Testy aktywacji bazofili w diagnostyce pokrzywkowo
Transkrypt
Testy aktywacji bazofili w diagnostyce pokrzywkowo
214 Alergia Astma Immunologia 2010, 15 (4): 214-219 Testy aktywacji bazofili w diagnostyce pokrzywkowoobrzękowej postaci nadwrażliwości na aspirynę Basophil activation tests in diagnostics of patients with aspirin-induced urticaria (AIU) MAGDALENA KUJAWIAK1, ZUZANNA LECH1, JOANNA MAKOWSKA2, BARBARA BIEŃKIEWICZ2, MAREK L. KOWALSKI2, JANINA GRZEGORCZYK1 1 2 Zakład Laboratoryjnej Immunologii Medycznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi Klinika Immunologii, Reumatologii i Alergii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi Badania częściowo finansowane przez Uniwersytet Medyczny w Łodzi w ramach tematu nr 502-13-852 oraz częściowo ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego w ramach stypendium wspierającego innowacyjne badania naukowe doktorantów (nr 505-07-074/WFARM/RNSD/2009) Streszczenie Summary Wprowadzenie. Reakcje nadwrażliwości stanowią około 20-25% wszystkich niepożądanych działań leków, z czego nadwrażliwość na aspirynę (ASA) i inne niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), występuje w około 25% przypadków. Test prowokacyjny to najlepszy i, obok wywiadu jedyny sposób potwierdzenia lub wykluczenia nadwrażliwości na ASA i inne NLPZ. Alternatywnymi metodami diagnostycznymi są testy in vitro. Background. Drug-induced hypersensitivity reactions constitute approx. 20-25% of all adverse drug reactions. Hypersensitivity to non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) occurs in about 25% of the cases. The diagnosis is based only on medical history of a patient and provocation test. In vitro tests are alternative diagnostic methods. Cel. Celem pracy była ocena wpływu aspiryny na ekspresję CD63 na bazofilach krwi obwodowej oraz na uwalnianie histaminy przez bazofile u chorych z pokrzywkowo-obrzękową postacią nadwrażliwości na aspirynę i inne niesteroidowe leki przeciwzapalne (P-O/ASA) w porównaniu do osób zdrowych (OZ) bez nadwrażliwości. Aim. The aim of the study was to evaluate the effect of aspirin and other NSAIDs on CD63 expression on basophils, and on histamine release from peripheral blood basophils in patients with aspirin-induced urticaria (AIU) as compared to healthy individuals. Materiał i metody. Badaniem objęto 20 pacjentów z P-O/ASA oraz 10 osób zdrowych, niewykazujących nadwrażliwości na aspirynę i inne NLPZ. Ocenę ekspresji CD63 przeprowadzono w cytometrze przepływowym. Uwalnianie histaminy w zebranych nadsączach oceniono metodą ELISA. Wyniki. Czułość zmiany ekspresji CD63 na bazofilach w rozpoznaniu nadwrażliwości na aspirynę w stężeniach 1µM, 20µM i 200µM wyniosła odpowiednio: 35,5%, 45% i 45%, natomiast swoistość dla tych samych stężeń ASA wyniosła odpowiednio: 90%, 80% i 60%. Dla wszystkich testowanych stężeń aspiryny z wyjątkiem najwyższego (200µM), jako nieswoiście aktywującego ekspresję CD63, także w grupie kontrolnej osób zdrowych, w oparciu o odpowiedź na przynajmniej 1 stężenie aspiryny, czułość wyniosła 45% a swoistość 80%. Czułość dla testu oceniającego uwalnianie histaminy wyniosła 60%, swoistość natomiast 66,5%. Nie stwierdzono korelacji pomiędzy ekspresją CD63 na bazofilach a uwalnianiem histaminy. Wnioski. Nasze badania wskazują na stosunkowo niską wartość diagnostyczną obu przeprowadzonych testów. Wartość oceny ekspresji CD63 na bazofilach krwi obwodowej wydaje się być wyższa niż wartość oceny uwalniania histaminy. Jednakże test ten może służyć jedynie jako test potwierdzający rozpoznanie, nie zaś rutynowy test diagnostyczny. Material and methods. Twenty patients with the history of AIU and 10 healthy aspirin-tolerant individuals (HAT) were recruited. CD63 expression