Kliknij aby pobrać specyfikacje PDF

NOVABEADS Amniotic Fluid DNA Preparation KIT
Novabeads Amniotic Fluid DNA Preparation KIT
Zestaw do izolacji DNA z płynu owodniowego (amniocyty)
Novabeads Amniotic Fluid DNA Preparation KIT jest nowej generacji narzędziem
w technikach biologii molekularnej umożliwiającym izolację DNA z amniocytów – komórek płodu
obecnych w płynie owodniowym. Metoda oparta jest o zastosowanie w pełni syntetycznego
kompozytowego złoża magnetycznego selektywnie wiążącego kwasy nukleinowe. Specjalnie dobrany
skład buforów wiążących i płuczących pozwala uzyskać DNA o bardzo wysokiej jakości i czystości
zarówno z krwi świeżej jak i mrożonej. Izolowany DNA nie ulega fragmentacji w trakcie procesu
oczyszczania. Brak inhibitorów reakcji następczych pozwala na bezpośrednie zastosowanie
oczyszczonych kwasów nukleinowych w innych technikach biologii molekularnej, takich jak:
reakcja PCR
sekwencjonowanie DNA (zautomatyzowane i manualne)
defosforylacja
fosforylacja
ligacja
badanie oddziaływań DNA-białko
trawienie enzymami restrykcyjnymi.
Złoża magnetyczne w odróżnieniu od standardowych złóż stosowanych do izolacji
i oczyszczania DNA umożliwiają pełną automatyzację tego procesu. Procedura nie wymaga
użycia w izolacji specjalistycznego sprzętu takiego jak wirówka lub pompa próżniowa.
Cząstki magnetyczne – Magnetic Particles
Bufor do lizy - Lysis Buffer
Bufor do wiązania – Binding Buffer
Bufor do płukania wstępnego - PreWash Buffer
Bufor do płukania właściwego - Wash Buffer
Bufor do elucji - TE Buffer
Bufor do zagęszczania DNA – LP Buffer
Bufor do przemywania komórek – PBS Buffer
Bufor do trawienia komórek – Digesting Buffer
Opcjonalnie:
10. RNaza A [10 mg/mL]*
11. Poteinaza K [10 mg/mL]*
Zestaw nie zawiera:
1.
2.
3.
Statywu magnetycznego
70% izopropanolu; 100 % izopropanolu
70% etanolu
Uwagi:

Przed przystąpieniem do pracy należy dokładnie wymieszać bufory oraz zworteksować cząstki
magnetyczne. Pozostawić probówkę z cząstkami magnetycznymi w temp. pokojowej. Przed podaniem
jeszcze raz dokładnie zworteksować zawartość probówki.
1
:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań,
tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected]
Zestaw zawiera:
NOVABEADS Amniotic Fluid DNA Preparation KIT
Protokół izolacji DNA z płynu owodniowego
1.
Pobrać 2-3 mL płynu owodniowego. Wirować w temp. pokojowej przez 10 min / 13 000 rpm.
2.
Usunąć supernatant, a osadzone na dnie amniocyty przemyć trzykrotnie PBS Buffer.
Po każdym przemywaniu komórki krótko zwirować i usunąć supernatant.
3.
Do osadu komórkowego dodać 150 µl Digesting Buffer i 15 µl Proteinazy K. Zawartość
probówki dokładnie zworteksować, a następnie inkubować przez noc w temp. 37 °C
lub przez 2-3 h w temp. 56 °C.
4.
Do izolacji DNA pobrać 30 µl lizatu komórkowego. Dodać 320 l Lysis Buffer i 5 µl RNazy A
(stężenie
końcowe
RNazy
A
w
roztworze
powinno
wynosić
50
µg/mL).
Krótko i delikatnie zworteksować zawartość probówki.
5.
Mieszaninę inkubować przez 10 min w temp. 65 °C, a następnie zwirować 10 min / 12 000 rpm.
6.
Po wirowaniu ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki, a osad odrzucić.
7.
