Zastosowanie metody wygaszania fluorescencji wewnętrznej do

Zastosowanie metody wygaszania fluorescencji wewnętrznej do badań
strukturalnych białek
Jedną z metod stosownych w badaniach dynamiki i struktury białek oraz ich fragmentów jest
spektroskopia fluorescencyjna. Jej przydatność wynika między innymi z faktu integralnej
obecności w łańcuchach polipeptydowych fluoroforów, tzn. reszt aminokwasów
aromatycznych posiadających sprzężony układ wiązań podwójnych: tryptofanu, tyrozyny i
fenyloalaniny. W zakresie długości fali światła wzbudzającego od około 295 nm do 305 nm,
za absorpcje fotonów odpowiedzialne są wyłącznie reszty tryptofanowi, co umożliwia ich
selektywne wzbudzanie w obecności innych reszt aromatycznych,
Wydajność kwantowa fluorescencji, definiowana jako stosunek ilości kwantów
wyemitowanych do ilości kwantów zaabsorbowanych, równa jest jedności tylko wówczas,
gdy deekscytacja stanu wzbudzonego zachodzi wyłącznie poprzez emisje fotonów. Zwykle
jednak występują również procesy bezpromieniste. W warunkach równowagi, szybkość
pochłaniania kwantów światła, tj. przechodzenie ze stanu podstawowego do stanu
wzbudzonego cząsteczki, równa jest szybkości powrotu ze stanu podstawowego do stanu
podstawowego, na który to powrót składają się procesy zachodzące z emisja fotonów oraz
procesy bezemisyjne.
Oznaczając wydajność kwantowa przez Φ:
F
Γ
=
(1)
F0 Γ + K
gdzie: F jest liczbą kwantów światła fluorescencyjnego, F0 – liczba kwantów światła
fluorescencyjnego w przypadku, gdyby deekscytacja każdego stanu wzbudzonego zachodziła
wyłącznie przez zjawisko emisji, Γ - szybkością deekscytacji zachodzącej poprzez emisję
fotonów, K – szybkością deekscytacji zachodzącej poprzez procesy bezpromieniste.
Wyrażenie 1/Γ+K ma wymiar czasu i jest czasem życia fluorescencji:
1
τ=
(2)
Γ+K
Wyrażenie τ00=1/Γ oznacza czas życia poziomu wzbudzonego, gdy jedynym sposobem
detekcji jest emisja fotonów.
Rozważając procesy zachodzące podczas naświetlania światłem monochromatycznym
rozcieńczonego, homogenicznego roztworu substancji F można zapisać:
Φ=
ka
wzbudzenie:
F + hν
F*
(3)
F + hν`
(4)
F
(5)
kf
deekscytacja przez fluorescencję:
F*
km
deekscytacja bezpromienista:
F*
kq
oraz:
F* + Q
[F*….Q]
F+Q+c
(6)
Równanie (6) opisuje zjawisko wygaszania fluorescencji przez substancję
wygaszającą Q obecną w roztworze. Cząsteczka wygaszacza w wyniku zderzenia z ze
wzbudzoną cząsteczką F powoduje deekscytację tej ostatniej. Ponieważ do utworzenia
kompleksu [F*….Q] dochodzi w jakiś czas po wzbudzeniu fluorofora F, zjawisko
bimolekularnego wygaszania prowadzi do skrócenia czasu życia fluorescencji τ. Szybkości
zachodzenia wymienionych są równe:
d [ F *] dt = ka
− d [ F *] dt = k f [ F *]
− d [ F *] dt = km [ F *]
− d [ F *] / dt = kq [ F *][Q]
Wartość kq jest stałą szybkości gaszenia bimolekularnego.
Jeśli natężenie światła wzbudzającego jest stałe, to w układzie ustala się równowaga,
w której szybkość wzbudzania cząsteczek F jest równa sumie szybkości wszystkich procesów
składających się na deekscytację:
k a = (k f + km + k q [Q ])[F *]
(7)
Zgodnie z definicją wydajności kwantowej można zapisać:
Φ=
k f [F *]
τ
=
τ 00 (k f + km + kq [Q ])[F *]
(8)
Analogicznie, wydajność kwantowa przy braku wygaszacza wynosi:
Φ`=
k f [F *]
τ0
=
τ 00 (k f + km )[F *]
(9)
przy czym τ 0 = 1 (k f + km ) jest czasem życia fluorescencji przy zerowym stężeniu
wygaszacza.
Dzieląc stornami równanie (8) przez (9) otrzymamy tzw. zależność Sterna-Volmera w
postaci:
τ
F
1
(10)
=
=
τ 0 F0 1 + kqτ 0 [Q]
Wartość K SV = kqτ 0 nosi nazwę stałej Sterna-Volmera.