was analyzed by flow cytometry. Histamine release was measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results. Sensitivity for basophil activation test amounted to 35,5%, 45% and 45% for 1µM, 20µM and 200µM concentrations of aspirin respectively. Specificity amounted to 90%, 80% and 60% respectively. For all concentrations tested, except 200µM ASA which activated basophils in both AIU patients and healthy individuals, considering response to at least one concentration of aspirin, sensitivity amounted to 45% and specificity 80%. Sensitivity for histamine release test amounted to 60% and specificity to 66,5%. There was no correlation between histamine release and CD63 expression on basophils. Conclusions. Our results suggest a relatively low diagnostic value of both tests examined. Basophil activation test seems to be of higher value than of histamine release test. Key words: drug hypersensitivity, aspirin, basophil activation test (BAT), histamine, urticaria Słowa kluczowe: nadwrażliwość na leki, aspiryna, test aktywacji bazofili (TAB), histamina, pokrzywka © Alergia Astma Immunologia 2010, 15 (4): 214-219 www.alergia-astma-immunologia.eu Przyjęto do druku: 30.11.2010 Adres do korespondencji / Address for correspondence Magdalena Kujawiak Zakład Laboratoryjnej Immunologii Medycznej Uniwersytet Medyczny w Łodzi ul. Pomorska 251, 92-213 Łódź e-mail: [email protected] Kujawiak M i wsp. Testy aktywacji bazofili w diagnostyce pokrzywkowo-obrzękowej postaci... 215 Wykaz skrótów: aIgE (highly specific monoclonal antibody recognizing the high affinity IgE binding receptor – Fc epsilon RI) – wysoce swoiste przeciwciała monoklonalne, rozpoznające receptory RI wiążące z dużym powinowactwem immunoglobulinę IgE (Fc epsilon RI) AIU (aspirin-induced urticaria patients) – pacjenci z pokrzywkowo-obrzękową postacią nadwrażliwości na aspirynę, P-O/ASA ASA (acetylsalicylic acid, aspirin) – kwas acetylosalicylowy, aspiryna BAT (basophil activation test) – test aktywacji bazofili, TAB fMLP (formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine) – formylometionylofenyloalanina, formylowany peptyd bakteryjny HAT (healthy aspirin-tolerant individuals) – osoby zdrowe bez nadwrażliwości na aspirynę, OZ NSAIDs (non-steroidal ani-inflammatory drugs) – niesteroidowe leki przeciwzapalne, NLPZ SI (stimulation index) – indeks stymulacji, IS – stosunek odsetka zaktywowanych bazofili po stymulacji aspiryną do odsetka bazofili zaktywowanych w próbie spontanicznej (medium) Wstęp Niepożądane działanie leków jest istotnym problemem klinicznym. Reakcje nadwrażliwości stanowią około 20-25% wszystkich niepożądanych działań leków, dotyczą ponad 7% ogólnej populacji ludzkiej [1,2]. Nadwrażliwość na aspirynę (ASA) i inne niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) występuje w 25% tych przypadków [3-5]. Klasyfikacja nadwrażliwości na NLPZ obejmuje 5 typów reakcji, wśród których można wyróżnić te o podłożu nieimmunologicznym (reakcje krzyżowe) oraz reakcje immunologiczne [6-8]. Do najczęstszych krzyżowych postaci reakcji nadwrażliwości na NLPZ należy pokrzywka zaostrzona przez aspirynę i inne NLPZ [6]. Reakcja ta dotyczy pacjentów z przewlekłą pokrzywką i obrzękiem naczynioruchowym, u których NLPZ są tylko jednym z wielu czynników zaostrzających chorobę. Mechanizm tego typu nadwrażliwości jest nieimmunologiczny, wiąże się natomiast z zahamowaniem przez NLPZ enzymu cyklooksygenazy, co prowadzi do aktywacji komórek zapalnych i uwalniania mediatorów [9]. Pokrzywkowo-obrzękowa postać nadwrażliwości na ASA występuje u 20-40% pacjentów z przewlekłą idiopatyczną pokrzywką [10-12]. Rozpoznanie nadwrażliwości na NLPZ typu krzyżowego opiera się na precyzyjnym wywiadzie oraz wykonywaniu prób prowokacyjnych [13]. Od wielu lat poszukuje się metod laboratoryjnych, mających na celu rozpoznanie i/lub potwierdzenie czynnika sprawczego wywołującego taką reakcję [4,14-18]. Jednym z markerów aktywacji bazofili jest białko błonowe związane z lizozymem CD63 (gp53; LAMP-3), należące do nadrodziny białek transbłonowych (tetraspanin). Białko to występuje na bazofilach, mastocytach, makrofagach i płytkach krwi. W stanie spoczynku glikoproteina zakotwiczona jest w wewnątrzcytoplazmatycznych ziarnistościach, a podczas aktywacji pojawia się na powierzchni badanych komórek po fuzji błon ziarnistości z błoną komórkową [16,19]. W tym czasie dochodzi do procesu degranulacji bazofili, w czasie którego uwalniany jest szereg mediatorów zapalnych, a klasyczny jego wykładnik stanowi histamina [19-22]. Celem pracy była ocena wpływu aspiryny na ekspresję CD63 na bazofilach krwi obwodowej oraz na uwalnianie histaminy przez bazofile u chorych z pokrzywkowo-obrzękową postacią nadwrażliwości na aspirynę i inne niesteroidowe leki przeciwzapalne w porównaniu do osób zdrowych bez nadwrażliwości. MATERIAŁ I METODY Pacjenci Badaniem objęto 20 pacjentów z pokrzywkowo-obrzękową postacią nadwrażliwości na aspirynę (P-O/ASA) oraz 10 osób zdrowych (OZ), niewykazujących nadwrażliwości na aspirynę i inne NLPZ. Grupę pacjentów z P-O/ASA stanowiło 12 kobiet i 8 mężczyzn w wieku 18-68 (średni wiek 44,7 ± 16,1). Chorzy nie przyjmowali glikokortykosteroidów ogólnoustrojowych oraz leków przeciwhistaminowych na co najmniej 72 godziny przed pobraniem krwi. Rozpoznanie P-O/ASA przeprowadzano na podstawie przekonywającego wywiadu: obecności przewlekłej pokrzywki oraz co najmniej 2 reakcji na różne NLPZ w postaci zaostrzenia pokrzywki i/lub obrzęku naczynioruchowego. Grupę kontrolną stanowiło 7 ochotniczek i 3 ochotników w wieku 21-45 (średni wiek 25,7 ± 7,5) tolerujących ASA i inne NLPZ. Materiał i metody Krew od pacjentów pobierano z żyły w zgięciu łokciowym na EDTA. Leukocyty wzbogacone bazofilami pozyskiwano z kożuszka i rozdzielano, następnie inkubowano przez 45 minut z ASA (Aspegic, Francja) w stężeniach 1µM, 20µM, 200µM. Pozytywną kontrolę stanowiły leukocyty inkubowane z aIgE i 10-7M fMLP. Po inkubacji zatrzymywano degranulację bazofili w -20°C przez 5 minut, a następnie próby wirowano, zbierano nadsącza do probówek typu Eppendorf i zamrażano w temp. -20°C do czasu przeprowadzenia analizy oznaczenia histaminy metodą ELISA. 216 Ocena ekspresji markera CD63 na bazofilach krwi obwodowej po stymulacji aspiryną Ekspresję CD63 oceniano, stosując przeciwciała monoklonalne anty-CD63 znakowane fikoerytryną (PE) i anty-IgE wyznakowane izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (zestaw Flow-CAST®, Bühlmann Laboratories AG, Schönenbuch, Szwajcaria). Analizę przeprowadzano w cytometrze przepływowym DAKO Galaxy, zbierając 50000 komórek. Wyniki opracowywano przy zastosowaniu programu komputerowego FlowMax. Za bazofile pobudzone uznawano komórki charakteryzujące się intensywną fluorescencją zarówno PE, jak i FITC, czyli komórki CD63 dodatnie i IgE dodatnie. Ekspresję CD63 w badanych próbach porównywano z ekspresją spontaniczną (komórki inkubowane w medium). Punkt odcięcia dla istotnego wzrostu odsetka zaktywowanych bazofili wyznaczono na podstawie krzywej ROC. Za wyniki dodatnie uznano wszystkie równe lub wyższe wartości 2 indeksu stymulacji (IS≥2) [14,23]. Ocena uwalniania histaminy przez leukocyty krwi obwodowej po stymulacji aspiryną Uwalnianie histaminy oznaczono u wszystkich 20 badanych chorych z P-O/ASA i u 6 z 10 osób zdrowych. W pozyskanych nadsączach z komórek niestymulowanych i stymulowanych aspiryną oznaczono stężenie histaminy metodą immunoenzymatyczną, stosując dostępny na rynku zestaw ELISA (IBL Hamburg, Niemcy). Wyniki