart Taq
[1b] RM 1b (mieszanina reakcyjna 1b)
bufor Tris-HCl
< 1% Brij
< 0,1% roztwór magnezu
< 0,001% dNTP
[2] DM (mieszanina detekcyjna)
< 0,001% primer, sondy
bufor Tris-HCl
< 1% Brij
[3] RC (kontrola odczynnika)
< 0,001% matryca kontroli DNA
bufor Tris-HCl
< 0,001% nośnikowy RNA
[4] IC (kontrola wewnętrzna)
< 0,001% DNA w kontroli przetwarzania
< 0,001% nośnikowy RNA
bufor Tris-HCl
[5] DE (enzym dekontaminujący)
< 0,1% enzym AmpErase (uracylo-N-glikozylaza)
bufor Tris-HCl
[6] BU (bufor)
< 0,5% roztwór magnezu
[7] DI (rozcieńczalnik)
woda, o stopniu czystości odpowiednim do PCR
2 x 15 testów
2 x 58 µl
2 x 164 µl
2 x 193 µl
2 x 275 µl
2 x 39 µl
2 x 20 µl
2 x 1000 µl
2 x 1000 µl
OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
Ogólne ostrzeżenia i środki ostrożności
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Niniejszy test jest przeznaczony wyłącznie do stosowania z krwią ludzką pobraną do probówki zawierającej K-EDTA. Wykazano, że heparyna
ma działanie hamujące reakcję PCR, dlatego też nie może być stosowana w tej procedurze. Jeżeli test jest przeprowadzany u pacjentów,
którzy otrzymają heparynę (np. w celach leczniczych lub podczas hemodializy), próbkę krwi należy pobrać przed podaniem heparyny.
Nie pipetuj ustami.
Nie jedz, nie pij ani nie pal w obszarach roboczych laboratorium. Posługując się próbkami i odczynnikami z zestawów stosuj jednorazowe
rękawice bez talku, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Dokładnie umyj ręce po pracy z próbkami i odczynnikami testowymi.
Nie łącz odczynników pochodzących z różnych serii.
Nie mieszaj odczynników pochodzących z różnych zestawów.
Wyrzuć wszystkie niezużyte odczynniki, odpady i próbki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi i lokalnymi.
Nie używaj zestawu po upływie daty przydatności.
Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS – Material Safety Data Sheets) są dostępne na żądanie u miejscowego
przedstawiciela firmy Roche.
Z próbkami należy obchodzić się jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak określone
w Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (11) oraz w dokumencie CLSI M29-A (12). Wszystkie powierzchnie robocze
i rękawiczki dokładnie oczyść i odkaź za pomocą odczynnika odkażającego do DNA (np. LTK-008™). Upewnij się, że rękawiczki są odporne
na działanie odczynnika odkażającego do DNA.
Podczas pracy z jakimkolwiek odczynnikiem używaj osłon na oczy oraz fartuchów laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Unikaj kontaktu
wspomnianych odczynników ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, natychmiast spłucz dużą ilością wody.
W przeciwnym przypadku może dojść do oparzenia. W razie rozlania wspomnianych odczynników, przed wytarciem plam rozcieńcz je wodą.
Praca w laboratorium musi przebiegać w sposób jednokierunkowy, rozpoczynając się w obszarze przedamplifikacyjnym i przemieszczając
się jednokierunkowo w stronę obszaru poamplifikacyjnego (amplifikacji/detekcji). Czynności przedamplifikacyjne obejmują przygotowanie
odczynników i próbek. Materiały i wyposażenie muszą być przeznaczone wyłącznie do określonej czynności poprzedzającej proces
amplifikacji i nie wolno używać ich do innych czynności ani przemieszczać między obszarami. W każdym obszarze konieczne jest używanie
rękawiczek, które należy zmienić przed opuszczeniem danego obszaru. Wyposażenie i materiały zastosowane do przygotowania odczynnika
nie mogą być używane podczas czynności związanych z przygotowywaniem próbki i kontroli lub pipetowaniem albo obróbką
zamplifikowanego DNA bądź innych źródeł docelowego DNA. Materiały i urządzenia używane w czynnościach po amplifikacji muszą
pozostawać zawsze w obszarze poamplifikacyjnym.
Obecność enzymu AmpErase w mieszaninie głównej (Master Mix) zmniejsza ryzyko skażenia amplikonu. Jednakże zanieczyszczenia
materiałem pochodzącym z kontroli dodatnich oraz z dodatnich próbek klinicznych można uniknąć jedynie dzięki stosowaniu zasad dobrej
praktyki laboratoryjnej i starannemu przestrzeganiu procedur opisanych w niniejszej ulotce, dołączonej do opakowania zestawu.
2
Szczegółowe ostrzeżenia i środki ostrożności dotyczące używania testu LightCycler® SeptiFast mecA Test MG
Bakteryjny DNA jest obecny w otoczeniu. Celem uniknięcia wyników fałszywie dodatnich uzyskanych w następstwie wykrycia DNA pochodzącego
z otoczenia (skażenie DNA), konieczne jest zapewnienie przebiegu procedury w warunkach wolnych od skażającego DNA. W szczególności
źródłem skażenia DNA może być użytkownik, ponieważ ludzka skóra i górne drogi oddechowe są zasiedlone przez mikroorganizmy, które mogą
posiadać gen docelowy dla testu LightCycler® SeptiFast mecA Test MG (np. metycylinooporny Staphylococcus aureus lub metycylinooporne
koagulazoujemne Staphylococci). Zalecane jest przestrzeganie poniższych zasad w celu uniknięcia skażenia DNA.
Odczynniki i materiały jednorazowe zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG
• Odczynniki i materiały jednorazowe zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Test Kit MG charakteryzują się jakością MG.
• Produkty MG zaprojektowano do stosowania podczas detekcji z bardzo dużą czułością kwasu nukleinowego bakterii i grzybów. W celu
eliminacji zanieczyszczeń DNA, które mogłyby interferować z takimi oznaczeniami, opracowano zastrzeżone technologie produkcji.
• Unikaj otwierania i zamykania fiolek z odczynnikami, gdy nie jest to konieczne.
Odzież ochronna i rękawiczki
• Podczas całej procedury używaj rękawiczek bez talku.
• Unikaj ekspozycji skóry; noś rękawiczki zachodzące na rękawy fartucha laboratoryjnego.
• W przypadku skażenia rękawiczek natychmiast je zmień lub wyczyść odczynnikiem odkażającym do DNA (np. LTK-008™; rękawiczki
muszą być odporne na ten odczynnik).
• Nie dotykaj części dłoniowej i palców rękawiczek podczas ich zakładania.