Równanie (10) jest najczęściej przedstawiane jako:
τ 0 F0
=
= 1 + K SV [Q ]
τ
F
(11)
gdyż w układzie współrzędnych F0/F w funkcji [Q] przewiduje zależność liniową o
nachyleniu równym KSV. Należy zwrócić uwagę, że proces bimolekularnego gaszenia może
być mierzony jako zmniejszanie intensywności fluorescencji lub tez jako skrócenie czasu
życia fluorescencji.
Częstość zderzeń cząsteczek wygaszacza z fluoroforem, Z = k D [Q ] , zależy od stałej
szybkości kD, która jest związana z procesem dyfuzji równaniem Smoluchowskiego:
kD =
4πN A
RD
1000
(12)
gdzie R jest promieniem oddziaływania kolizyjnego równym w przybliżeniu sumie promieni
cząsteczkowych fluorofora i wygaszacza, D jest sumą współczynników dyfuzji zderzających
się cząsteczek, NA jest liczbą Avogadro.
Współczynnik D można wyliczyć z równania Stokesa-Einsteina:
D=
kT
6πηR
(13)
w którym η oznacza lepkość środowiska, k stalą Boltzmana, a T temperaturę.
Stałe: kD oraz szybkości gaszenia bimolekularnego kq, związane są zależnością:
kq = k Dγ
(14)
gdzie γ jest wydajnością procesu gaszenia dynamicznego.
W przypadku zastosowania wydajnych wygaszaczy γ=1, kq=kD wartość kq w
roztworach wodnych jest rzędu 5 × 105 M-1s-1 (gaszenie kontrolowane dyfuzyjnie, tzn. przez
procesy dyfuzji).
Zależność F0/F w funkcji stężenia wygaszacza jest liną prostą tylko wtedy, gdy w
jednorodnym układzie fluoroforów obniżenie wydajności kwantowej fluorescencji
spowodowane jest wyłącznie gaszeniem dynamicznym. Niekiedy zależność Sterna-Volmera
okazuje się być krzywą wypukłą. Za dodatnie odchylenie od liniowości odpowiedzialna jest
współobecność mechanizmu tzw. gaszenia statycznego. W przeciwieństwie do gaszenia
dynamicznego (kolizyjnego), które zachodzi w milisekundowej skali czasu fluorescencji,
wygaszanie statyczne polega na natychmiastowym (około 10-15s) odebraniu energii
wzbudzenia fluorofora przez wygaszasz, albo też na utworzeniu niefluoryzującego kompleksu
jeszcze przed momentem wzbudzenia.
Aby doszło do natychmiastowej deekscytacji, cząsteczki wygaszacza muszą
znajdować dostatecznie blisko fluoroforu w momencie absorpcji kwantu światła. Jeśli obecne
są one w momencie wzbudzenia wewnątrz pewnej aktywnej objętości, v, w pobliżu
fluorofora, to prawdopodobieństwo natychmiastowego wygaszenia fluorescencji jest równe 1.
Równanie Sterna-Volmera dla układu jednorodnego, uwzględniając proces gaszenia
statycznego przybiera postać:
F
1
(15)
=
F0 (1 + kqτ 0 [Q])exp(V [Q ])
gdzie V jest stałą gaszenia statycznego, V = vN A / 1000 . Wartości stałej V są najczęściej rzędu
kilku M-1, co odpowiada elementowi objętości v o promieniu około 10 Å. Promień ten jest
porównywalny z odległościami Van der Waalsowskich oddziaływań pomiędzy cząsteczkami.
Ponieważ gaszenie statyczne zachodzi przed procesem emisji, nie wpływa ono na
obserwowany czas życia fluorescencji fluorofora przy danym stężeniu wygaszacza.
Powyższe równania dotyczą najprostszego przypadku wygaszania fluorescencji w
jednorodnym układzie fluoroforów. Często zdarza się, że obserwowana emisja jest
superpozycją fluorescencji fluoroforów emitujących niezależnie w badanym układzie, jak np.
w mieszaninie fluoroforów lub w białkach zawierających kilka reszt tryptofanowych.
Równanie Sterna-Volmera (dla uproszczenia przedstawione bez udziału gaszenia
statycznego) przybiera wówczas postać:
F
fi
=∑
F0
i (1 + K SVi [Q ]) exp(Vi [Q ])
(16)
gdzie fi jest wagą i-tego składnika (fluorofora), tzn. ułamkiem w całkowitej fluorescencji
układu, a KSV stałą Sterna-Volmera charakteryzującą proces dynamicznego gaszenia i-tego
składnika. Jeżeli różnice pomiędzy poszczególnymi stałymi KSV są dostatecznie duże,
zależność F/F0=f([Q]) jest krzywą wykazującą odchylenie ujemne (w dół). Parametry fi oraz
KSVi można obliczyć stosując komputerowe dopasowanie parametrów równania (16) do
danych eksperymentalnych wygaszania fluorescencji.