podano w ng/ ml. Czułość testu wynosiła 1,3 ng/ml. Analiza statystyczna Analizę statystyczną prowadzono za pomocą programu Statistica 8. Próby porównywano testami nieparametrycznymi. Analizę w obrębie badanych grup wykonano testem Wilcoxona dla prób zależnych. Do analizy różnic między grupami zastosowano test U Manna Whitney’a. W celu oceny zależności między CD63 a uwalnianiem histaminy przeprowadzono analizę korelacji testem Spearmana. Wyniki przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej arytmetycznej SEM. Istotność statystyczną oceniono przy p≤0,05. WYNIKI U pacjentów z P-O/ASA i u osób zdrowych stwierdzono podobną spontaniczną ekspresję markera CD63 na bazofilach krwi obwodowej: 15,13±2,71 (1,39-50,93) wobec 12,17±1,4 (6,54-20,75), (p>0,05). Wpływ stymulacji nieswoistej na ekspresję cząsteczki CD63 na bazofilach krwi obwodowej Po stymulacji aIgE w grupie pacjentów z nadwrażliwością na ASA wartości średnie CD63 wzrosły prawie dwukrotnie. Przed stymulacją wynosiły 15,13±2,71 (1,39-50,93), a po stymulacji 31,82±3,87 (3,17-61,0), (p=0,0002). W tej grupie stwierdzono również znaczący wzrost ekspresji CD63 po stymulacji bazofili fMLP do 27,16±3,71 (8,13-60,82), (p=0,001), (ryc. 1). W grupie kontrolnej osób zdrowych wartości średnie przed stymulacją aIgE wyniosły 12,17±1,4 (6,54-20,75) i wzrosły do 29,08±7,79 (5,71-75,0) po stymulacji bazofili Alergia Astma Immunologia 2010, 15 (4): 214-219 aIgE (p=0,017). W grupie tej nie zaobserwowano istotnego wzrostu ekspresji CD63 po stymulacji fMLP, wartości średnie wyniosły po stymulacji 14,53±2,52 (4,21-33,33), (p>0,05), (ryc. 1). Wpływ aspiryny na ekspresję markera CD63 na bazofilach krwi obwodowej W grupie z P-O/ASA aspiryna w stężeniu 200µM zwiększała istotnie średnią wartość ekspresji CD63 (p=0,021), natomiast w stężeniu 1µM i 20µM nie wpływała na ekspresję markera aktywacji (p>0,05) (ryc. 2). Preinkubacja komórek z aspiryną w stężeniu 1µM, 20µM i 200µM spowodowała istotny (IS>2) wzrost ekspresji CD63 odpowiednio u 7 (35%), 9 (45%) i 9 (45%) z 20 pacjentów z P-O/ASA (tab. I). W grupie kontrolnej ASA w stężeniu 1µM i 20µM nie wpływała istotnie na średnią ekspresję CD63, natomiast stężenie 200µM ASA istotnie nasilało ekspresję CD63 na bazofilach krwi obwodowej, (p<0,047). Spośród 10 badanych osób zdrowych aspiryna, w stężeniu 1µM, 20µM i 200µMILES, odpowiednio u 1, 2 i 4 z nich istotnie nasiliła ekspresję CD63 na bazofilach (IS>2) (tab. I). Porównanie indeksów stymulacji wykazało podobny wzrost ekspresji w obu grupach badanych odpowiednio dla każdego ze stężeń aspiryny (ryc. 3). Czułość i swoistość testu do oceny ekspresji CD63 na bazofilach krwi obwodowej Obliczając czułość i swoistość testu, wykluczono najwyższe stężenie aspiryny (200µM), które pobudzało bazofile zarówno u osób zdrowych, jak i chorych. Czułość testu dla rozpoznania nadwrażliwości na aspirynę w stężeniach 1µM, 20µM wyniosła odpowiednio 35,5% i 45%, natomiast swoistość dla tych samych stężeń ASA – odpowiednio 90% i 80%. W oparciu o odpowiedź na przynajmniej 1 stężenie aspiryny czułość wyniosła 45%, a swoistość 80%. Wpływ aspiryny na uwalnianie histaminy przez bazofile krwi obwodowej u pacjentów z pokrzywkowo-obrzękową postacią nadwrażliwości na ASA i osób zdrowych Istotne uwalnianie histaminy pod wpływem aspiryny, w zależności od stężenia (1µM, 20µM, 200µM), zaobserwowano odpowiednio u 4, 11 i 8 z 20 pacjentów z pokrzywkowo-obrzękową postacią nadwrażliwości na ASA oraz u 1, 2 i 4 osób zdrowych spośród 6, u których oznaczono stężenie histaminy. W grupie pacjentów P-O/ASA wartości średnie po stymulacji kolejnymi stężeniami aspiryny 1µM, 20µM, 200µM wyniosły odpowiednio: 0,56±0,32 (0-5,74); 1,26±0,29 (0-3,83); 0,92±0,29 (0-3,86) w porównaniu do