Konserwacja stacji roboczej PCR
• Po każdym skonfigurowaniu reakcji PCR czyść powierzchnie przestrzeni roboczej stacji roboczej PCR za pomocą odczynnika
odkażającego do DNA.
• UWAGA: Upewnij się, że sprzęt jest odporny na działanie odczynnika odkażającego do DNA.
• Czyść wszystkie powierzchnie wewnątrz stacji roboczej PCR w regularnych odstępach czasu
(tj. jej ściany, przestrzenie pod płytką dolną, płytkę podłogową).
• Upewnij się, że w stacji roboczej PCR nie ma próbek z DNA (jeśli jest ona używana przez kilku użytkowników).
• Włącz lampę UV na co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem pracy.
• Wyłącz lampę UV podczas przystępowania do pracy.
• UWAGA: Zmieniaj lampę UV stacji roboczej PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
Postępowanie z urządzeniami i materiałami eksploatacyjnymi
• Jeżeli to możliwe, pozostawiaj swoiste materiały eksploatacyjne i urządzenia używane do przeprowadzenia testu LightCycler®
SeptiFast mecA Test MG w stacji roboczej PCR.
• Przed przystąpieniem do pracy poddawaj wszystkie elementy działaniu światła UV przez co najmniej 30 minut.
• Używaj wyłącznie materiałów eksploatacyjnych, które nie zawierają DNA (np. materiałów o jakości MG; zapoznaj się z ulotką
dołączoną do opakowania testu LightCycler® SeptiFast Test MG). Wymienione materiały mogą być używane tylko jeden raz.
• Do zamykania kapilar używaj narzędzia korkującego (w celu uzyskania wskazówek dotyczących postępowania zapoznaj się
z podręcznikiem użytkownika urządzenia LightCycler® 2.0).
• W przypadku pęknięcia kapilary zapoznaj się z podręcznikiem użytkownika urządzenia LightCycler® 2.0 (rozdział „Konserwacja”).
Środki ostrożności podczas pipetowania
• Fiolki z odczynnikami, pudełka z końcówkami do pipet oraz pudełka z kapilarami otwieraj wyłącznie tylko pod wyciągiem z laminarnym
przepływem powietrza.
• Nie używaj tych samych końcówek do pipet i kapilar poza wyciągiem z przepływem laminarnym.
• Nie dotykaj krawędzi ani gwintów otwartej fiolki. Podczas pipetowania dotykaj fiolki poniżej krawędzi.
• Nie dotykaj krawędzi otwartej kapilary.
• Ustaw w logicznym porządku wszystkie elementy używane podczas pracy pod wyciągiem z przepływem laminarnym.
• W przypadku rozlania zakończ dany etap pracy i niezwłocznie wyczyść przestrzeń roboczą za pomocą odczynnika odkażającego do
DNA (np. LTK-008™).
WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA
• Przechowywać w temperaturze od -15 do -25°C.
• Chronić przed światłem.
• Odczynnik Master Mix (główny rozcieńczalnik) przechowywać w temperaturze od 2 do 8°C nie dłużej niż 72 godziny
(w celu uzyskania informacji o przygotowywaniu odczynnika Master Mix zapoznaj się z częścią „Przygotowanie odczynników”).
• Otwarte fiolki przechowywać nie dłużej niż 6 miesięcy od pierwszego ich otwarcia. Nie używać po upływie daty przydatności.
• Otwarte fiolki zamrażać i odmrażać nie więcej niż 4 razy od pierwszego ich otwarcia.
• Nie używać po upływie daty przydatności.
MATERIAŁY DOSTARCZONE
SeptiFast Lys Kit MG
P/N: 04 404 432 001
100 testów
SeptiFast Prep Kit MG
P/N: 04 404 459 001
10 testów
LightCycler® SeptiFast Kit MG
P/N: 04 469 046 001
54 testy
SeptiFast Software Set 1.0 lub nowszy (dostarczany jednorazowo) P/N: 04 705 220 001
LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG
P/N: 04 488 814 001
MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIE DOSTARCZANE
Zapoznaj się z ulotką dołączoną do opakowania testu LightCycler® SeptiFast Test MG.
3
2 x 15 testów
POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK
UWAGA: Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym.
Pobieranie próbek
Sposób pobierania próbki opisano w ulotce dołączonej do opakowania testu LightCycler® SeptiFast Test MG.
Transport i przechowywanie próbek
Sposób transportu i przechowywania próbek opisano w ulotce dołączonej do opakowania testu LightCycler® SeptiFast Test MG.
Przechowywanie eluatu
Eluat może być przechowywany: w temperaturze od 15 do 25°C – maksymalnie 4 godziny, w temp. od 2 do 8°C – do 3 dni, w temp. od -15 do
-25°C – 3 dni.
INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA
Przed rozpoczęciem przygotowywania odczynników
Kompensacja kolorów
Używanie zestawu LightCycler® Multicolor Compensation Set (P/N: 04 484 355 001) jest niezbędne. Szczegółowe informacje przedstawiono
w ulotce dołączonej do opakowania zestawu LightCycler® Multicolor Compensation Set.
Instalacja oprogramowania SeptiFast Identification Software (SIS) oraz makropolecenia SeptiFast mecA Macro
Przed uruchomieniem testu muszą być zainstalowane pprogramowanie SeptiFast Identification Software (SIS) oraz makropolecenie SeptiFast
mecA Macro (nazwa pliku: SeptiFast mecA_1.0_04488814001 lub nowsze wersje). Szczegółowe informacje przedstawiono w ulotce
dołączonej do opakowania testu LightCycler® SeptiFast Test MG.
Przygotowanie kontroli
• Materiały do kontroli dodatniej można zakupić w innych firmach.
• Dla testów LightCycler® SeptiFast mecA Test MG oraz LightCycler® SeptiFast Test MG jako materiał do kontroli dodatniej można
zastosować ATCC 33592, metycylinooporny S. aureus. Odpowiedni sposób przygotowania opisano w ulotce dołączonej do
opakowania testu LightCycler® SeptiFast Test MG.
• Kontrola dodatnia powinna zostać przeprowadzona poprzez wszystkie etapy procedury, tak jak każda inna próbka.
Przygotowanie odczynnika za pomocą zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG
1.
2.
3.
4.
Dokładnie wyczyść i odkaź wyciąg z przepływem laminarnym oraz stację roboczą PCR (np. za pomocą LTK-008™).
Włącz na przynajmniej 30 minut lampę UV i strumień powietrza w wyciągu z przepływem laminarnym, a także lampę UV stacji roboczej PCR.
Wyłącz lampę UV podczas przystępowania do pracy.
