Wpływ bupiwakainy na żywotność komórek macierzystych krwi

Perinatologia, Neonatologia i Ginekologia, tom 6, zeszyt 4, 215-219, 2013
Wpływ bupiwakainy na żywotność komórek macierzystych
krwi pępowinowej in vitro – badanie pilotowe
KAROLINA KULIŃSKA1, MACIEJ KURPISZ2, KRZYSZTOF SAWIŃSKI3, KATARZYNA CZERNIAK1,
STEFANIA BURKOWSKA4, HANNA BILLERT1
Streszczenie
Bupiwakaina, anestetyk lokalny stosowany powszechnie w celu uśmierzenia bólu porodowego przechodzi do krążenia
płodowego i może wywierać efekty biologiczne. Nie wiadomo jednak, czy ma zdolność modyfikowania żywotności
komórek macierzystych krwi pępowinowej. Celem badania była ocena wpływu bupiwakainy oraz anestetyku referencyjnego, lidokainy, na żywotność komórek macierzystych krwi pępowinowej in vitro. Z krwi pępowinowej izolowano
komórki jednojądrowe (MNC). Następnie metodą cytometrii przepływowej identyfikowano komórki macierzyste o fenotypie CD34+CD133+ oraz CD34+CD133! oraz oceniano apoptozę i nekrozę przy użyciu aneksyny V oraz 7-aminoaktynomycyny (7-AAD). Wykazano wzrost ilości komórek wczesnoapoptotycznych w subpopulacjach komórek macierzystych CD34+CD133+ oraz CD34+CD133! pod wpływem bupiwakainy w stężeniach odpowiednio 0,05 mM oraz 1 mM.
W najniższym stężeniu istotnym klinicznie bupiwakaina nie wpływała na żywotność komórek macierzystych. Lidokaina nie modyfikowała ich żywotności w żadnym z użytych stężeń. Wniosek: Bupiwakaina w stężeniu istotnym klinicznie nie wpływa na żywotność komórek macierzystych krwi pępowinowej in vitro.
Kluczowe słowa: anestetyki lokalne, komórki macierzyste, cytotoksyczność, krew pępowinowa
Wstęp
Blokady centralne, w tym blokada zewnątrzoponowa,
stanowią „złoty standard” analgezji porodu, będąc najskuteczniejszymi i bezpiecznymi metodami walki z bólem
porodowym. Środki podawane matce do przestrzeni zewnątrzoponowej, m.in. anestetyki lokalne, przechodzą do
jej krążenia układowego i, dyfundując przez łożysko, także
do krążenia płodu. Do najczęściej stosowanych należy bupiwakaina. Wyjaśnienia wymaga bezpośredni wpływ tych
środków na komórki dziecka [1, 2].
Anestetyki lokalne, poza efektem analgetycznym związanym z czasowym blokowaniem przewodzenia w komórkach nerwowych, już w niskich stężeniach istotnych klinicznie wywołują szereg efektów alternatywnych oraz
cytotoksycznych. Wykazano zdolność tych środków,
w tym bupiwakainy, do indukowania śmierci komórek,
szczególnie procesu apoptozy, który reprezentując rodzaj
śmierci programowanej ma kluczowe znacznie dla zachowania homeostazy ustroju [3]. Efekty propapototyczne
udokumentowano m.in. w komórkach mięśniowych, nerwowych, limfocytach i chondrocytach już w niskich stężeniach istotnych klinicznie [4-6]. Okazuje się też, że środki
znieczulenia miejscowego, w tym także bupiwakaina, mogą działać toksycznie na komórki macierzyste, kluczowe
dla proliferacji tkanek i znajdujące w medycynie coraz
więcej zastosowań [7]. Ostatnio pojawiły się sugestie dotyczące indukcji apoptozy komórek macierzystych w wyni-
ku ekspozycji na anestetyki lokalne [8-10]. Nie wiadomo
jednak, czy leki te, zwłaszcza stosowane w anestezjologii
położniczej, indukują apoptozę w komórkach macierzystych krwi pępowinowej.
Bankowanie krwi pępowinowej jako źródła komórek
macierzystych i progenitorowych do transplantacji stanowi atrakcyjną alternatywę dla komórek macierzystych
szpiku i krwi obwodowej [11].