ekspresji spontanicznej 0,59±0,29 (0-4,57). W grupie osób zdrowych wartości średnie po stymulacji aspiryną w stężeniu 1µM, 20µM, 200µM wyniosły odpowiednio: 0,81±0,81 (0-4,87); 1,54±1,06 (0-6,18); 2,60±0,97 (0-5,59) w porównaniu do ekspresji spontanicznej 0,41±0,41 (0-2,45. Nie wykazano istotnego statystycznie wpływu aspiryny na uwalnianie histaminy (p>0,05). Kujawiak M i wsp. Testy aktywacji bazofili w diagnostyce pokrzywkowo-obrzękowej postaci... Czułość i swoistość testu do oceny uwalniania histaminy przez bazofile krwi obwodowej Czułość testu dla aspiryny w stężeniach 1µM, 20µM i 200µM wyniosła odpowiednio: 20%, 55% i 40%, swoistość testu dla tych samych stężeń ASA – odpowiednio: 83,3%, 66,6% i 33,3%. Dla wszystkich testowanych stężeń aspiryny z wyjątkiem najwyższego (200µM), jako nieswoiście aktywującego ekspresję CD63, także w grupie kontrolnej osób zdrowych, w oparciu o odpowiedź na przynajmniej 1 stężenie aspiryny, czułość wyniosła 60%, swoistość 66,5%. 217 Nie stwierdzono korelacji między uwalnianiem histaminy a ekspresją markera CD63 w obu badanych grupach (p>0,05). DYSKUSJA Standardem postępowania w diagnostyce krzyżowych postaci nadwrażliwości na ASA i inne NLPZ jest wywiad, poparty w uzasadnionych przypadkach testem prowokacyjnym [23]. Wykonywanie prób prowokacyjnych jest pracochłonne oraz obarczone ryzykiem ciężkiej, uogólnionej reakcji. Nie u wszystkich pacjentów wykonanie takich prób jest możliwe, a w wielu przypadkach ocena reakcji nie jest w pełni obiektywna. Trwają zatem poszukiwania nowych testów diagnostycznych. Proponowano testy komórkowe, takie jak: test aktywacji bazofili, test uwalniania histaminy, Tab. I. Indywidualne wyniki indeksu stymulacji (IS) w teście aktywacji bazofili (TAB) pacjentów z pokrzywkowo-obrzękową postacią nadwrażliwości na ASA (P-O/ASA) i osób zdrowych (OZ) po aspirynie. Wytłuszczono wyniki IS≥2. Ryc.1. Zmiany ekspresji CD63 na bazofilach u pacjentów z pokrzywkowo-obrzękową postacią nadwrażliwości na ASA (P-O/ASA) oraz osób zdrowych (OZ) po stymulacji anty-IgE i fMLP a) pacjenci z P-O/ASA b) osoby zdrowe Ryc.2. Zmiany ekspresji CD63 na bazofilach u pacjentów z pokrzywkowo-obrzękową postacią nadwrażliwości na ASA (P-O/ASA) oraz osób zdrowych (OZ) po stymulacji aspiryną w trzech stężeniach (1µM, 20µM, 200µM) a) pacjenci z P-O/ASA b) osoby zdrowe Ryc. 3. Zmiany indeksu stymulacji po aspirynie u pacjentów z pokrzywkowo-obrzękową postacią nadwrażliwości na ASA (P-O/ASA) w porównaniu do osób zdrowych (OZ) Pacjenci z P-O/ASA n=20 Osoby zdrowe n=10 Stężenie aspiryny l.p. 1µM 20µM 200µM 1µM 20µM 200µM 1 3,97 3,61 6,80 0,11 0,09 1,31 2 3,93 4,18 3,92 0,11 0,16 0,44 3 2,11 2,48 1,91 1,15 1,75 3,98 4 1,91 3,58 0,17 1,15 1,14 2,17 5 3,57 2,94 2,20 0,51 0,43 1,60 6 4,22 10,48 10,05 0,26 0,58 0,97 7 11,85 11,66 27,73 2,47 2,68 1,55 8 1,94 2,16 4,74 1,25 2,32 2,36 9 0,57 0,74 2,45 0,90 0,91 1,84 10 2,13 3,94 2,75 0,95 0,57 2,87 11 0,63 0,45 2,18 12 1,77 1,84 1,70 . . . 13 0,93 0,97 0,54 . . . 14 0,99 0,80 1,65 . . . 15 0,27 0,54 0,52 . . . 16 0,76 1,32 0,82 . . . 17 0,13 0,09 0,08 . . . 18 0,47 0,53 0,90 . . . 19 0,31 0,33 0,90 . . . 20 0,38 0,35 0,63 . . . 218 Alergia Astma Immunologia 2010, 15 (4): 214-219 testy do oznaczeń kwasu 15-HETE, leukotrienów cysteinylowych) do diagnostyki nadwrażliwości na ASA i inne NLPZ [14,17,24,25]. W ciągu ostatnich kilku lat prowadzone są badania nad możliwością wprowadzenia do diagnostyki laboratoryjnej testu aktywacji bazofili (ocena ekspresji cząsteczki CD63), którego zastosowanie opisano już wcześniej u pacjentów z alergią na alergeny powietrzno-pochodne [15], jady owadów błonkoskrzydłych [26] i lateks [19]. Wyniki naszych badań wskazują, iż mimo braku istotnych statystycznie różnic w średnich wartościach