Novabeads Food DNA Kit Novabeads Food DNA Kit

Transkrypt

Novabeads Food DNA Kit
Novabeads Food DNA Kit jest nowej generacji narzędziem w technikach biologii
molekularnej,
umożliwiającym
izolację
DNA
z
produktów
spożywczych
wysoko
przetworzonych. Metoda oparta jest o zastosowanie w pełni syntetycznego kompozytowego
złoża magnetycznego, selektywnie wiążącego kwasy nukleinowe. Specjalnie dobrany skład
buforów wiążących i płuczących umożliwia izolację DNA, pomimo wysokiej hydrolizy kwasów
nukleinowych w procesie przetwarzania żywności. Izolowany DNA nie ulega fragmentacji
w trakcie procesu oczyszczania. Brak inhibitorów reakcji następczych pozwala
na bezpośrednie zastosowanie oczyszczonych kwasów nukleinowych
w innych technikach biologii molekularnej, takich jak:







reakcja PCR
sekwencjonowanie DNA
defosforylacja
fosforylacja
ligacja
badanie oddziaływań DNA-białko
trawienie enzymami restrykcyjnymi.
Złoża magnetyczne, w odróżnieniu od standardowych złóż stosowanych do izolacji
i oczyszczania DNA, umożliwiają pełną automatyzację tego procesu.
W protokole przedstawiamy trzy modyfikacje standardowego protokołu do izolacji
DNA na cząstkach magnetycznych, z wysoko przetworzonych produktów spożywczych, takich
jak:
 różne gatunki mąki
 kleik kukurydziany
 ketchup.
Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11,
NIP 9721099648, email [email protected], www.novazym.com
Protokół izolacji DNA z mąki
Materiały wchodzące w skład zestawu:

Cząstki magnetyczne – Magnetic Particles

Bufor do lizy - Lysis Buffer

Bufor do precypitacji – Precipitation Buffer

Bufor wspomagający precypitację – LP Buffer

Bufor do wiązania – Binding Buffer

Bufor do płukania wstępnego – PreWash Buffer

Bufor do płukania właściwego – Wash Buffer

Bufor do elucji – TE Buffer

RNaza A [10 mg/ml]
Materiały dodatkowo wymagane:

Etanol 80%

statyw magnetyczny

worteks
Uwagi:
 Przed przystąpieniem do procedury dokładnie zworteksować cząstki magnetyczne
i pozostawić probówkę w temp. pokojowej. Przed podaniem cząstek magnetycznych jeszcze
raz dokładnie zworteksować zawartość probówki.
Opis metody:
1.
W probówce na 2 ml odważyć 100-200 mg mąki (*). Następnie dodać 800 µl Lysis Buffer oraz
10 µl RNazy A. Zworteksować próbę przez kilka sekund, a następnie inkubować
w temp. 65 °C przez 10 min.
2.
Po inkubacji zwirować próbę 10 min/12000 rpm. Do nowej probówki przenieść supernatant
tak, aby nie naruszyć osadu. Dopełnić próbę do maksymalnej objętości probówki
Precipitation Buffer. Zworteksować próbę, dodać 100 µl LP Buffer i wymieszać zawartość
probówki przez kilkukrotne jej odwrócenie. Próbę inkubować 5 min w temp. -20 °C.
3.
Zwirować próbę 10 min/12000 rpm. Supernatant usunąć poprzez energiczne odwrócenie
probówki.
4.
Do osadu dodać 250 µl Binding Buffer i dokładnie zworteksować, aż do rozpuszczenia się
osadu. Do próby dodać 10 µl Magnetic Particles (cząstek magnetycznych). Dokładnie
zworteksować zawartość probówki, następnie inkubować 10 min w temp. pokojowej.
5. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym. Po zebraniu się cząstek magnetycznych
odrzucić supernatant.
Uwaga! Po podaniu każdego z buforów do przemywania (PreWash Buffer , Wash Buffer, 80% Etanol)
zawartość probówki wymieszać przez delikatne odwracanie, do czasu całkowitego oderwania się
cząstek magnetycznych od ścian probówki. Nie worteksować probówek!
6. Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 ml PreWash Buffer. Zawartość i inkubować 3 min w temp.
pokojowej. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek
magnetycznych odrzucić supernatant.
7. Powtórzyć czynności z punktu 6 z zastosowaniem Wash Buffer. Nie inkubować. Probówkę
umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić
supernatant.
8.
Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 ml świeżo przygotowanego 80% etanolu. Inkubować 1 min
w temp. pokojowej. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym. Po zebraniu się cząstek
9.
W celu usunięcia pozostałości etanolu otworzyć probówki i odwrócić statyw do góry dnem.
Pozostawić w tej pozycji na bibule przez ok. 5 min.
10. Cząstki magnetyczne zawiesić przez worteksowanie w 50 l TE Buffer. Mieszaninę inkubować
w temp. 65 ˚C/ 5 min/ 800 rpm, a następnie przy otwartej probówce w temp. 65 ˚C / 5 min/
800 rpm.
11. Po inkubacji probówki umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek
magnetycznych przenieść supernatant zawierający DNA do nowej probówki.
12. Preparat zawierający wyizolowany DNA można stosować bezpośrednio do reakcji PCR.
(*) Ilość mąki zależy przede wszystkim od stopnia jej przetworzenia.
Protokół izolacji DNA z kleiku kukurydzianego