Rozmrażaj składniki zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG w temperaturze pokojowej przez mniej więcej 20 minut, chroniąc
je przed dostępem światła. Wytrząsaj przez chwilę na mieszadle wibracyjnym i szybko odwiruj pulsacyjnie.
5. W zależności od całkowitej liczby próbek, które mają zostać poddane analizie (z uwzględnieniem dwóch dodatkowych reakcji dla
kontroli ujemnej i dodatniej), umieść kapilary LightCycler® w uprzednio schłodzonych łącznikach do wirówki.
6. Przygotuj odczynnik Master Mix, mnożąc wartość liczbową z kolumny „Objętość” przez liczbę reakcji, jakie mają zostać wykonane
(eluaty próbek, eluat kontroli ujemnej i eluat kontroli odczynnika), z uwzględnieniem jednej dodatkowej reakcji mającej na celu
zapewnienie odpowiedniej objętości pipetowania. Postępuj zgodnie z poniższym opisem dla reakcji standardowej (100 µl).
Etap
1
Działanie
Przygotowanie odczynnika Master Mix:
Do probówki reakcyjnej o objętości 1,5 ml w temperaturze od 2°C do 8°C dodawaj następujące składniki (w wymienionej kolejności):
Składnik
Objętość (µl)
DI
13,5
BU
12
DM
10
IC
2
RM 1b
8,5
DE
1
RM 1a
3
Łączna objętość
50
2
• Wymieszaj delikatnie, pipetując. Nie wytrząsaj na mieszadle wibracyjnym!
• Odpipetuj 50 µl odczynnika Master Mix do każdej uprzednio schłodzonej kapilary LightCycler®.
3
• Dodaj po 50 µl eluatu każdej próbki do oddzielnej kapilary, zamknij kapilarę przy użyciu narzędzia korkującego.
• Dodaj 50 µl eluatu kontroli ujemnej (NC) do kapilary. Kontrola ujemna nie jest częścią zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG
i jest przygotowywana poprzez przetwarzanie kontroli ujemnej (NC) z testu LightCycler® SeptiFast Test MG. Próbki z każdego cyklu
przygotowania próbek i serii PCR muszą być analizowane razem z kontrolą ujemną (NC) przygotowaną w tej samej serii. W czasie
jednego przebiegu testowego nie należy łączyć próbek przygotowanych w różnych seriach. Zamknij kapilarę przy użyciu narzędzia
korkującego.
• Dodaj 50 µl kontroli odczynnika (RC) do kapilary. Zamknij kapilarę przy użyciu narzędzia korkującego.
4
Przenieś wszystkie kapilary zgodnie z listą załadowania próbek makropolecenia SeptiFast mecA Macro (RC, NC, próbka 1., próbka 2., ...)
do obrotowego pojemnika na próbki LightCycler®.
5
Odwiruj obrotowy pojemnik na próbki LightCycler®, używając wirówki LC 2.0 na obrotowy pojemnik (sprawdź poziom płynu w kapilarach).
6
Umieść obrotowy pojemnik na próbki LightCycler® w urządzeniu LightCycler® 2.0.
4
Ładowanie i obsługa urządzenia LightCycler® 2.0
UWAGA: Zaleca się, aby w pokoju, w którym pracuje urządzenie LightCycler® 2.0, nie oczyszczano DNA ani nie przygotowywano
roztworów roboczych.
1. Uruchom makropolecenie Macro SeptiFast mecA (nazwa pliku: SeptiFast mecA_1.0_04488814001; lub nowsze wersje). Proszę zapoznać
się z rozdziałem „Uruchamianie makropolecenia Roche” w podręczniku użytkownika urządzenia LightCycler® 2.0.
UWAGA: Nie używaj pola <assay lot number>. Jeżeli chcesz dodać numer serii oznaczenia do wykonywanego badania, umieść tę
informację w odpowiednim polu w edytorze próbki.
UWAGA: Jeżeli użytkownik jest wylogowany, nie rozpoczynaj przebiegu testowego. Rozpocznij nowy przebieg z nową nazwą.
2. Zapisz przebieg testowy z nazwą umożliwiającą jednoznaczną identyfikację (np. nazwisko użytkownika i data).
3. Zmniejsz liczbę próbek domyślnej listy załadunkowej, jeżeli wymaganych jest mniej niż 5 próbek. Jeżeli przypadkowo wykasowano
zbyt dużo kapilar, nie dodawaj ich, lecz rozpocznij procedurę od nowa.
4. Wpisz dane konkretnego pacjenta w <nawiasach> (np. mecA <nazwisko-01>).
5. Po dodaniu wszystkich informacji dotyczących próbki kontynuuj pracę z kreatorem zestawu i uruchom urządzenie LightCycler® 2.0.
6. Po zakończonym przebiegu testowym sprawdź poziom płynu w kapilarach (wyniki dla danej kapilary będą nieważne, jeżeli objętość
jej zawartości jest zmienna).
UWAGA: Nie zmieniaj pierwszych członów nazw próbek. Nie usuwaj nawiasów. Każda próbka musi zawierać pierwszy człon swoisty
dla danego oznaczenia (mecA), aby umożliwić jej identyfikację przez oprogramowanie SIS. Nie zmieniaj nazwy kontroli odczynnika
(RC) i kontroli ujemnej (NC).
Wykrywanie największej wartości oraz automatyczna identyfikacja największej wartości
Ogólne objaśnienie modułów analizy
• Tryb ręcznego określania TM wymaga ręcznej obsługi w dwóch automatycznie stosowanych modułach określania TM.
Moduł bezwzględnego oznaczenia ilościowego, który także jest stosowany automatycznie, nie wymaga żadnej obsługi ręcznej.
• Pasek TM każdego trybu analizy jest wstępnie definiowany w makropoleceniu SeptiFast mecA Macro.
• W oknie największej wartości temperatury topnienia przedstawiono wszystkie krzywe wybranych wykresów.
• Możliwe jest oznaczenie lub usunięcie oznaczenia pasków TM.
• Wartość początkowa każdego trybu analizy jest wstępnie definiowana w makropoleceniu SeptiFast mecA Macro.
• Nie zmieniaj ani nie usuwaj oznaczenia wartości początkowych. Jeśli doszło do przypadkowej zmiany, wpisz prawidłowe
wartości z tabeli 2: Wartości początkowe.
• Jeżeli aktywowana jest więcej niż jedna kapilara, ustawienia pierwszej kapilary są wyświetlone w polu wyboru.
• Zmiana pasków ma wpływ na wszystkie aktywowane kapilary.