Wśród komórek macierzystych i progenitorowych
krwi pępowinowej można wyodrębnić kilkadziesiąt subpopulacji zróżnicowanych fenotypowo i czynnościowo. Do
mniej zróżnicowanych należą komórki o fenotypie CD34+
CD133+ (bardzo małe komórki o charakterze embrionalnym oraz młodsze formy progenitorów endotelialnych
i hematopoetycznych), fenotyp CD34+CD133! charakteryzuje komórki wyżej zróżnicowane (progenitory endotelialne i hematopoetyczne) [12, 13]. Krew pępowinowa jest
łatwo dostępna w dużych ilościach na całym świecie,
a ryzyko odrzucenia przeszczepu komórek macierzystych
pochodzących z krwi pępowinowej jest niższe w porównaniu z komórkami pochodzącymi ze szpiku (m.in.
w związku z niższą ekspresją antygenu HLA-DR w porównaniu ze szpikiem) [11]. Okazuje się, że czynniki położnicze mogą w pewnym stopniu wpływać na charakterystykę biologiczną krwi pępowinowej i jej przydatność do
celów transplantologicznych [14]; problem znieczulenia
nie był jak dotychczas poruszany. Istnieje zatem koniecz-
1
Zakład Anestezjologii Doświadczalnej, Katedra Anestezjologii i Intensywnej Terapii, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
2
Zakład Biologii Rozrodu i Komórek Macierzystych, Instytut Genetyki Człowieka PAN, Poznań
3
Klinika Hematologii i Transplantacji Szpiku, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
4
Oddział Porodowy Ginekologiczno-Położniczego Szpitala Klinicznego, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
216
K. Kulińska, M. Kurpisz, K. Sawiński, K. Czerniak, S. Burkowska, H. Billert
ność zbadania wpływu środków anestetycznych podawanych matce w czasie porodu na żywotność komórek
macierzystych krwi pępowinowej.
Celem projektu była ocena wpływu bupiwakainy na
żywotność komórek macierzystych krwi pępowinowej
o fenotypie CD34+ CD133+ oraz CD34+CD133- in vitro.
Materiał i metody
Badania zostały przeprowadzone na komórkach krwi
pępowinowej (n = 6) pobranej od dzieci urodzonych fizjologicznie, których dobrostan został oceniony na > 8 punktów w skali Apgar.
Izolację komórek jednojądrowych (MNC) przeprowadzono według procedury wirowania w gradiencie gęstości
z wykorzystaniem preparatu Gradisol L (Aqua-Med).
Wyizolowane komórki poddano czterogodzinnej inkubacji (37EC, 5% CO2) z bupiwakainą i lidokainą jako anestetykiem referencyjnym w stężeniach odpowiednio: 1: 0,005;
0,0005 mM oraz 4: 0,02; 0,002 mM. Najniższe zastosowane
stężenie bupiwakainy odpowiadało wartościom występującym we krwi pępowinowej w warunkach analgezji zewnątrzoponowej porodu [2]. Wartości stężeń lidokainy były
czterokrotnie wyższe, odpowiadając różnicom w efekcie
farmakologicznym [15].
Identyfikację komórek macierzystych przeprowadzono w cytometrze przepływowym (FACS Canto II, BD)
z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych : CD34-PE
oraz anty CD133-APC (Miltenyi). Ocenę apoptozy oraz
nekrozy przeprowadzono z zastosowaniem barwienia błon
komórkowych aneksyną V skoniugowaną z FITC (Pharmingen, BD) oraz jąder komórkowych 7-AAD (Pharmingen,
BD). Aneksyna V wiąże się z fosfatydyloseryną – fosfolipidem błonowym, który we wczesnym stadium apoptozy
ulega przeniesieniu z warstwy wewnętrznej do warstwy
zewnętrznej błony komórkowej. 7-AAD wnika do jąder komórek późnoapoptotycznych oraz nekrotycznych interkalując DNA i wykazując emisję światła fluorescencji w zakresie możliwym do oceny za pomocą cytometru przepływowego. Komórki żywe i wczesnoapoptotyczne posiadające nienaruszoną błonę komórkową nie przyjmują
7-AAD [3].
Uzyskane wyniki przedstawiono jako medianę i rozstęp interkwartylowy sześciu niezależnych eksperymentów. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu
programu Statistica10.0. Do oceny wpływu anestetyków na
komórki wykorzystano test kolejności par Wilcoxona,
w analizie różnic żywotności między badanymi subpopulacjami w próbie kontrolnej zastosowano test Manna-Whitneya. Poziom istotności p < 0,05.