spontanicznej ekspresji CD63 na bazofilach, wyniki u 8 z 20 chorych z pokrzywkowo-obrzękową postacią nadwrażliwości na ASA znacznie odbiegają od średnich wartości i są wyraźnie wyższe. Jednakże stwierdzony wzrost ekspresji CD63 pod wpływem nieswoistego czynnika fMLP w grupie chorych z pokrzywkowo-obrzękową postacią nadwrażliwości na ASA sugeruje większą podatność komórek na aktywację w porównaniu do komórek pozyskanych od osób zdrowych i w wątpliwość podaje swoistość odpowiedzi na ASA u tych chorych. Na zwiększoną reaktywność komórek w tej grupie zwrócili także uwagę inni badacze [5,14]. Po ekspozycji na 200µM ASA wzrosła ekspresja markera CD63 zarówno w grupie chorych z pokrzywkowo-obrzękową postacią nadwrażliwości na ASA, jak i osób zdrowych, dlatego też stężenie to nie zostało uwzględnione przy ocenie nadwrażliwości w teście aktywacji bazofili. Niższe stężenia ASA (1µM, 20µM) wykazywały swoistość (80%) w stosunku do chorych z P-O/ASA. Czułość testu wyniosła 45%. A zatem wynik ujemny testu nie może wykluczyć obecności nadwrażliwości, dodatni rezultat natomiast może być dobrym potwierdzeniem rozpoznania. Dla porównania – czułość tego testu u innych badaczy wahała się w granicach 36,6-45,45%, a swoistość wynosiła 100% [4,14,24,25]. Różnice te mogą być spowodowane wyznaczeniem innej wartości punktu odcięcia, według której wynik jest uznawany za dodatni (w naszych badaniach wszystkie wyniki IS≥2 uznane zostały za dodatnie). Sanz i wsp. oraz RodrigueezTrabado i wsp. stosowali podobną wartość odcięcia [4,24], sugerując również, iż na zaniżenie czułości może wpływać czas od ostatniej reakcji przed wykonanym testem TAB. Za optymalny czas, w którym badanie powinno być wykonane przyjęto 6-12 miesięcy od ostatniej reakcji na lek. Boumiza i wsp. wnioskują, że może inny marker, np. CD203c, mógłby być bardziej przydatny diagnostycznie i dawać większą czułość [25,27]. Zastosowanie w jednym badaniu kombinacji przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko cząsteczce CD63 oraz przeciwko CD203c (innemu rekomendowanemu markerowi bardziej swoistemu dla bazofili) wydaje się zasadne do przetestowania w przyszłości. Wskazane zdaje się także zastosowanie w TAB innych niesteroidowych leków przeciwzapalnych do oceny nadwrażliwości na NLPZ. Nasze badania wskazują na wyższą czułość i swoistość testu w oparciu o wykorzystanie innych NLPZ obok aspiryny [28]. Podczas aktywacji bazofili (której wyznacznikiem jest pomiar takiego markera jak CD63) dochodzi do procesu degranulacji, w wyniku którego uwolniona zostaje m.in. histamina. Wielu badaczy wskazuje na korelację pomiędzy ekspresją CD63 a uwalnianiem histaminy z bazofili [22,29-31]. Nasze badania nie potwierdziły takiej korelacji. Oznaczenie uwalniania histaminy z uwagi na stosunkowo niską czułość (60%), a przede wszystkim niską swoistość (66,5%), nie ma dużej wartości diagnostycznej. Wniosek ten zgodny jest to z obserwacjami Demoly i wsp., którzy uzyskali podobne wyniki dla różnych leków – czułość 51,4% i swoistość 63% [21]. Wcześniejsze doniesienia o wpływie aspiryny na uwalnianie histaminy wskazują, że zależnie od zastosowanego stężenia leku w badaniu in vitro lek ten może zwiększać uwalnianie mediatora lub nie oddziaływać na nie znacząco [32]. Większą wartość testu przedstawiono w diagnostyce alergii pokarmowej, alergii na jady i pyłki traw [18,33]. Oznaczenie poziomu sulfidoleukotrienów (sLT) czy prostaglandyny E2 także nie daje, jak dotąd, zadowalających rezultatów w diagnostyce nadwrażliwości na ASA [4,5,14,29]. Podsumowując, nasze badania wskazują na stosunkowo niską wartość diagnostyczną obu przeprowadzonych testów. Wartość oceny ekspresji CD63 na bazofilach krwi obwodowej wydaje się być wyższa niż ocena uwalniania histaminy, co potwierdzają inni badacze [25]. Test ten może jednak służyć wyłącznie jako test potwierdzający rozpoznanie, a nie jako rutynowy test diagnostyczny. Piśmiennictwo 1. Kasper Ł, Sładek K, Bochenek G, Duplaga M, Szczeklik A. Czestość występowania nadwrażliwości na niesteroidowe leki przeciwzapalne w populacji osób dorosłych na astmę w Polsce – badanie epidemiologiczne. Pneumonol Alergol Pol 2009, 77: 431-439. 