UWAGA: Nie zmieniaj ustawień: <Channel>, <Color Compensation>, <Program>, <Method>, <Show Shoulders>, <Peak Area> oraz
<Peak Width>.
• Największe wartości są definiowane jako wartości najbardziej odbiegające w górę od wartości początkowej. Ustawienia „Shoulders”
(ramiona) nie stanowią największych wartości.
• Należy wybrać suwaki w odpowiednich zakresach TM (patrz Tabela 1).
Tabela 1: Zakresy TM dla ważnych największych wartości
CH 640
CH 705
Mała wartość TM (°C) Duża wartość TM (°C) Mała wartość TM (°C) Duża wartość TM (°C)
mecA
•
62,00
69,00
51,50
58,50
Wartości początkowe są wstępnie zdefiniowane zgodnie z poniższą tabelą. Nie mogą one być zmieniane. (Jeżeli doszło do
ich przypadkowej zmiany, wpisz poprzednie wartości zgodnie z listą; w przeciwnym razie przebieg testowy zostanie oznaczony).
Tabela 2: Wartości początkowe
mecA
CH 640
CH 705
0,021
0,022
Dostosowywanie pasków TM
1. Po zakończeniu przebiegu testowego kreator badania wyświetla okno <Analyses have been created>.
2. Zminimalizuj okno (nie naciskaj przycisku <Finish>).
3. Upewnij się, że wartości TM i wartości początkowe są widoczne.
4. Kliknij moduł analizy (np. TM Calling mecA 640).
5. Uaktywnij wszystkie pozycje oznaczenia, aby uzyskać ogólny przegląd.
6. Kliknij tylko pozycję mecA #RC#.
7. Dostosuj pasek TM, aby zaznaczyć największą wartość powyżej wartości początkowej; uwzględnij tylko właściwy zakres TM.
Jeżeli powyżej wartości początkowej nie ma żadnej wartości, pasek TM musi zostać usunięty (dezaktywuj pole wyboru w odpowiednim oknie).
Ostatecznie w procesie określania TM dla konkretnej kapilary muszą pozostać włącznie jedynie największe wartości z paskami TM.
8. Uaktywnij następną pozycję (np. mecA #NC#) wraz z mecA #RC#, aby uzyskać ogólny przegląd. (Automatyczne skalowanie spowoduje
dostosowanie do największej wartości).
9. Aktywuj tylko wybraną pozycję (np. mecA #NC#). (Automatyczne skalowanie spowoduje dostosowanie do największych wartości tła
kontroli ujemnej. Wartość początkowa może nie być już widoczna).
10. Kontynuuj wykrywanie największych wartości próbek zgodnie z etapami od 5 do 7.
11. Po zakończeniu analizy pierwszego kanału detekcji (określanie TM mecA 640) przejdź do określania TM mecA 705 zgodnie z opisem
etapów od 4 do 10.
5
Zakończenie określania TM
1. Przywróć okno kreatora badania na środek ekranu monitora i naciśnij przycisk <Finish>.
2. Raport LightCycler® jest tworzony automatycznie i musi zostać wydrukowany.
3. Przebieg testowy zostanie automatycznie zapisany.
4. Eksportuj plik *.ixo do katalogu <C:\Export to SIS>.
5. Sprawdź, czy w raporcie są oznaczenia, a także czy została wyświetlona informacja: <run state: complete>.
6. Jeżeli są obecne oznaczenia lub inne komunikaty dotyczące stanu przebiegu, przebieg testowy jest nieważny i wszystkie próbki muszą
zostać zbadane ponownie.
Automatyczna identyfikacja największej wartości za pomocą aplikacji SeptiFast Identification Software (SIS)
1. Kliknij dwukrotnie ikonę SIS na pulpicie i naciśnij przycisk <Start>.
2. Wybierz przebieg z katalogu <C:\Export to SIS> i załaduj plik *.ixo.
3. Wybierz „Yes” lub „No”, aby określić, czy raport LightCycler® zawiera oznaczenie <User Developed or Modified Test Method>.
4. Plik *.ixo zostanie automatycznie poddany analizie, a dane będą wyświetlone w raporcie.
5. Wydrukuj raport SIS.
WYNIKI
Interpretacja wyników
Aplikacja SeptiFast Identification Software (SIS) może generować OZNACZENIA oraz KOMENTARZE takie jak: RUN FLAGS, ASSAY FLAGS i FLAGS
w oknie SPECIMEN (patrz niżej). Użytkownik musi sprawdzić wydruk(i) przebiegu testowego pod kątem obecności FLAGS lub COMMENTS
w oknie SPECIMEN.
Rysunek 1: Okno Specimen
Specimen
Assay
Data
Result
SeptiFast mecA
sample 1
mecA
<CH..., TM..., PH..., CP...>
<mecA>
SeptiFast mecA
sample 2
mecA
Flags
Comment
\
Dodatkowe informacje można uzyskać w polach COMMENT dla RUN FLAGs i ASSAY FLAGs. Wszystkie oznaczenia wymieniono w tabeli 3.
Wyniki próbki
Nazwa <mecA> w polu RESULT wskazuje, że w próbce wykryto gen mecA.
Uwaga: Proszę sprawdzić pole komentarza testu LightCycler® SeptiFast Test MG, aby stwierdzić, czy jest wyświetlone oznaczenie
<for mecA resistance testing: Peak for CoNS from SML detected>1. Dalsze informacje znajdują się w części „Ograniczenia metody”.
Surowe dane na temat odnośnych największych wartości przedstawiono w polu DATA; zawierają one: kanał (CH), temperaturę topnienia (TM),
największą wartość (PH) i punkt skrzyżowania (CP 2).
Symbol \ w polu RESULT oznacza, że nie wykryto oznaczanego składnika w zakresie zdefiniowanych kryteriów dla genu mecA.
1
Wartość SML oznacza listę główną SeptiFast (SeptiFast Master List); szczegółowe informacje znajdują się w ulotce dołączonej do opakowania
testu LightCycler® SeptiFast Test MG.
Wartość CP jest wyświetlana dla kanału 640.
2
Walidacja przebiegu testowego
Walidacja przebiegu testowego jest przeprowadzana przez oprogramowanie SeptiFast Identification Software. Wyniki nieważne są wyświetlane
automatycznie i oznaczane za pomocą symbolu .
Komentarze do oznaczeń oraz odpowiadające im interpretacje wymieniono poniżej.
Tabela 3: Oznaczenia dotyczące walidacji przebiegu testowego
Comments3
3
Interpretacja
ASSAY FLAG
NC: IC not detected
W NC nie wykryto mecA oraz IC.
ASSAY FLAG
NC: < CH…, TM…, PH…, CP…>,< mecA >
W NC wykryto mecA.