Wyniki
Komórki macierzyste stanowiły 0,5-2,5% populacji komórek MNC. W ocenie cytometrycznej wyodrębniono
dwie subpopulacje komórek o fenotypie CD34+CD133+
oraz CD34+CD133! (ryc. 1).
Ryc. 1. Wyodrębnienie subpopulacji komórek macierzystych
o fenotypie CD34+CD133+ oraz CD34+CD133! w puli komórek MNC
przy użyciu cytometru przepływowego
Ryc. 2. Ocena apoptozy w komórkach macierzystych CD34+
CD133+(A) oraz CD34+CD133-(B). Barwienie aneksyną V-FITC
oraz 7-AAD. AneksynaV-/7-AAD- (lewy dolny kwadrat) – komórki
żywe; aneksynaV+/7-AAD- (prawy dolny kwadrat) – komórki
wczesnoapoptotyczne; aneksynaV+/7-AAD+ (prawy górny kwadrat) – komórki późnoapoptotyczne; aneksynaV-/7-AAD+ (lewy
górny kwadrat) – komórki nekrotyczne
217
Wpływ bupiwakainy na żywotność komórek macierzystych krwi pępowinowej in vitro
Tabela 1. Wpływ bupiwakainy i lidokainy na żywotność komórek macierzystych: A) o fenotypie CD34+CD133+;
B) o fenotypie CD34+CD133!CD34+CD133+
A. CD34+CD133+
Stężenie anestetyku [mM]
Żywotność
komórek
0
Lidokaina
Bupiwakaina
0.0005
0.005
1
0.002
0.02
4
Żywe [%]
82,4
(52,6-93,7)
81,7
(57,0-94,3)
74,8
(42,5-86,3)
65,2
(46,4-91,5)
73,4
(57,9-83,2)
73,3
(64,1-85,3)
74,7
(54,5-82,3)
Wczesna
apoptoza
[%]
17,5
(5,6-46,4)
18,1
(5,4-42,1)
25,1*
(12,7-57,3)
34,7
(8,0-53,5)
25,9
(16,3-42,1)
26,6
(13,8-34,8)
25,0
(17,2-45,4)
Późna
apoptoza
[%]
0,3
(0,1-0,9)
0,3
(0,2-0,9)
0,1
(0,0-0,4)
0,2
(0,0-0,3)
0,2
(0,0-0,5)
0,5
(0,1-1,0)
0,4
(0,2-0,6)
Nekroza
[%]
0,3
(0,0-0,6)
0,1
(0,0-0,2)
0,0
(0,0-0,2)
0,0
(0,0-0,0)
0,0
(0,0-0,1)
0,1
(0,0-0,3)
0,0
(0,0-0,1)
B. CD34+CD133!
Żywotność
komórek
Stężenie anestetyku [mM]
0
Bupiwakaina
Lidokaina
0.0005
0.005
1
0.002
0.02
4
Żywe [%]
74,9
(56,4-90,4)
74,4
(58,5-91,3)
74,0
(49,8-87,5)
65,1
(45,7-90,6)
70,1
(61,4-85,7)
72,9
(63,3-85,2)
71,6
(51,5-83,2)
Wczesna
apoptoza
[%]
22,6
(6,2-34,6)
22,4
(7,0-38,4)
23,5
(7,8-46,8)
33,1**
(7,7-49,2)
25,2
(8,5-35,6)
25,8
(7,1-30,0)
25,5
(14,1-41,1)
Późna
apoptoza
[%]
1,9
(1,5-2,7)
1,9
(0,6-3,0)
2,4
(0,4-3,4)
1,9
(1,5-4,7)
2,4
(1,8-2,9)
2,0
(0,6-3,5)
2,4
(0,7-4,9)
Nekroza
[%]
0,9
(0,0-6,5)
0,7
(0,1-2,6)
0,3
(0,1-2,4)
0,1
(0,0-0,7)
0,3
(0,0-4,9)
0,5
(0,0-5,5)
1,5
(0,3-2,7)
Ocena wpływu bupiwakainy i lidokainy w sześciu niezależnych eksperymentach. Mediana (rozstęp interkwartylowy). Test kolejności
par Wilcoxona – porównanie par zmiennych: wartości kontrolnej bez dodatku anestetyku z wartościami uzyskanymi po inkubacji
z poszczególnymi stężeniami anestetyków;*p = 0,028; **p = 0,046.
