Genomic Mini AX Blood Spin 1 ml_PL

Protokół
Genomic Mini AX BLOOD (SPIN)
zestaw do izolacji genomowego DNA z 1 ml krwi
numer katalogowy 052-100S1
Uwagi:
Protokół
• Proteinazę K, kolumny Mini AX Spin oraz bufor elucyjny E należy przechowywać w
temperaturze od +4 do +8 °C.
10. Podczas wirowania przygotować probówki elucyjne (nie ma w zestawie) i dodać na ich dno
po 5 µl buforu zobojętniającego N
Zobojętnianie próbek DNA. Patrz “Informacje dodatkowe” na końcu protokołu.
11. Po wirowaniu ostrożnie usunąć zużytą 2 ml probówkę i umieścic kolumnę Mini AX Spin w
próbówce do elucji (nie ma w zestawie). Nanieść 100 µl buforu elucyjnego E i inkubować
przez 2 min w temp. pokojowej
Uwaga: Buforu elucyjny E traci aktywnośc przy dłuższym kontakcie z powietrzem. Należy
zawsze szczelnie zamykać pojemnik bezposrednio po zakonczeniu pracy z buforem E.
• Pojemność wiązania DNA pojedynczej kolumienki Mini AX Spin wynosi 15 µg DNA.
• Bufor elucyjny E traci aktywność przy dłuższym kontakcie z powietrzem! Bezpośrednio po
użyciu należy zawsze szczelnie zakręcać pojemnik zawierający bufor E.
Protokół izolacji:
1. Umieścić 1 ml krwi w 1,5 ml probówce typu ependorff (nie ma w zestawie). Dodać 500 µl
buforu LE lizującego erytrocyty. Całość mieszać przez odwracanie probówki do momentu, aż roztwór zmieni się z mętnego na szkarłatnie przezroczysty (ok. 1 minuty)
12. Wirować przez 30-60 s przy 8 000 x g
13. Ponownie nanieść na kolumny Mini AX Spin po 100 µl buforu elucyjnego E
14. Wirować przez 30-60 s przy 8 000 x g
15. Usunąć kolumny Mini AX Spin. Zamknąć probówki zawierające oczyszczone DNA.
2. Całość wirować przez 3 min przy 8 000 x g
Informacje dodatkowe
3. Po wirowaniu usunąć pipetą supernatant. Do osadu dodać 400 µl roztworu lizującego
LSU. Dokładnie zawiesić materiał przez pipetowanie
•
Opcjonalne usuwanie RNA. Jeżeli zależy nam na całkowitym usunięciu RNA to do próbki
należy dodać 5 µl RNA-zy (10 mg/ml) (nie ma w zestawie) a następnie całość wymieszać
i pozostawić na 5 min. w temp.pok. Następnie przejść do punktu 3. protokołu.
•
Zobojętnianie próbek DNA. Bufor elucyjny E jest silnie alkaiczny i po zamrożeniu może
powodować degradację DNA. Jeżeli oczyszczone próbki DNA mają być przechowywane
w formie zamrożonej to bezwzględnie należy je zobojętnić przed zamrożeniem buforem
zobojętniającym N. Z naszej praktyki laboratoryjnej wynika, że najwygodniej jest dodać
bufor N przed elucją DNA do pustej probówki elucyjnej (punkt 10. protokołu). W
trakcie elucji, zawieszone w buforze elucyjnym DNA wymiesza się z buforem N i ulegnie
natychmiastowej neutralizacji.
4. Dodać 20 µl Proteinazy K, całość wymieszać i inkubować w temperaturze 50 °C przez
10 min. Mieszać od czasu do czasu przez worteksowanie
5. Po inkubacji próbkę należy intensywnie mieszać przez 20 s przez worteksowanie
uwaga: ten krok jest kluczowy dla wydajności izolacji DNA!
6. Wirować probówki przez 10 s przy 8 000 x g, aby usunąć zlizowany materiał z przykrywek
próbówek typu ependorff.
7. Nanosić próbkę na kolumnę Mini AX Spin znajdującą się w 2 ml probówce.
Jeżeli bufor neutralizujący N nie został dodany w punkcie 10. protokołu to można dodać
go po zakończonej izolacji - przed zamrożeniem próbek DNA
Wirować kolumny przez 30-60 s przy 8 000 x g
8. Usunąć zużytą 2 ml probówkę i umieścić kolumnę Mini AX Spin w nowej 2 ml probówce
(w zestawie). Nanieść 600 µl pierwszego buforu płuczącego W1
Całość wirować przez 30-60 s przy 8 000 x g
9. Usunąć zużytą 2 ml probówkę i umieścić kolumnę Mini AX Spin w nowej 2 ml probówce
(w zestawie). Nanieść 500 µl drugiego buforu płuczącego W2
Całość wirować przez 30-60 s przy 8 000 x g
A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia, Poland
tel +48 58 6982194, fax +48 58 6228578, www.aabiot.com, [email protected]
01
A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia, Poland
tel +48 58 6982194, fax +48 58 6228578, www.aabiot.com, [email protected]
02