ASSAY FLAG
RC: No amplicon: <mecA>
Błąd RC.
SPECIMEN FLAG
IC not detected
W próbce nie wykryto ani mecA, ani IC.
Błędy systemowe wymieniono w części „Rozwiązywanie problemów”.
KONTROLA JAKOŚCI
Każdy przebieg testowy musi obejmować po przynajmniej jednym powtórzeniu NC i RC. Wartości NC i RC muszą być umieszczone
w określonych pozycjach, tak jak to opisano w części „Przygotowanie odczynnika”.
Zaleca się poddanie wszystkim procedurom przetwarzania próbek własnego materiału dodatniego jako kontroli dodatniej (zgodnie z opisem
w części „Kontrola dodatnia”).
Oprogramowanie SIS określa wynik IC, NC i RC. Jeżeli próbki kontrolne nie spełniają określonych wymogów, wyniki wszystkich próbek
zostają oznaczone. W celu upewnienia się, że dany przebieg testowy jest ważny, sprawdź, czy w oknie SPECIMEN na wydruku przebiegu
testowego znajdują się oznaczenia i komentarze.
Kontrola ujemna (NC)
Wynik kontroli ujemnej (NC) musi być ujemny, a wynik jej kontroli wewnętrznej musi być dodatni. Jeżeli NC nie spełnia powyższych kryteriów,
wyniki wszystkich próbek zostaną oznaczone. Cały przebieg testowy musi zostać powtórzony.
6
Kontrola odczynnika (RC)
Kontrola odczynnika z amplikonem mecA musi być dodatnia. Jeżeli kontrola odczynnika nie spełnia powyższego kryterium, wyniki wszystkich
próbek zostaną oznaczone. Cały przebieg testowy musi zostać powtórzony.
Kontrola dodatnia (PC)
Wynik kontroli dodatniej musi być dodatni. Jeżeli kontrola dodatnia nie spełnia powyższego kryterium, przebieg testowy jest nieważny.
Oprogramowanie SIS nie wyświetla żadnego oznaczenia. Cały przebieg testowy musi zostać powtórzony.
Kontrola wewnętrzna (IC)
Wynik kontroli wewnętrznej musi być dodatni dla wszystkich próbek ujemnych oraz dla kontroli ujemnej. Jeżeli kontrola wewnętrzna nie
spełnia powyższego kryterium, wynik próbki zostanie oznaczony.
W przypadku nieważnych kontroli powtórz cały proces (przygotowanie próbki i kontroli, amplifikacja i detekcja wszystkich trzech oznaczeń za
pomocą testu LightCycler® SeptiFast Test MG, a następnie ocena oporności za pomocą testu LightCycler® SeptiFast mecA Test MG). Jeżeli
wyniki kontroli są nadal nieważne, skontaktuj się z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW
Tabela 4: Błędy systemowe wyświetlane w polu COMMENTS oznaczeń RUN FLAGS oraz na wydruku SIS
Komunikat systemowy
Możliwa przyczyna
(wyświetlany w części
wydruku SIS przeznaczonej
dla oznaczeń)
Czynność naprawcza
User Developed or
Modified Test Method
Przebieg testowy jest nieważny; możliwe
przyczyny opisano w podręczniku użytkownika
urządzenia LightCycler® 2.0. Standardowe
ustawienia makropolecenia (np. wartości
początkowe, protokół przebiegu testowego itp.)
mogą być zmienione.
Otwórz oryginalny plik *.ixo w oprogramowaniu
LightCycler® Software i sprawdź wartości początkowe
w tabeli 2. Zapisz i ponownie wyeksportuj plik.
CCC File Name:
Multiple CCC used!
W jednym lub więcej modułach analizy są aktywne Wybierz odpowiednią kompensację kolorów i ponów
przynajmniej dwa pliki kompensacji kolorów.
obliczenia.
Color Compensation has
expired on DD-Month-YY
Obiekt kompensacji kolorów jest starszy niż sześć Utwórz nowy obiekt kompensacji kolorów.
miesięcy.
Invalid Macro
Zastosowano złe makropolecenie.
Sprawdź, czy makropolecenie w oprogramowaniu
LightCycler® i/lub SeptiFast Software Set jest prawidłowe.
Invalid Baseline
Wartości początkowe mogły zostać przypadkowo
zmienione.
Otwórz oryginalny plik *.ixo w oprogramowaniu
LightCycler® Software i sprawdź wartości początkowe
w tabeli 2. Zapisz i ponownie wyeksportuj plik.
Invalid Control Tube
Przynajmniej jedna kontrola ma nieprawidłową
nazwę.
Otwórz oryginalny plik *.ixo w oprogramowaniu
LightCycler® Software i sprawdź poprawność nazw
kontroli w edytorze próbki. Zmień nazwy na standardowe,
zapisz i ponownie wyeksportuj.
Missing Sample Tube
Przynajmniej jedna kapilara z próbką ma
niewłaściwą nazwę lub brakuje kapilar
z próbkami.
Otwórz oryginalny plik *.ixo w oprogramowaniu
LightCycler® Software i sprawdź poprawność nazw próbek
w edytorze próbki. Zmień nazwy na standardowe, zapisz
i ponownie wyeksportuj.
Invalid LightCycler® SW
Version
Do procedury zastosowano nieprawidłową wersję Otwórz oprogramowanie LightCycler® Software i sprawdź
oprogramowania LightCycler® Software.
prawidłowość numeru wersji oprogramowania.
No Manual TM Calling
Nie przeprowadzono ręcznego określania TM
(w żadnej próbce i w żadnym module analizy).
Makropolecenie zostało zakończone bez analizy.
Otwórz oryginalny plik *.ixo w oprogramowaniu
LightCycler® Software i przeprowadź ręczne określanie
TM. Zapisz i ponownie wyeksportuj.
+ additional run flags
Wykryto więcej niż 5 oznaczeń przebiegu
testowego.
Spróbuj samodzielnie rozwiązać opisane oznaczenia,
ponownie przeprowadź analizę przebiegu testowego za
pomocą SIS.
Invalid CCC File Name
W przynajmniej jednym module analizy są aktywne Wybierz odpowiedni plik kompensacji kolorów i ponów
przynajmniej dwa pliki kompensacji kolorów.
obliczenia.
Jeżeli w raporcie SIS brakuje jednej lub więcej próbek, sprawdź, czy żadna kapilara nie ma nieprawidłowej nazwy lub czy nie brakuje kapilar.
Aby skorygować tę sytuację, otwórz oryginalny plik *.ixo w oprogramowaniu LightCycler® Software i sprawdź poprawność nazw próbek
w edytorze próbki. Zmień nazwy na standardowe, zapisz i ponownie wyeksportuj.
