Blood Mini_PL

Protokół
Blood Mini
zestaw do izolacji DNA z krwi
numery katalogowe 022-50, 022-250
Protokół
v.0911
Protokół izolacji DNA
1. Dodać 200 μl uniwersalnego buforu lizującego LT i 20 μl Proteinazy K. Całość
wymieszać i inkubować 20 min. w temperaturze 37° C
v.0911
Wstęp
Zestaw opiera się na zdolności wiązania się DNA do złóż krzemionkowych w wysokich
stężeniach soli chaotropowych.Krew lizowana jest w odpowiednim buforze lizującym, który
zawiera sole chaotropowe i detergenty niejonowe (bufor LT). Dodatkowo w procesie lizy
uczestniczy silna proteaza (Proteinaza K). W tych warunkach dochodzi do lizy komórek
i degradacji wszelkich białek. Następnie mieszanina nanoszona jest na minikolumnę
ze specjalnym złożem krzemionkowym. DNA przechodząc przez złoże osiada na nim,
podczas gdy zanieczyszczenia przechodzą nie zwiazane. Po wypłukaniu z kolumny resztek
zanieczyszczeń, oczyszczone DNA wymywane jest z niej niskojonowymi buforami lub wodą i
nadaje się do bezpośredniego wykorzystania bez konieczności precypitacji.
Uwagi
1. Zestaw przeznaczony jest do izolacji DNA z 0.1-1 ml krwi świeżej lub mrożonej.
Pojemność minikolumny do oczyszczania DNA wynosi 20 μg.
2. Proteinaza K znajdująca si∏ w zestawie jest roztworem gotowym do użycia, który, należy
przetrzymywać w temperaturze 2-8°C. Data ważności znajduje si∏ na etykietce.
3. Jezeli roztwór LT zawiera precypitat należy go podgrzać do temperatury 40°C w celu
całkowitego rozpuszczenia osadu przed użyciem.
Przygotowanie materiału
2.
Próbkę intensywnie worteksować 20 sek. i nanieść na minikolumnę do oczyszczania
genomowego DNA.
3.
Wirować 1 min. przy 10-15 tys. RPM.
4.
Wyjąć minikolumnę wraz z probówką i dodać 500 μl roztworu płuczącego A1.
5.
Wirować 1 min. przy 10-15 tys. RPM.
6.
Przenieść minikolumnę do nowej probówki 2 ml (w zestawie) i dodać do kolumny 400
μl roztworu płuczącego A1.
7.
Wirować 2 min. przy 10-15 tys. RPM.
8.
Osuszoną minikolumn∏ umieścić w nowej probówce 1.5 ml i dodać do niej 100 lub 200 μl
buforu Tris (10mM TRIS.HCl pH 8.5).
Uwaga! W przypadku izolacji DNA ze 100 μl krwi należy dodać 100 μl buforu elucyjnego (Tris), Natomiast
w przypadku izolacji z większej objętości należy dodać 200 μl buforu elucyjnego.
9.
Inkubować próbkę 5 min. w temperaturze pokojowej
10. Wirować 1 min. przy 10-15 tys. RPM.
11. Minikolumnę usunąć, a oczyszczone DNA znajdujące się w probówce przetrzymywać
w lodówce do czasu dalszych analiz.
A. 100 μl krwi świeżej lub mrożonej
1. Pobrać do probówki 100 μl krwi świeżej lub mrożonej. W przypadku mniejszych
objętości krwi dodać buforu Tris do całkowitej objętości 100 μl .
2. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA.
B. 0.2-1 ml krwi świeżej lub mrożonej
1. Pobrać do probówki odpowiednią ilość krwi i dodać połowę objętości roztworu
lizującego erytrocyty LE (np. do 500 μl krwi dodać 250 μl roztworu LE)
2. Całość wymieszać przez odwracanie probówki, aż roztwór z mętnego zmieni się w
szkarłatnie przezroczysty.
3. Próbkę wirować trzy minuty przy 10-15 tys. RPM
4. Po wirowaniu usunąć pipetą supernatant, a do osadu stanowiącego frakcję białych
krwinek dodać 100 μl buforu Tris i dokładnie zawiesić go przez pipetowanie.
5. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA
Uwaga! Metodę A przygotowania materiału stosować można tylko do próbek krwi świeżej i mrożonej do
odjętości 100 μl. . Do próbek krwi świeżej i mrożonej do odjętości do 1 ml należy stosować metodę B. W
przypadku większych objętości próbek krwi zalecamy zastosowanie odrębnych zestawów A&A Biotechnology:
Dla próbek o objętości 1-2 ml - Genomic Midi AX (nr. kat 895-20) zaś dla próbek 2-5 ml, Genomic Maxi AX (nr.
kat 995-10)
A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia, Poland
tel +48587351194, fax +48586228578, www.aabiot.com, [email protected]
01
A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia, Poland
tel +48587351194, fax +48586228578, www.aabiot.com, [email protected]
02