Dzięki barwieniu aneksyną V oraz 7-AAD uzyskano
w obrębie każdej subpopulacji: komórki żywe niewybarwione ani aneksyną V, ani 7-AAD; wczesnoapoptotyczne
– wybarwione aneksyną V, ale niewybarwione 7-AAD; późnoapoptotyczne – wybarwione aneksyną V i 7-AAD; oraz
nekrotyczne wybarwione wyłącznie 7-AAD (ryc. 2).
Bardziej zróżnicowane komórki progenitorowe CD34+
CD133! charakteryzowały się wyższym odsetkiem komórek późnoapoptotycznych w kontroli w porównaniu z populacją komórek mniej zróżnicowanych CD34+CD133+
(1,9 vs. 0,3; Mann-Whitney; p < 0,005).
Wyniki sześciu niezależnych eksperymentów wskazują na istotny statystycznie (p < 0,05) wzrost odsetka
komórek aneksyno-dodatnich w obu badanych subpopulacjach pod wpływem bupiwakainy. W komórkach o fenotypie CD34+ CD133+ indukcję wczesnej apoptozy obserwowano pod wpływem bupiwakainy w stężeniu 0,05 mM
(25% vs 17% w przypadku komórek kontrolnych, test kolejności par Wilcoxona p = 0,046; tab. 1a).
W puli komórek CD34+CD133! wyższy odsetek komórek w stadium wczesnej apoptozy stwierdzono przy
zastosowaniu stężenia 1 mM (33% vs 22% w przypadku
komórek kontrolnych, test kolejności par Wilcoxona,
p = 0,028; tab. 1b). Lidokaina w żadnym z użytych stężeń
nie wywoływała istotnych zmian w żywotności komórek
(tab. 1a, b). Stężenia kliniczne obu badanych anestetyków
lokalnych nie wpływały w sposób istotny na żywotność
komórek macierzystych in vitro (tab. 1a, b).
Dyskusja
W ramach przeprowadzonych badań pilotowych in
vitro zaobserwowaliśmy proapoptotyczny wpływ bupiwakainy na komórki macierzyste krwi pępowinowej, zarówno
w odniesieniu do subpopulacji komórek bardziej, jak
i mniej zróżnicowanych.
W wyniku ekspozycji na bupiwakainę w stężeniu 0,05 mM
(tj. dziesięciokrotnie wyższym od stężeń obserwowanych
u płodu i noworodka w warunkach klinicznych) dochodziło do zwiększenia odsetka komórek aneksyno-dodatnich w subpopulacji CD34+CD133+ (tab. 1a), natomiast
w przypadku komórek bardziej zróżnicowanych, CD34+
CD133!, efekt ten zaobserwowaliśmy w stężeniu 1 mM
218
K. Kulińska, M. Kurpisz, K. Sawiński, K. Czerniak, S. Burkowska, H. Billert
(tab. 1b). Powyższe wyniki mogłyby wskazywać na większą podatność mniej zróżnicowanych form komórek macierzystych na indukcję apoptozy wywołaną bupiwakanią.
Lidokaina natomiast we wszystkich zastosowanych stężeniach (równopotencjalnych w odniesieniu do bupiwakainy) pozostawała bez wpływu na żywotność komórek macierzystych krwi pępowinowej (tab. 1a, b).
Najniższe stężenia anestetyków, które w warunkach
klinicznych obserwuje się we krwi pępowinowej podczas
znieczulenia zewnątrzoponowego porodu nie wywoływały
efektów biologicznych w odniesieniu do komórek macierzystych (tab. 1a, b).
Na temat toksycznego wpływu anestetyków lokalnych
na komórki macierzyste istnieje bardzo niewiele informacji. Powszechnie stosowane w warunkach klinicznych
anestetyki amino-amidowe bupiwakaina, ropiwakaina i lidokaina już w niskich stężeniach istotnych klinicznie (0,010,1 mM) hamują proliferację mezenchymalnych komórek
macierzystych (MSC), a także zaburzają oddychanie mitochondrialne oraz obniżają produkcję ATP [10]. Co ciekawe, anestetyki wziewne wykazują zdolność hamowania
śmierci komórek macierzystych [16].