7
OGRANICZENIA METODY
• Jeżeli za pomocą testu LightCycler® SeptiFast Test MG wykryto S. aureus, a w polu komentarza w oknie próbki widnieje napis <for
mecA resistance testing: Peak for CoNS from SML detected>, to oznacza, że wykryto mieszaninę S. aureus i CoNS (gronkowców
koagulazoujemnych). Wykrycie genu mecA może być spowodowane obecnością szczepu CoNS posiadającego ten gen mecA, a nie
obecnością MRSA.
• Mimo że szczepy CoNS posiadające gen mecA nie są wykrywane przez test LightCycler® SeptiFast Test MG, wykrycie genu mecA
może być spowodowane obecnością CoNS poniżej granicy wykrywalności, a nie obecnością MRSA.
• Poniżej określonego poziomu wykrywalności (zob. część „Czułość analityczna”) mogą wystąpić wyniki fałszywie ujemne, ponieważ
detekcja DNA S. aureus za pomocą testu LightCycler® SeptiFast Test MG może charakteryzować się większą czułością niż detekcja
DNA mecA za pomocą zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG.
• Zestaw LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG wykrywa gen mecA, ale nie umożliwia ostatecznej identyfikacji fenotypowej.
• Test ten został zatwierdzony wyłącznie do badania ludzkiej krwi pobranej do probówki zawierającej K-EDTA (substancję
przeciwkrzepliwą). Badanie innych rodzajów próbek może dawać wyniki nieprawidłowe, fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie.
• Niniejszy produkt powinien być stosowany wyłącznie przez personel specjalnie przeszkolony do pracy z zestawem LightCycler®
SeptiFast mecA Kit MG.
• Działanie zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG zostało dowiedzione dla próbek krwi zawierających 1000–30 000 leukocytów/µl.
OCENA KLINICZNA
Cele i metody badania klinicznego
W czterech europejskich ośrodkach przeprowadzono wieloośrodkowe badanie kliniczne. Jego celem była ocena działania zestawu
LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG. W ramach wspomnianego badania porównywano wyniki oporności uzyskane za pomocą PCR
z wynikami oporności uzyskanymi z hodowli. W tym celu próbki pochodząc od pacjentów charakteryzujących się dodatnim wynikiem testu
LightCycler® SeptiFast Test MG wykrywającym obecność Staphylococcus aureus poddawano dalszemu badaniu pod kątem obecności
genu mecA przy użyciu zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG. Izolaty S. aureus pochodzące od tych samych pacjentów
analizowano pod kątem metycylinooporności za pomocą hodowli. Do niniejszego badania włączono 778 próbek pochodzących od 279
pacjentów, niezależnie od tego, czy i jakie antybiotyki stosowano. Dokładne informacje na temat doboru pacjentów znajdują się w ulotce
dołączonej do opakowania testu LightCycler® SeptiFast Test MG.
W badaniu klinicznym zidentyfikowano za pomocą różnych metod 28 próbek dodatnich dla S. aureus. Zgodnie z zastosowanymi metodami,
próbki przydzielono do grup przedstawionych na rysunku 2.
S. aureus
wyizolowany
w hodowli z krwi
0
A
11
B
4
C
13
D
S. aureus wykryty za
pomocą LightCycler®
SeptiFast Test MG
Rysunek 2: Wykrywanie S. aureus za pomocą hodowli z krwi oraz za pomocą testu LightCycler® SeptiFast Test MG.
Próbki, w których wykryto S. aureus, przypisano do różnych grup celem porównania wyników oporności uzyskanych za pomocą zestawu
LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG z wynikami uzyskanymi za pomocą hodowli.
Lewy okrąg reprezentuje przypadki S. aureus wyizolowane w hodowli z krwi. Prawy okrąg reprezentuje próbki charakteryzujące się dodatnim
wynikiem na obecność S. aureus w teście LightCycler® SeptiFast Test MG. A) S. aureus wykryto wyłącznie za pomocą hodowli z krwi.
B) S. aureus wykryto za pomocą testu LightCycler® SeptiFast Test MG oraz hodowli z krwi. C) S. aureus wykryto za pomocą testu
LightCycler® SeptiFast Test MG; wynik dodatni potwierdzono za pomocą badań weryfikacyjnych. Izolat S. aureus do badań weryfikacyjnych
uzyskano z innego źródła niż oryginalna hodowla z krwi. D) S. aureus wykryto wyłącznie za pomocą testu LightCycler® SeptiFast Test MG.
Wszystkie próbki, w których zidentyfikowano S. aureus, analizowano pod kątem metycylinooporności metodami hodowlanymi lub przy użyciu
zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG.
Wyniki oporności dla bakterii S. aureus wyizolowanych wyłącznie w hodowli z krwi (grupa A)
Grupa A (rysunek 2) zawiera 0 próbek, w których bakterie S. aureus wyizolowano wyłącznie w hodowli z krwi. Dla tej grupy wyniki PCR nie
były dostępne.
Porównanie wyników oporności: hodowla z krwi a PCR (grupa B)
Grupa B (rysunek 2) zawiera 11 próbek, w których bakterie S. aureus zidentyfikowano za pomocą hodowli z krwi oraz przy użyciu testu
LightCycler® SeptiFast Test MG. Dla 5 próbek uzyskano zgodne, dodatnie wyniki oporności za pomocą obu metod. Wyniki dla 6 próbek były
w obu metodach ujemne.
Badania weryfikujące (grupa C)
Grupa C (rysunek 2) zawiera 4 przypadków, w których S. aureus zidentyfikowano za pomocą testu LightCycler® SeptiFast Test MG,
w których ponadto wyizolowano bakterie S. aureus z innych źródeł niż oryginalna hodowla z krwi. W tej grupie znajdują się próbki pochodzące
np. z drugiej hodowli z krwi pobranej w innym czasie, z płynów ustrojowych/tkanek oraz z drenów, ran, wycinków itp. Zgodne dodatnie wyniki
oporności uzyskane za pomocą PCR i w badaniach hodowlanych uzyskano dla 2 próbek. W przypadku jednej próbki, gen oporności wykryto
jedynie za pomocą zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG. Jedna próbka była ujemna w obu metodach.
Wyniki oporności dla bakterii S. aureus wykrytych wyłącznie za pomocą PCR (grupa D)
Grupa D (rysunek 2) zawiera 13 próbek, w których S. aureus zidentyfikowano wyłącznie za pomocą testu LightCycler® SeptiFast Test MG.
