Udział endoteliny-1, oksydazy NADPH, oksydazy ksantynowej i

mgr Paulina Kleniewska
Katedra Fizjologii Doświadczalnej i Klinicznej
Zakład Fizjologii Układu Krążenia
Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Streszczenie rozprawy doktorskiej
pt. „Udział endoteliny 1, oksydazy NADPH, oksydazy ksantynowej i kinazy
białkowej C w procesie powstawania reaktywnych form tlenu”
Założenia
Mechanizmy odpowiedzialne za wytwarzanie reaktywnych form tlenu (RFT) w
komórkach pod wpływem działania endoteliny 1 (ET-1) w dalszym ciągu pozostają słabo
poznane. Nadmierne stężenie ET-1 we krwi powoduje obkurczenie naczyń krwionośnych
(łącząc się z receptorami ETA), wzrost ciśnienia tętniczego krwi oraz spadek przepływu krwi
przez narządy wewnętrzne. Efekty te prowadzą do niedokrwienia narządów wewnętrznych,
ich dysfunkcji i w konsekwencji do rozwoju stresu oksydacyjnego. Poznanie mechanizmów
komórkowych działania endoteliny oraz procesów regulujących szlak sygnałowy endoteliny 1
daje możliwość wpływania na generowane przez nią RFT.
Cel pracy
Celem podjętych badań było:
 zbadanie wpływu dożylnie podanej ET-1 na tworzenie RTF w sercu i płucach na
podstawie oznaczeń markerów stresu oksydacyjnego oraz stężenia TNF –α;
 zbadanie mechanizmu receptorowego działania ET-1 w narządach wewnętrznych
szczura;
 zbadanie źródła powstawania RFT.
Dodatkowym celem pracy była analiza ciśnienia tętniczego krwi skurczowego,
rozkurczowego i średniego u zwierząt doświadczalnych.
Materiały i metody
Doświadczenia przeprowadzono na szczurach - samcach normotensyjnych szczepu
Wistar-Kyoto, które podzielono na 10 grup:
Grupa I (n = 6) – kontrolna, otrzymywała 0,9% roztwór NaCl (0,2 ml - w odstępach
30 minutowych) do żyły udowej;
Grupie II (n = 6) – podawano 0,9% roztwór NaCl i po 30 min endotelinę 1 (ET-1) w
dawce 3 µg/kg m. c. do żyły udowej;
Grupa III (n = 6) – otrzymywała bloker receptorów endotelinowych ETA - BQ123 w
dawce 1 mg/kg m. c. i po 30 min ET-1 (3 µg/kg m. c.) do żyły udowej;
Grupie IV (n = 6) - podawano bloker receptorów endotelinowych ETB - BQ788 w
dawce 3 mg/kg m. c. i po 30 min ET-1 (3 µg/kg m. c.) do żyły udowej;
Grupa V (n = 6) - otrzymywała inhibitor oksydazy NADPH - apocyninę (apo) w dawce
5 mg/kg m. c. do żyły udowej;
Grupie VI (n = 6) - podawano apocyninę (apo) w dawce 5 mg/kg m. c. i po 30 min
ET-1 (3µg/kg m. c.) do żyły udowej;
Grupa VII (n = 6) - otrzymywała inhibitor oksydazy ksantynowej - allopurinol w
dawce 25 mg/kg m. c. i po 30 min ET-1 (3 µg/kg m. c.) do żyły udowej;
Grupie VIII (n = 6) - podawano inhibitor syntazy tlenku azotu (L -NAME) w dawce
5 mg/kg m. c. i po 30 min ET-1 (3 µg/kg m. c.) do żyły udowej;
Grupa IX (n = 6) - otrzymywała inhibitor kinazy białkowej C – chlorowodorek
GF 109203X w dawce 85 μg/kg m. c. i po 30 min ET-1 (3 µg/kg m. c.) do żyły udowej;
Grupie X (n = 6) - podawano inhibitor kinazy białkowej C specyficzny dla
izoenzymów α i β1 - Go 6976 w dawce 2 μg/kg m. c. i po 30 min ET-1 (3 µg/kg m. c.)
do żyły udowej;
Każde doświadczenie trwało 5 godzin. W czasie eksperymentu monitorowano
ciśnienie tętnicze krwi. Zwierzętom pobierano krew żylną - przed rozpoczęciem
doświadczenia, po 60 minutach od podania badanego związku oraz po zakończeniu
doświadczenia. Po 5 godz. trwania doświadczenia zwierzęta poddano eutanazji, następnie
pobrano narządy wewnętrzne (serca i płuca) do dalszych badań.
W pobranych narządach oznaczono markery stresu oksydacyjnego. Metodami
spektrofotometrycznymi w homogenatach tkankowych oznaczono: ilość produktów
reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS); stężenie nadtlenku wodoru (H2O2);
stężenie glutationu całkowitego (GSHt), utlenionego (GSSG) i zredukowanego (GSH);
stężenie wolnych grup sulfhydrylowych (–SH). W osoczu metodami spektrofotometrycznymi
oznaczono: ilość zredukowanych jonów żelaza (FRAP) oraz stężenie TBARS. Metodą
immunoenzymatyczną (ELISA) oznaczono w homogenatach tkankowych stężenie TNF –α.
Dodatkowo w homogenatach tkankowych oznaczono stężenie białka całkowitego
metodą Lowry’ego.
Wnioski:
Na podstawie uzyskanych wyników sformułowano następujące wnioski:
1. Endotelina 1 podana dożylnie stymuluje produkcję RFT oraz prozapalnej cytokiny
TNF -α w sercu i płucach zwierząt doświadczalnych.
2. Stężenia: TBARS, H2O2, wolnych grup –SH, glutationu oraz TNF -α różnią się
między narządami. Stężenia badanych markerów stresu oksydacyjnego w
homogenatach serc są znacząco wyższe w porównaniu z homogenatami płuc.
3. Zdolność antyoksydacyjna mięśnia sercowego jest wyraźnie niższa niż płuc.
4. Powstawanie RFT w mięśniu sercowym i płucach odbywa się głównie za
pośrednictwem receptorów ETA, ponieważ zablokowanie tych receptorów zmniejsza
wytwarzanie RTF.
5. W mięśniu sercowym głównym źródłem powstawania RFT jest oksydaza NADPH.
6. W płucach głównym źródłem powstawania RFT jest syntaza tlenku azotu.
7. W badanych narządach w powstawaniu RFT bierze udział kinaza białkowa C (PKC).
8. W generowaniu RFT w sercu i płucach tylko częściowo uczestniczy oksydaza
ksantynowa.
9. Endotelina 1 podana dożylnie wpływa na wzrost ciśnienia tętniczego krwi za
pośrednictwem receptorów ETA, oksydazy NADPH oraz PKC.