Do supernatantu dodać 320 l Binding Buffer i 30 µl Magnetic Particles (cząstek
magnetycznych). Mieszaninę delikatnie zworteksować i inkubować przez 10 min w temp.
pokojowej.
8.
Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych
odrzucić supernatant.
Uwaga! W kolejnych punktach, po podaniu każdego z buforów przemywających (PreWash
Buffer , Wash Buffer, 70% izopropanol) zawartość probówki należy mieszać delikatnie przez
odwracanie, do czasu całkowitego oderwania się cząstek magnetycznych od ścian probówki.
Nie worteksować probówek!
10. Powtórzyć czynności z punktu 9. z pominięciem inkubacji. Probówkę umieścić w statywie
magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant.
11. Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 mL Wash Buffer. Po całkowitym oderwaniu cząstek od
ścian probówki, nie inkubować. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu
się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant.
12. Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 mL 70% izopropanolu. Po całkowitym oderwaniu cząstek
od ścian probówki, nie inkubować. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po
zebraniu się cząstek magnetycznych jak najdokładniej usunąć supernatant.
13. W celu usunięcia pozostałości izopropanolu pozostawić probówki otwarte w statywie
magnetycznym przez 10-15 min w temp. pokojowej.
14. Cząstki magnetyczne zawiesić przez worteksowanie w 50 l TE Buffer. Mieszaninę inkubować
przez 5 min / 65 °C / 800 rpm, a następnie przy otwartych probówkach kolejne 5 min / 65 °C /
800 rpm.
15. Po inkubacji probówki umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek
magnetycznych przenieść supernatant zawierający DNA do nowej probówki.
2
:
ścian probówki, inkubować 5 min w temp. pokojowej. Probówkę umieścić w statywie
magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant.
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań,
tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected]
9. Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 mL PreWash Buffer. Po całkowitym oderwaniu cząstek od
NOVABEADS Amniotic Fluid DNA Preparation KIT
W przypadku niektórych aplikacji (np. MLPA) konieczne jest wyższe stężenie DNA
w preparacie. Wówczas należy przeprowadzić kilka izolacji DNA z tego samego lizatu
(np. 3 izolacje), a następnie zagęścić DNA za pomocą LP Buffer.
2.
W tym celu należy połączyć eluaty DNA w jednej probówce.
3.
Dodać 15 µl LP Buffer i wymieszać zawartość probówki przez pipetowanie. Inkubować 5 min
w temp. pokojowej.
4.
Uzupełnić próbę odpowiednio taką samą objętością (1:1) 100 % izopropanolu (o temp.
15 - 25°C). Delikatnie wymieszać zawartość probówki.
5.
Natychmiast wirować w temp. pokojowej przez 20 min / 13 000 rpm.
6.
Ostrożnie odrzucić supernatant, a osad przemyć 500 µl 70% etanolu (schłodzony 0 – 4 °C).
Wirować w temp. pokojowej przez 3 min / 13 000 rpm.
7.
Ostrożnie usunąć supernatant. Pozostawić probówki otwarte przez ok. 5 min, aby odparować
pozostałość etanolu.
8.
Osad rozpuścić w 40 µl TE Buffer.
9.
Uzyskany DNA przechowywać w temp. -20 ˚C. W przypadku długotrwałego przechowywania
zalecamy przechowywanie w temp. – 80 ˚C.
Aby zapobiec parowaniu i krystalizacji odczynników, zalecamy zabezpieczenie parafilmem
butelek z buforami po każdej izolacji.
Warunki przechowywania: + 4 °C
Lot nr
Exp. date
UWAGA! Pewne składniki buforów mogą działać silnie drażniąco. Podczas pracy ze wszystkimi związkami
chemicznymi należy przestrzegać ogólnie obowiązujących przepisów BHP. Ten produkt został zaprojektowany i
wykonany wyłącznie do celów badawczych. Nie został przetestowany w kierunku zastosowania do celów diagnostycznych i do
bezpośredniej produkcji leków oraz do celów związanych z produkcją leków.
3
:
1.
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań,
tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected]
Protokół zagęszczania DNA