Toksyczność anestetyków lokalnych wiąże się z ich
wpływem na żywotność komórek w mechanizmie innym
niż odpowiedzialny za efekty analgetyczne i anestetyczne
tych środków, tj. blokowaniem kanałów sodowych. Dane
z piśmiennictwa wskazują na ich wpływ na mitochondrialne procesy energetyczne, m.in. rozprzęgnięcie fosforylacji
oksydacyjnej i uszkodzenie mitochondrialnego DNA, a także zaburzenie homeostazy wapniowej, co w konsekwencji
prowadzi do śmierci komórek, [6, 17].
Środki znieczulenia miejscowego indukują apoptozę
m.in. w komórkach nerwowych, limfocytach i chondrocytach w zależności od rodzaju anestetyku, stężenia oraz
czasu inkubacji [4-6]. Badania Werdehausen i współpracowników przeprowadzone na linii komórek nerwowych
potwierdzają większą cytotoksyczność bupiwakainy w porównaniu z lidokainą zastosowanymi w niskich stężeniach.
1,5 mM bupiwakaina powodowała ok. 20% wzrost ilości
komórek wczesnoapoptotycznych po 24 godzinach inkubacji, z kolei w przypadku lidokainy w stężeniu równopotencjalnym wzrost ten był o połowę mniejszy [5]. Badania Boselli i współpracowników przeprowadzone na linii
komórkowej Jurkat (białaczkowe limfocyty T) wskazują
na indukcję apoptozy już po czterogodzinnej inkubacji
z 2,3 mM lidokainą [4]. Wydaje się, że indukcja apoptozy
w komórkach macierzystych jest również zależna od czasu
inkubacji z anestetykiem: w komórkach macierzystych
ścięgna bupiwakaina w stężeniu 0,5% istotnie indukowała
apoptozę już po 2 godzinach [9].
W naszych badaniach lidokaina nie wykazywała efektu
proapoptotycznego po czterech godzinach inkubacji nawet
w najwyższym zastosowanym stężeniu ! 4 mM. Odmienna
reakcja komórek na poszczególne anestetyki lokalne może
wynikać z różnic we właściwościach fizykochemicznych
tych związków oraz różnych mechanizmów aktywacji procesu apoptozy. Cytotoksyczność bupiwakainy może być
związana z większą lipofilnością w porównaniu z lidokainą;
bupiwakaina ma też większą zdolność blokowania kanałów potasowych i uchodzi za typowy protonofor [17].
Toksyczność bupiwakainy może być też związana ze
wzmożoną produkcją wolnych rodników, w tym reaktywnych form azotu [7].
Przyczyny różnic w odpowiedzi na anestetyki lokalne
pomiędzy subpopulacjami komórek macierzystych nie są
znane. Konieczne jest wykonanie dodatkowych badań wyjaśniających to zjawisko.
Podsumowanie
Przeprowadzone przez nas badanie pozwala wzbogacić wiedzę na temat potencjalnego cytotoksycznego wpływu bupiwakainy stosowanej do znieczulenia i analgezji
zewnątrzoponowej porodu na żywotność komórek macierzystych. W stężeniu istotnym klinicznie anestetyk ten nie
powoduje zmian żywotności komórek macierzystych. Wydaje się zatem, że zastosowanie znieczulenia zewnątrzoponowego w trakcie porodu nie wpływa na jakość komórek
macierzystych i nie jest przeciwskazaniem do bankowania
tych komórek w celu ich późniejszego wykorzystania.
Piśmiennictwo
[1] Reynolds F. (2010) The effects of maternal labour analgesia
on the fetus. Best. Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol. 24:
289-302.
[2] Bader A.M., Fragneto R., Terui K. et al. (1995) Maternal and
neonatal fentanyl and bupivacaine concentrations after epidural infusion during labor. Anesth. Analg. 81: 829-832.
[3] Baran J. (2012) Współczesne metody oceny apoptozy – wiele dróg do celu . Cytom. Pol. 1: 11-19.
[4] Boselli E., Duflo F., Debon R., Allaouchiche B. et al. (2003)
The Induction of Apoptosis by Local Anesthetics: A Comparison Between Lidocaine and Ropivacaine. Anesth. Analg.
96: 755-756.
[5] Werdehausen R., Fazeli S., Braun S. et al. (2009) Apoptosis
induction by different local anaesthetics in a neuroblastoma
cell line. BJA 103: 711-718.
[6] Grishko V., Xu M., Wilson G. et al. (2010) Apoptosis and mitochondrial dysfunction in human chondrocytes following
exposure to lidocaine, bupivacaine, and ropivacaine. J. Bo-
ne Joint. Surg. 92: 609-618.