RNaza A [10 mg/ml]

Etanol 80%

statyw magnetyczny

worteks
Uwagi:
Opis metody:
1.
W probówce typu Eppendorf (1,5mL) odważyć 100 mg kleiku kukurydzianego.
Probówkę dopełnić do maksymalnej objętości Lysis Buffer. Zworteksować próbę przez kilka
sekund, a następnie inkubować w temp. 65 °C przez 10 min.
2.
Po inkubacji zwirować próbę 10 min/12000 rpm. Do nowej probówki przenieść supernatant
tak, aby nie naruszyć osadu. Dopełnić próbę do maksymalnej objętości probówki
Precipitation Buffer. Zworteksować próbę, a następnie inkubować 5 min w temp. -20 °C.
3.
Zwirować próbę 10 min/13000 rpm, supernatant usunąć, poprzez energiczne odwrócenie
probówki.
4.
Do osadu dodać 250 µl Binding Buffer i dokładnie zworteksować, aż do rozpuszczenia się
osadu.
Na tym etapie można połączyć frakcje z kilku próbek co pozwala na zagęszczenie DNA
z materiału badanego np. połączyć frakcje pochodzące z dwóch próbek, co odpowiada
200 mg kleiku kukurydzianego.
5.
Bez względu na ilość połączonych prób dodać do 10 µl Magnetic Particles (cząstek
magnetycznych). Dokładnie zworteksować zawartość probówki, następnie inkubować 10 min
w temp. pokojowej.
6.
Probówkę umieścić w statywie magnetycznym. Po zebraniu się cząstek magnetycznych
odrzucić supernatant.
Uwaga! Po podaniu każdego z buforów do przemywania (PreWash Buffer , Wash Buffer, 80%
Etanol) zawartość probówki wymieszać przez delikatne odwracanie, do czasu całkowitego
oderwania się cząstek magnetycznych od ścian probówki. Nie worteksować probówek!
7.
Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 ml PreWash Buffer. Zawartość i inkubować 3 min w temp.
pokojowej. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek
8.
Powtórzyć czynności z punktu 6 z zastosowaniem Wash Buffer. Nie inkubować. Probówkę
umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić
supernatant.
9.
Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 ml świeżo przygotowanego 80% etanolu. Inkubować 1 min
w temp. pokojowej. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym. Po zebraniu się cząstek
10. W celu usunięcia pozostałości etanolu otworzyć probówki i odwrócić statyw do góry dnem.
Pozostawić w tej pozycji na bibule przez ok. 5 min.
11. Cząstki magnetyczne zawiesić przez worteksowanie w 50 l TE Buffer. Mieszaninę inkubować
w temp. 65 ˚C/ 5 min/ 800 rpm, a następnie przy otwartej probówce w temp. 65 ˚C / 5 min/
800 rpm.
12. Po inkubacji probówki umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek
magnetycznych przenieść supernatant zawierający DNA do nowej probówki.
13. Preparat zawierający wyizolowany DNA można stosować bezpośrednio do reakcji PCR.
Protokół izolacji DNA z ketchupu


Bufor do neutralizacji – Neutralization Buffer



Bufor wspomagający precypitację – LP Buffer





RNaza A [10 mg/ml]

Izopropanol 70%

Izopropanol 100% (temp. +15 - +25 °C)

Etanol 70% (schłodzony do temp. 0 - +4 °C)

statyw magnetyczny

moździerz

mikrowirówka

worteks
Uwagi:
 Podczas płukania ketchupu w Neutralization Buffer i rozcieraniu w moździerzu w widoczny
sposób powinien oddzielać się na ściankach moździerza pomarańczowy i lekko fioletowy
barwnik.
 Po każdym płukaniu wirować mieszaninę w tych samych probówkach.