Metoda wygaszania fluorescencji reszt tryptofanowych znalazła szerokie zastosowanie
w badaniach dynamiki molekularnej i struktury białek. Mechanizm wygaszania fluorescencji
zależy od struktury chemicznej stosowanego wygaszacza i w wielu przypadkach nie został do
końca wyjaśniony. Najczęściej stosowanymi wygaszaczami są: tlen cząsteczkowy, akrylami
oraz jon jodkowy. Tlen cząsteczkowy, podobnie jak i inne substancje paramagnetyczne, gasi
fluorescencje głównie przez procesy wymiany spinu elektronowego, prowadzące do szybkich
przejść interkombinacyjnych elektronu z singletowego stanu wzbudzonego do stanu
trypletowego. Akrylamid, inne amidy oraz aminy wygaszają fluorescencję działając jako
akceptory w reakcji przeniesienia elektronu ze stanu singletowego fluorofora. Wygaszanie
przez halogenki (np. jon jodkowy) oraz atomy pierwiastków ciężkich może być
spowodowane sprzężeniem spin-orbita pomiędzy cząsteczkami fluoroforu w stanie
wzbudzonym a wygaszaczem. Inne wygaszacze mogą gasić fluorescencję poprzez
rezonansowy transfer energii wzbudzenia, przeniesienie elektronu z wygaszaczem jako
donorem, przeniesienie protonu, tworzenie niefluoryzujących ekscipleksów oraz inne procesy.
Jon J-, stosunkowo dużych rozmiarów, naładowany ujemnie i zhydratowany, nie może
penetrować do wnętrza białka. Stosuje się go do wygaszania fluorescencji reszt
tryptofanowych, znajdujących się na powierzchni (eksponowanych do środowiska wodnego),
przy czym sam proces wygaszania zależy od rozkładu ładunku wokół fluorofora. Tlen
cząsteczkowy jest bardzo małym, obojętnym elektrycznie wygaszaczem, który może wnikać
do wnętrza cząsteczki białka i gasić fluorescencję głęboko ukrytych reszt tryptofanowych.
Dyfuzja wygaszacza wewnątrz białka zachodzi nawet przy gęstym upakowaniu reszt
aminokwasowych i wiąże się z fluktuacją struktury cząsteczki, tzn. z szybkimi ruchami
fragmentów łańcucha polipeptydowego w czasie trwania zjawiska fluorescencji.
Akrylamid (CH2=CHCONH2), również ma możliwość penetracji wewnątrz cząsteczki
białka oraz wygaszania fluorescencji reszt ukrytych przed środowiskiem wodnym. Chociaż
cząsteczka akrylamidu ma podobny rozmiar do jonu I- to nie jest obdarzona ładunkiem
elektrycznym.
Stopień ekspozycji fragmentów białka zawierającego reszty tryptofanowe można
oszacować na podstawie stałej kq. Jeśli fluorofor jest osłonięty przez inne części łańcucha
polipeptydowego, to związana z nim stała kq będzie mała w porównaniu do fluorofora
nieekranowanego.
Wykonanie ćwiczenia
Przygotować około 1,5 ml białka w buforze. Fluorescencję wzbudzać przy 297 nm. Przy
takiej długości fali efektywnemu wzbudzeniu ulegają tylko i wyłącznie reszty tryptofanowe.
Stężenie białka musi być tak dobrane, aby absorbancja próbki przy długości fali wzbudzenia
nie przekroczyła 0,1. Wykonać wygaszanie fluorescencji białka przy około 340 nm za
pomocą roztworu jodku potasu (4 M). Mierzyć intensywność fluorescencji po dodaniu do
próbki kolejnych, mikrolitrowych porcji wygaszacza (5-10 µl). Wyniki zanalizować przy
pomocy programu komputerowego umożliwiającego dopasowanie zależności SternaVolmera.
Obowiązujący materiał
1. Fluorescencja – diagram Jabłońskiego, wzbudzenie, wydajność kwantowa emisji, czas
życia
2. Sposoby detekcji stanu wzbudzonego
3. Wygaszanie emisji fluorescencji, wygaszanie dynamiczne i statyczne, równanie
Sterna-Volmera – wyprowadzenie, analiza graficzna, zastosowanie w jedno- i
niejednorodnych układach fluoroforów
4. Równanie Smoluchowskiego, równanie Stokesa-Einsteina
5. Wykorzystanie metody wygaszania fluorescencji w badaniach białek, wygaszacze,
mechanizmy gaszenia
Literatura
1. Fotochemia. Podstawy. J. A. Baltrop, J. D. Cole
2. Fotoluminescencja roztworów. A. Kawski
3. Zastosowanie metody wygaszania fluorescencji wewnętrznej do badania zmian w
strukturze białek. M. Dziedzicka, Zeszyty Naukowe UJ Prace z Biologii Molekularnej,
Z 15 (1987) str. 25-38]
4. Principles of fluorescence spectroscopy. J. R. Lakowicz