Genomic Mini AX Bacteria + Spin_PL

Protokół
Genomic Mini AX BACTERIA + (SPIN)
zestaw do izolacji genomowego DNA z bakterii
numer katalogowy 060-100MS
Uwagi:
Protokół
• Proteinazę K, bufor do zawieszania bakterii BS, bufor elucyjny E oraz kolumny
Mini AX Spin przechowywać w temperaturze od +4 do +8 °C.
• Roztwór Lizozymu oraz Mutanolizyny należy przechowywać w temp. -20 °C.
• Pojemność wiązania DNA pojedynczej kolumny Mini AX Spin wynosi 15 µg DNA.
• Bufor elucyjny E traci aktywność przy dłuższym kontakcie z powietrzem! Bezpośrednio
po użyciu należy zawsze szczelnie zakręcać pojemnik zawierający bufor E.
7. Usunąć zużyte 2 ml probówki i umieścić kolumy Mini AX Spin w nowych 2 ml probówkach
(w zestawie). Nanieść po 600 µl pierwszego buforu płuczącego W1.
Wirować przez 30-60 s przy 8 000 x g
8. Usunąć zużyte 2 ml probówki i umieścić kolumny Mini AX Spin w nowych 2 ml
probówkach (w zestawie). Nanieść po 500 µl drugiego buforu płuczącego W2.
Wirować przez 30-60 s przy 8 000 x g
9.
Podczas wirowania przygotować probówki elucyjne (nie ma w zestawie) i dodać na ich
dno po 5 µl buforu zobojętniającego N.
Dodanie buforu N można pominąć jeżeli próbki wyizolowanego DNA nie będą zamrażane.
Zobojętnianie próbek DNA. Patrz “Informacje dodatkowe” na końcu protokołu.
10. Po wirowaniu ostrożnie usunąć zużyte 2 ml probówki i umieścic kolumny Mini AX Spin
w próbówkach do elucji (nie ma w zestawie). Nanieść po 150 µl buforu elucyjnego E.
Inkubować przez 5 min w temp. pokojowej
Protokół izolacji:
Uwaga: Bufor elucyjny E traci aktywność przy dłuższym kontakcie z powietrzem. Należy
zawsze szczelnie zamykać pojemnik bezpośrednio po zakonczeniu pracy z buforem E.
1. Zwirować maksymalną objętość 1 ml nocnej hodowli bakteryjnej w 1,5 ml probówkach
typu Eppendorf (nie ma w zestawie). Usunąć supernatant, a osad bakteryjny zawiesić
w 100 µl buforu do zawieszania bakterii BS.
11. Wirować przez 30-60 s przy 8 000 x g
2. Dodać 20 µl Lizozymu oraz 5 µl Mutanolizyny.
12. Usunąć kolumny. Zamknąć probówki zawierające oczyszczone DNA.
Całość wymieszać i inkubować przez 20 min w temp. 50 °C
Synergizm działania mutanolizyny i lizozymu prowadzi do zwiększonej wydajności lizy
komórek bakterii z rodzaju: Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Listeria
3. Po inkubacji dodać do każdej z próbek 400 µl buforu lizującego LSU oraz 20 µl roztworu
Proteinazy K. Całość wymieszać i inkubować przez 10 min w temp. 50 °C. Mieszać od
czasu do czasu przez worteksowanie. (Inkubację można przeprowadzać w termomikserze
firmy Eppendorf lub jego odpowiedniku, przy parametrach ciągłego mieszania 1400
RPM. W przypadku zastosowania takich warunków lizy można pominąć pkt. 4 protokołu
izolacji.)
Opcjonalne usuwanie RNA. Patrz “Informacje dodatkowe” na końcu protokołu
4. Po inkubacji próbki należy intensywnie wymieszać przez worteksowanie w ciągu 2 min
przy 1000-1400 RPM. Zaleca się stosowanie worteksów z odpowiednią przystawką.
Uwaga: ten krok jest kluczowy dla wydajności izolacji DNA!
Informacje dodatkowe
•
Opcjonalne usuwanie RNA. Jeżeli zależy nam na całkowitym usunięciu RNA, to do
próbki należy dodać 2 µl RNAzy (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat. 1006-10).
Całość wymieszać i pozostawić na 5 min. w temp. pokojowej. Następnie przejść do
punktu 4. protokołu.
•
Zobojętnianie próbek DNA. Bufor elucyjny E jest silnie alkaliczny i po zamrożeniu może
powodować degradację DNA. Jeżeli oczyszczone próbki DNA mają być przechowywane
w formie zamrożonej to bezwzględnie należy je zobojętnić przed zamrożeniem buforem
zobojętniającym N. Z naszej praktyki laboratoryjnej wynika, że najwygodniej jest dodać
bufor N przed elucją DNA do pustej probówki elucyjnej (punkt 9. protokołu). W trakcie
elucji, zawieszone w buforze elucyjnym DNA wymiesza się z buforem N i ulegnie
natychmiastowej neutralizacji.
Jeżeli bufor neutralizujący N nie został dodany w punkcie 9. protokołu to można dodać go
po zakończonej izolacji - przed zamrożeniem próbek DNA.
5. Wirować próbki przez 10 s przy prędkości 8 000 x g, aby usunąć zlizowany materiał
z przykrywek próbówek typu Eppendorf.
6. Nanosić próbki na kolumny Mini AX Spin. Wirować przez 30-60 s przy 8 000 x g
A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia, Poland
tel. +48 586982194, fax +48 586228578, www.aabiot.com, [email protected]
01
A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia, Poland
tel. +48 58 6982194, fax +48 586228578, www.aabiot.com, [email protected]
02