Od momentu przyłączenia DNA do cząstek magnetycznych (etap 11.), po kolejnych płukaniach
cząstek w PreWash Buffer, Wash Buffer oraz 70% izopropnolu probówek
nie worteksować!
Opis metody:
ETAP I - Zagęszczanie
1. Do moździerza pobrać 4 ml ketchupu i dodać 4 ml Neutralization Buffer. Całość rozcierać
ok. 5 min. Przenieść mieszaninę do czterech probówek Eppendorf. Wirować 5 min. w temp.
pokojowej (≥12 000 rpm). Odrzucić supernatant.
2. Procedurę płukania powtórzyć czterokrotnie. W tym celu, do każdej probówki z osadem
ponownie dodać po 1 ml Neutralization Buffer, dokładnie zworteksować zawartość
probówki. Całość (z 4 probówek) przenieść ponownie do moździerza i rozcierać.
3. Po ostatnim płukaniu w Neutralization Buffer wydłużyć wirowanie do 10 min. Dokładnie
usunąć supernatant. Pozostawić osady w probówkach.
ETAP II - Liza
4. Do każdej z czterech probówek z osadami dodać po 500 µl Lysis Buffer. Dokładnie
zworteksować mieszaninę i przenieść do czystego moździerza.
5. Rozcierać mieszaninę ok. 5 min. Następnie całość przenieść do dwóch probówek (ok. 2 ml na
probówkę), do każdej dodać 5 µl RNazy A i dokładnie zworteksować.
6. Próby inkubować w 65 °C / 10 min /800 rpm;
7. Po inkubacji wirować próby 10 min w temp. pokojowej (≥12 000 rpm). Po wirowaniu:
7A.
Supernatant  przenieść do nowych probówek (opisać odpowiednio 1 i 2);
zostawić do dalszej analizy.
7B.
Osady  do każdego osadu dodać 1000 µl Lysis Buffer i dokładnie zworteksować
B1. dodać po 5 µl RNazy A i ponownie zworteksować
B2. inkubować 65 °C / 10 min /800 rpm;
B3. po inkubacji wirować próby 10 min w temp. pokojowej (≥12 000 rpm);
B4. Przenieść supernatant do nowych probówek (opisać odpowiednio 3 i 4).
Osady odrzucić.
8. Do supernatantów w probówkach 1, 2, 3, 4 (z punktu 7A i 7B) dodać po 15 µl LP Buffer
i inkubować 5 min. temp. pokojowej. Następnie próby dopełnić do maksymalnej objętości
probówki Precipitation Buffer. Zworteksować zawartość probówek i inkubować 5 min.
w temp. – 20 °C.
9. Zwirować próby w temp. pokojowej 10 min. (≥12 000 rpm). Dokładnie usunąć supernatant.
ETAP III - Wiązanie z cząstkami magnetycznymi
10. Osad rozpuścić przez worteksowanie w 250 µl Binding Buffer, a następnie dodać 25 µl
Magnetic Particles. Dokładnie zworteksować zawartość probówki i inkubować przez 10 min.
w temp. pokojowej.
11. Probówki umieścić w statywie magnetycznym. Po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić
przesącz.
ETAP IV - Płukanie cząstek magnetycznych
12. Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 ml PreWash Buffer, delikatnie wytrząsać próbę do chwili
całkowitego oderwania się cząstek od ścianki probówki (nie worteksować!), następnie
inkubować 3 min. w temp. pokojowej.
13. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek odrzucić przesącz.
14. Powtórzyć czynności z punktu 13. z zastosowaniem Wash Buffer (nie worteksować!).
Inkubować 1 min w temp. pokojowej. Po zebraniu cząstek na statywie magnetycznym odrzucić
przesącz.
15. Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 ml 70% izopropanolu poprzez delikatne wytrząsanie
(nie worteksować!). Inkubować 1 min. w temp. pokojowej. Po zebraniu cząstek na statywie
magnetycznym odrzucić przesącz.
16. W celu usunięcia pozostałości izopropanolu otworzyć probówki i odwrócić statyw,
pozostawiając go na bibule przez ok. 5 min.
ETAP V - Elucja
17. Cząstki magnetyczne zawiesić przez worteksowanie w 150 µl TE Buffer. Mieszaninę inkubować
65 °C / 5 min /800 rpm, a następnie przy otwartej probówce 65 °C / 5 min /800 rpm.
18. Po inkubacji umieścić probówki w statywie magnetycznym i po zebraniu cząstek
magnetycznych przenieść przesącz do nowych probówek.
ETAP VI - Precypitacja
19. Do każdej próby dodać po 15 µl LP Buffer i inkubować 5 min. w temp. pokojowej.
20. Uzupełnić każdą próbę 200 µl 100 % izopropanolu (o temp. +15 - +25 °C), delikatnie
wymieszać zawartość probówki i natychmiast wirować 20 min w temp. pokojowej
(≥12 000 rpm).
21. Po wirowaniu ostrożnie odrzucić supernatant, a osad przemyć 500 µl 70% etanolu
(schłodzony do temp. 0 - +4 °C). Wirować 3 min. w temp. pokojowej (≥12 000 rpm). Ostrożnie
usunąć supernatant. Pozostawić probówki otwarte k. 5 min., aby odparować pozostałość
etanolu.
22. Osad rozpuścić przez worteksowanie w 50 µl TE Buffer.
Preparat zawierający wyizolowany DNA można stosować bezpośrednio do reakcji PCR.

Novabeads Food DNA Kit Novabeads Food DNA Kit

Transkrypt

Podobne dokumenty

Kliknij aby pobrać specyfikacje PDF

Spray do szorstkowania opon

Tworzenie protoplastów i sferoplastów

Novabeads Food DNA Kit Novabeads Food DNA Kit

Ćwiczenie 9

Wpływ promieniowania cieplnego na organizm człowieka

MEDGEN - pobieranie krwi żylnej do probówki