Dla tej grupy wyniki hodowli nie były dostępne. W przypadku 0 spośród tych próbek gen oporności wykryto za pomocą zestawu LightCycler®
SeptiFast mecA Kit MG.
8
OCENA DZIAŁANIA W BADANIACH NIEKLINICZNYCH
Czułość analityczna
Minimalna czułość wynosi 30 CFU/ml krwi pobranej do próbówki zawierającej K-EDTA. Opisane niżej badanie wskazuje, że granicę
wykrywalności dla MRSA w przypadku S. aureus określono za pomocą testu LightCycler® SeptiFast Test MG, a w przypadku genu mecA za
pomocą zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG. Kolejne rozcieńczenia MRSA o znanym stężeniu (ATCC 33592) dodawano do pełnej
krwi pochodzącej od zdrowych dawców, a następnie przetwarzano tak, jak to opisano w ulotkach dołączonych do opakowań odpowiednich
testów. Każde rozcieńczenie badano w ośmiu powtórzeniach, wykorzystując dwie serie. W tabeli 5 przedstawiono łącznie dane dla obydwu
serii. Granica wykrywalności dla S. aureus wynosi 4,3 CFU/ml (95%) CI=[2,8-13,1], a dla genu mecA 7,5 CFU/ml (95%) CI=[4,9-16,6].
Tabela 5: Granica wykrywalności
Stężenie MRSA [CFU/ml]
Liczba wyników dodatnich dla mecA
Liczba wyników dodatnich dla S. aureus
100
16/16
16/16
50
16/16
16/16
25
16/16
16/16
12,5
16/16
16/16
6,75
15/16
16/16
3,4
12/16
15/16
1,7
3/16
8/16
0,85
4/16
8/16
0
0/16
0/16
Swoistość analityczna
Reprezentatywność
Reprezentatywność badano za pomocą genomowego DNA 167 szczepów MRSA. Testowane szczepy zawierały jeden szczep referencyjny
(ATCC 33592) oraz 166 izolatów klinicznych zebranych w Europie i w USA. Izolaty te zawierały SCCmec typu I-V (zgodnie z oceną dokonaną
za pomocą elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym – PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis)). SCCmec oznacza Staphylococcal
Chromosomal Cassette, mobilny element genomu zawierający gen mecA. Ponadto analizie poddano 588 dodatkowych izolatów klinicznych
MRSA bez dalszej diagnostyki molekularnej. W 580 izolatach wykryto gen mecA; pozostałe 8 izolatów zakwalifikowano jako S. aureus
charakteryzujący się graniczną opornością na oksacylinę (BORSA) lub S. aureus zmodyfikowany (MODSA)4; w wymienionych przypadkach
wartość MIC wynosi mniej niż 8 µg oksacyliny na ml.
Wyłączność diagnostyczna
Zbadano genomowy DNA niżej wymienionych drobnoustrojów. Są to najczęstsze patogeny powodujące zakażenie krwi (13), szczepy z nimi
blisko spokrewnione oraz szczepy filogenetycznie blisko spokrewnione z S. aureus. U żadnego ze zbadanych gatunków nie wykryto genu mecA.
Actinobacillus actinomycetemcomitans
Cryptococcus neoformans
Pantoea agglomerans
Acinetobacter baumannii
Enterobacter aerogenes
Peptostreptococcus magnus
Aeromonas hydrophila
Enterobacter cloacae
Porphyromonas gingivalis
Aspergillus fumigatus
Enterobacter taylore
Prevotella denticola
Bacillus cereus
Enterococcus faecalis
Propionibacterium acnes
Bacteroides fragilis
Enterococcus faecium
Proteus mirabilis
Bartonella henselae
Escherichia coli
Proteus vulgaris
Bordetella pertussis
Gemella haemolysans
Pseudomonas aeruginosa
Borrelia burgdorferi
Histoplasma capsulatum
Salmonella enterica
Burkholderia cepacia
Klebsiella oxytoca
Serratia marcescens
Campylobacter jejuni
Klebsiella pneumoniae
Shigella sonnei
Candida albicans
Legionella pneumophila
Staphylococcus aureus
Candida glabrata
Listeria monocytogenes
Staphylococcus epidermidis
Candida krusei
Moraxella (Branhamella) catarrhalis
Staphylococcus haemolyticus
Candida parapsilosis
Morganella morganii
Stenotrophomonas maltophilia
Candida tropicalis
Mycobacterium fortuitum
Streptococcus agalactiae
Cardiobacterium hominis
Mycobacterium tuberculosis
Streptococcus mitis
Citrobacter freundii
Mycobacterium xenopi
Streptococcus pneumoniae
Clostridium perfringens
Mycoplasma pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Corynebacterium jeikeium
Neisseria meningitidis
Yersinia enterocolitica
4
BORSA oznacza mały poziom oporności, która opiera się na zwiększonej produkcji beta-laktamazy; MODSA ma białka PBP o zmienionej
strukturze i zmniejszonym powinowactwie lub charakteryzuje się nadprodukcją białek PBP (rzadko). Obie grupy nie posiadają genu mecA.
9
Substancje interferujące
Następujące substancje nie wpływają na wykrywanie DNA mecA za pomocą niniejszego testu.
Tabela 6: Substancje interferujące
Nr
Nazwa handlowa
Substancja czynna
Producent
1x Cmax
3x Cmax
jednostka
1
Piperacillin®
piperacylina
Hexal
4,0
12,0
mg/ml
2
Fortum®
ceftazydym
GlaxoSmithKline
0,50
1,5
mg/ml
3
Zienam®
imipenem/cilastatyna
MSD Sharp & Dohme
0,27*
0,80*
mg/ml
4
Tazobac®
piperacylina/tazobaktam
Wyeth Pharma
0,75
2,3
mg/ml
5
Ciprobay®
ciprofloksacyna
Bayer
33,3
100,0
µg/ml
6
Vancomycin®
wankomycyna
Lilly
83,0
250,0
µg/ml
7
Refobacin®
gentamycyna
Merck
80
240
µg/ml
8
Zyvoxid®
linezolid
Pfizer
0,10
0,30
mg/ml
9
Sobelin®
klindamycyna
Pfizer
0,30
0,90
mg/ml
10
InfectoClont®
metronidazol
Infectopharm
83,3
250,0
µg/ml
11
Diflucan®
flukonazol
Pfizer
0,13
0,39
mg/ml
µg/ml
12
Cancidas®
kaspofungina
MSD Sharp & Dohme
8,3
25,0
13
Amphotericin B®
amfoterycyna B
Bristol-Myers Squibb
20
60
µg/ml
14
Novalgin®
metamizol
Aventis Pharma
0,83
2,5
mg/ml
15
Dexahexal®
deksametazon
Hexal
1,3
4,0
µg/ml
16
ARA-cell®
cytarabina
cell pharm
63,3
190,0
µg/ml
17
Arterenol®
norepinefryna (noradrenalina)
Aventis Pharma
4,8
14,4
µg/ml
18
Aquo-Trinitrosan®
nitrogliceryna
Merck
1,3
4,0
µg/ml
19
Heparin-Natrium-5000ratiopharm®
heparyna
ratiopharm
0,83
2,5
IU/ml
* Użycie CMAX (0,67) roztworu do wlewów Zienam® nie było możliwe z powodu znacznego rozcieńczenia próbki.