[7] Rahnama R., Wang M., Dang A.C. et al. (2013) Cytotoxicity of
Local Anesthetics on Human Mesenchymal Stem Cells. J.
Bone Joint. Surg. Am. 95: 132-137.
[8] Keck M., Zeyda M., Gollinger K. et al. (2010) Local anes-
thetics have a major impact on viability of preadipocytes
and their differentiation into adipocytes. Plast. Reconstr.
Surg. 126: 1500-1505.
[9] Haasters F., Polzer H., Prall W.C. et al. (2011) Bupivacaine,
ropivacaine, and morphine: comparison of toxicity on human hamstring-derived stem/progenitor cells. Knee Surg.
Sports Traumatol. Arthrosc. 19: 2138-2144.
[10] Lucchinetti E., Awad A.E., Rahman M. et al. (2012) Antipro-
liferative Effects of Local Anesthetics onMesenchymal Stem
Cells:Potential Implications for Tumor Spreading and
Wound Healing. Anestesiology. 116: 841-856.
Wpływ bupiwakainy na żywotność komórek macierzystych krwi pępowinowej in vitro
[11] Azouna N.B., Berraeis L., Regaya Z. et al. (2011) Immuno-
phenotyping of hematopoietic progenitor cells: Comparison between cord blood and adult mobilized blood grafts.
World. J. Stem. Cells. 26: 104-112.
[12] Tura O., Barclay G.R., Roddie H. et al. (2007) Absence of
a relationship between immunophenotypic and colony enumeration analysis of endothelial progenitor cells in clinical
haematopoietic cell sources. J. Transl. Med. 5: 37-46.
[13] Zuba-Surma E.K., Łabędź-Masłowska A., Kamycka E. et al.
(2012) Wieloparametrowa klasyczna i obrazowa cytometria
przepływowa w identyfikacji komórek macierzystych. Cytom. Pol. 128: 127-141.
[14] Cervera A., Lillo R., García-Sánchez F. et al. (2006) Flow cy-
tometric assessment of hematopoietic cell subsets in cryopreserved preterm and term cord blood, influence of obstetrical parameters, and availability for transplantation.
Am. J. Hematol. 81: 397-410.
219
[15] Valvano M.N., Leffler S. (1996) Comparison of bupivacaine
and lidocaine/bupivacaine for local anesthesia/digital nerve block. Ann. Emerg. Med. 27: 490-492.
[16] Kim J.H., Oh A.Y., Choi Y.M., et al. (2011) Isoflurane decreases death of human embryonic stem cell-derived,
transcriptional marker Nkx2.5(+) cardiac progenitor cells.
Acta Anaesthesiol. Scand. 55: 1124-1131.
[17] Irwin W., Fontaine E., Agnolucci L. et al. (2002) Bupivacaine myotoxicity is mediated by mitochondria. J. Biol. Chem.
277: 12221-12227.
J
Karolia Kulińska
Zakład Anestezjologii Doświadczalnej
Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego
61-861 Poznań, św. Marii Magdaleny 14
e-mail: [email protected]
Effect of bupivacaine on the viability of umbilical cord blood stem cells in vitro – a pilot study
Bupivacaine, a local anesthetic commonly used for labor pain control passes into the fetal circulation potentially
exerting biological effects. Whether the agent is able to influence viability of the cord blood stem cells is not clear. The
aim of this study was to evaluate the effect of bupivacaine and a reference local anesthetic, lidocaine on the viability
of cord blood stem cells in vitro. Mononuclear cells (MNC) were isolated from umbilical cord blood. Then, by flow
cytometry stem cells of the phenotypes CD34+CD133+ and CD34+CD133! were identified; apoptosis andnecrosis were
evaluated using AnnexinV and 7-aminoactinomycin (7-AAD) assay. We found an increase of early apoptotic cells
among stem cell subpopulations CD34+CD133+ and CD34+CD133! under the influence of bupivacaine at the concentrations of 0.05 mM and 1 mM, respectively. At the lowest, clinically relevant concentration bupivacaine did not alter
viability of stem cells. Lidocaine did not affect cell viability at any concentration investigated. Conclusion: Bupivacaine
at clinically relevant concentration does not affect the viability of the cord blood stem cells in vitro.
Key words: local anesthetics, stem cells, cytotoxicity, cord blood