2. Gomes ER, Demoly P. Epidemiology of hypersensitivity drug reactions. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005, 5: 309-316. 3. Faich GA. Adverse drug reaction monitoring. N Engl Med 1986, 314: 1589-1592. 4. Sanz ML, Gamboa P, De Weck AL. A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sylfidoleukotriens is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Int Arch Allergy Immunol 2005, 136: 58-72. 5. De Weck AL, Sanz ML, Gamboa PM, Aberer W, Blanca M, Correia S, Erdman S, Jermann JM, Kanny G, Kowalski M, Mayorga L, Medrala W, Merk A, Sturm GJ, Sainte-Laudy J, Schneider MS, Szczeklik A, Weber JM, Wedi A, nad members of the ENDA group. Nonsteroidal anti-inflammatory drug hypersensitivity syndrome. A multicenter study. I. Clinical findings and in vitro diagnosis. J Invest Clin Immunol 2009, 19(5): 355-369. 6. Kowalski ML, Makowska J, Blanca M, Bavbek S, Bochenek G, Bousquet J, Bousquet P, Celik G, Demoly P, Rebelo Gomes E, Nizankowska-Mogilnicka E, Romano A, Sanchez-Borges M, Sanz M, Torres MJ, De Weck A, Szczeklik A, Brockow K. Hypersensitivity to Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs) – classification, diagnosis and management. Review of the EAACI/ENDA and GA2LEN/HANNA. Allergy 2010 (w druku). 7. Stevenson DD, Sanchez-Borges M, Szczeklik A. Classification of allergic and pseudoallergic reactions to drugs that inhibit cyclooxygenase enzymes. Ann. Allergy Asthma Immunol. 2001, 87: 177-180. 8. Sánchez-Borges M, Capriles-Hulett A, Caballero-Fonseca F. The multiple faces of nonsteroidal anti-inflammatory drug hypersensitivity. J Invest Allergol Clin Immunol 2004, 14(4): 329-334. Kujawiak M i wsp. Testy aktywacji bazofili w diagnostyce pokrzywkowo-obrzękowej postaci... 219 9. Szczeklik A, Gryglewski RJ, Czerniawska-Mysik G, Zmuda A. Aspirininduced asthma. Hypersensitivity to fenoprofen and ibuprofen in relation to their inhibitory action on prostaglandin generation by different microsomal enzymic preparations. J Allergy Clin Immunol. 1976; 58: 10-18. 23. Bateman ED, Hurd SS, Barnes PJ, Bousquet J, Drazen JM, FitzGerald M, Gibson P, Ohta K, O’Byrne P, Pedersen, Pizzichini E, Sullivan SD, Wenzel SE and Zar HJ. Global strategy for asthma management and prevention: GINA executive summary. Eur Respir J 2008; 31: 143-178. 10. Czarnecka-Operacz M. Diagnostyka i leczenie pokrzywki. Alergia 2008, 2: 5-10. 24. 11. Sánchez-Borges M, Capriles-Hulett A, Caballero-Fonseca F. NSAID-indiced urticaria and angioedema. A reappraisal of its clinical management. Am J Clin Dermatol 2002, 3(9): 599-607. Rodríguez-Trabado A, Camara-Hijón C, Ramoso-Cantarińo A, Parcel-Carreńo SL, Jiménez-Timón S, Pereira-Navarro G, Hernández-Arbeiza FJ, Fernández-Pereira L. Basophil activation test for the in vitro diagnosis of nonsteroidal anti-inflammatory drug hypersensitivity. Allergy Asthma Proc 2008, 29: 241-249. 12. Mastalerz L, Setkowski M, Sanak M, Szczeklik A. Hypersensitivity to aspirin: common eicosanoid alterations in urticaria and asthma. J. Allergy Clin. Immunol 2004, 113: 771-775. 25. Boumiza R, Debard AL, Monneret G. The basophil activation test by flow cytometry: recent developments in clinical studies, standardization and emerging perspectives. Clin Mol Allergy 2005, 3: 9. 