DOKŁADNOŚĆ
Dokładność zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG oceniono przy użyciu pełnej krwi pobranej do probówki z K-EDTA, do której
dodawano średnie (10E3 CFU/ml) i małe (10E2 CFU/ml) stężenia MRSA. Przez 3 dni w 7 powtórzeniach próbki analizowało 3 użytkowników za
pomocą 2 urządzeń. Analizowano największe wartości temperatury topnienia. W ocenie dokładności wewnętrznej testu wszystkie największe
wartości zawierały się w zakresie +/- 2,5°C; w ocenie dokładności pomiędzy oznaczeniami wszystkie największe wartości zostały określone
przez oprogramowanie SeptiFast Identification Software jako dodatnie.
INFORMACJA DLA NABYWCY
Zakup niniejszego produktu umożliwia nabywcy używanie go do amplifikacji i detekcji sekwencji kwasu nukleinowego w celach
diagnostyki in vitro próbek pochodzących od ludzi. Wraz z nabyciem niniejszego produktu nabywca nie otrzymuje żadnego patentu
ogólnego lub innej licencji poza prawem do określonego, szczególnego zastosowania produktu.
10
PIŚMIENNICTWO
1. Pfaller, M.A., et al. Survey of blood stream infections attributable to gram-positive cocci: frequency of occurrence and antimicrobial
susceptibility of isolates collected in 1997 in the United States, Canada, and Latin America from the SENTRY Antimicrobial
Surveillance Program. SENTRY Participants Group. Diagn Microbiol Infect Dis 1999; 33:283-97.
2. Diekema, D.J., et al. Survey of infections due to Staphylococcus species: frequency of occurrence and antimicrobial susceptibility of
isolates collected in the United States, Canada, Latin America, Europe, and the Western Pacific region for the SENTRY Antimicrobial
Surveillance Program, 1997-1999, Clin Infect Dis 32 (2001) (suppl 2), S114-S132.
3. Zetola, N., et al. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus: an emerging threat. The Lancet Infectious Diseases,
Volume 5, Issue 5, 275-286.
4. Cosgrove, S.E., et al. Comparison of mortality associated with methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus
bacteremia: a meta-analysis. Clin Infect Dis. 2003 Jan 1;36(1):53-9. Epub 2002 Dec 13.
5. Whitby, M., et al. Risk of death from methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteraemia: a meta-analysis. Med J Aust. 2001 Sep
3;175(5):264-7.
6. Kolleff, M.H., et al. Inadequate antimicrobial treatment of infections, Chest (1999); 115: 462-74.
7. Harbarth, S., et al. Inappropriate Initial Antimicrobial Therapy and Its Effect on Survival in a Clinical Trial of Immunomodulating Therapy
for Severe Sepsis, Am J Med. (2003); 115: 529-35.
8. Lodise, T.P., et al. Outcomes Analysis of delayed antibiotic treatment for hospital-acquired Staphylococcus aureus bacteremia. Clin
Infect Dis (2003); 36: 14-23.
9. Paterson, D.L., et al. Empirical antibiotic choice for the seriously ill patient: are minimization of selection of resistant organisms and
maximization of individual outcome mutually exclusive? Clin Infect Dis. (2003);36(8):1006-12.
10. Ryffel, C., et al. Sequence comparison of mecA genes isolated from methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus
epidermidis. Gene. 1990 Sep 28;94(1):137-8.
11. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC)
93-8395.
12. Clinical Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids,
and Tissue. Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA:CLSI, 1997.
13. Cockerill FR 3rd, et al, Analysis of 281,797 consecutive blood cultures performed over an eight-year period: trends in microorganisms
isolated and the value of anaerobic culture of blood, Clin Infect Dis. 1997; 24 (3): 403-18.
11
Ú
Distributed by
Wyprodukowano w Niemczech dla:
Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA
Roche Diagnostics
Indianapolis, IN 46256 USA
(For Technical Assistance call the
Roche Response Center
toll-free: 1-800 526 1247)
Roche Diagnostics
H7V 4A2 Laval, Quebec
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877 273 3433)
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
CH-6343 Rotkreuz
Roche Diagnostics
F-38240 Meylan
Roche Diagnostics GmbH
D-68298 Mannheim, Germany
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics SpA
Piazza Durante 11
I-20131 Milano
Roche Diagnostics S.L.
E-08006 Barcelona
Distribuidor em Portugal:
Roche Farmacêutica Química, Lda
P-2700 Amadora
C
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy, +49 621 7590
ROCHE, LIGHTCYCLER, MGRADE, FASTSTART, SEPTIFAST, HYBPROBE i AMPERASE są znakami towarowymi firmy Roche.
ROCHE RESPONSE CENTER jest znakiem serwisowym firmy Roche.
Amphotericin B® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Bristol-Myers Squibb Company.
Aquo-Trinitrosan® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Merck & Co., Inc.
ARA-cell® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy cell pharma GmbH.
Arterenol® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Aventis Pharma Ltd.
Cancidas® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy MSD Sharp & Dohme GmbH.
Ciprobay® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Bayer AG.
Dexahexal® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Hexal AG.
Diflucan® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Pfizer Inc.
Fortum® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy GlaxoSmithKline.
Heparin-Natrium-5000-ratiopharm® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy ratiopharm International.
InfectoClont® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Infectopharm GmbH.
LTK-008™ jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy biodelta, ZTB GmbH.
Novalgin® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Aventis Pharma Ltd.
Piperacillin® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Hexal AG.
Refobacin® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Merck & Co., Inc.
Sobelin® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Pfizer Inc.
Tazobac® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Wyeth Pharmaceuticals AG.
Vancomycin® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Lilly Pharma Holding GmbH.
Zienam® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy MSD Sharp & Dohme GmbH.
Zyvoxid® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Pfizer Inc.
© 2005, Roche Molecular Systems, Inc. Wszystkie prawa zastrzeżone.
11/2005
(04623932001-01ENGL)
04822668001-01
12