13. Szczeklik A, Niżankowska-Mogilnicka E, Sanak M. Hypersensitivity to aspiryn and Rother NSAIDs: mechanisms, clinical presentation and management. Pichler WJ (ed): Drug hypersensitivity. Basel, Karger, 2007, 340-349. 26. Sainte-Laudy J, Sabbah A, Drouet M, Lauret MG, Loiry M. Diagnosis of venom allergy by flow cytometry. Correlation with clinical history, skin tests, specific IgE, histamine and leukotriene C4 release. Clin Exp Allergy 2000, 30: 1166-71. 14. Gamboa P, Sanz ML, Caballero MR, Urrutia I, Antépara I, Esparza R, De Weck AL. The flow-cytometric determination of basophil activation induced by aspirin and other non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) is useful for in vitro diagnosis of the NSAID hypersensitivity syndrome. Clin Exp Allergy 2004, 34: 1448-1457. 27. Sanz ML, Gamboa PM, Mayorga C. Basophil activation tests in the evaluation of immediate drug hypersensitivity. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2009, 9: 298-304. 28. Kujawiak M, Lech Z, Makowska J, Bieńkiewicz B, Kowalski ML, Grzegorczyk J. Wpływ niesteroidowych leków przeciwzapalnych na aktywację bazofili u chorych z pokrzywkowo-obrzękową postacią nadwrażliwości na aspirynę i osób zdrowych. Alergia Astma Immunologia; 2010; 15(s1.2): 55. 29. Sanz ML, Gamboa PM, De Weck AL. Cellular tests in the diagnosis of drug hypersensitivity. Current Pharmaceutical Design 2008, 14: 2803-2808. 30. De Weck AL, Sanz ML, Gamboa PM, Aberer W, Bienvenu J, Blanca M, Demoly P, Ebo DG, Mayorga L, Monneret G, Sainte-Laudy J. Diagnostic Tests Based on Human Basophils: More Potentials and Perspectives than Pitfalls. Int Arch Allergy Immunol 2008, 146: 177189 31. Knol EF, Mul FP, Jansen H, Calafat J, Roos D. Monitoring human basophil activation via CD63 monoclonal antibody 435. J Allergy Clin Immunol 1991, 88: 328-338. 32. Marone G, Kagey-Sobotka A, Lichtenstein LM. Effects of arachidonic acid and its metabolites on antigen-induced histamine release from human basophils in vitro. J Immunol 1979, 123(4): 16691677. 33. Li TM, Kontis KJ, Rance F, Abbal M, Vuitton DA. Clinical evaluation of a new fully automated enzyme immunoassay for basophil histamine release in whole blood. Inflamm Res 2000, 49(Suppl 1): S49-50. 15. 16. 17. Sanz ML, Sánchez G, Gamboa PM, Vila L, Uasuf C, Chazot M, Diéguez I, De Weck AL. Allergen-induced basophil activation: CD63 cell expression detected by flow cytometry in patients allergic to Dermatophagoides pteronyssinus and Lolium perenne. Clin Exp Allergy 2001, 31: 1007-1013. Ebo DG, Sainte-Laudy J, Bridts CH, Mertens CH, Hagendorens MM, Schuerwegh AJ, de Clerck LS, Stevens WJ. Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives. Allergy 2006, 61 (9): 1028-1039. Kowalski ML, Ptasinska A, Jedrzejczak M, Bienkiewicz B, Cieslak M, Grzegorczyk J, Pawliczak R, Dubuske L. Aspirin-triggered 15-HETE generation in peripheral blood leukocytes is a specific and sensitive Aspirin-Sensitive Patients Identification Test (ASPITest). Allergy 2005, 60(9): 1139-45. 18. Crockard AD, Ennis M. Basophil histamine release tests in the diagnosis of allergy and asthma. Clin Exp Allergy 2001, 31: 345-350. 19. Sainte-Laudy J, Vallon C, Guerin JC. Diagnosis of latex allergy: comparison of histamine release and flow cytometric analysis of basophil activation. Inflamm Res 1996, 45(1): S35-S36. 20. Jutel M, Blaser K, Akdis CA. Histamine in chronic allergic responses. J Invest Clin Immunol 2005, 15(1): 1-8. 21. Demoly P, Lebel B, Messaad D, Sahla H, Rongier M, Daurčs JP, Godard P, Bousquet J. Predictive capacity of histamine release for the diagnosis of drug allergy. Allergy 1999, 54: 500-506. 22. Kleine-Tebbe J, Erdmann S, Knol EF, MacGlashan DW, Paulsen LK, Gibbs BF. Diagnostic tests based on human basophils: potentials, pitfalls and perspectives. Int Arch Allergy Immunol 2006, 141: 79-90.