alfa-krystaliny - komórkowa odpowiedź na szok termiczny

Marek Kudła
α-krystaliny – komórkowa
odpowiedź na szok termiczny
Co się dzieje z komórką podczas szoku termicznego?
• Białka ulegają denaturacji, przynajmniej częściowo tracąc swoją
strukturę III-rzędową.
• Transkrypcja i translacja ulegają spowolnieniu i stają się podatne
na błędy.
• Podnosi się płynność błon komórkowych.
• Znacznie ułatwiona jest denaturacja dwuniciowych odcinków
kwasów nukleinowych i wszelkich ich struktur II-rzędowych.
Warunki normalne
Stres termiczny
DNA
DNA
RNA
Degradacja
przez proteazy
polipeptyd
polipeptyd
Zwijanie
białka
przez
czaperony
Spontaniczne
zwijanie bia łka
Białko w formie
natywnej
RNA
Degradacja
przez proteazy
Utrata
właściwej
struktury
III-rzę dowej
Spontaniczne
zwijanie biał ka
Białko w formie
natywnej
Endorybonukleaza T1
Widok przestrzenny
Przekrój poprzeczny
Kolor biały – aminokwasy
hydrofobowe
Kolor czerwony – aminokwasy
polarne
Rodzina
Przedstawiciele
czaperonów u E. coli
Dowiedziona lub sugerowana
funkcja
Hsp100
ClpB
Rozpuszczanie agregatów białek
ClpA
ClpX
Denaturacja białek w celu
dalszej proteolizy (przez ClpP)
Hsp90
HtpG
Ochrona przed agregacją białek
Hsp70
DnaK
(DnaJ, GrpE)
Post- i kotranslacyjne
asystowanie przy osiąganiu
konformacji natywnej
Hsp60
GroEL
(GroES)
Posttranslacyjne asystowanie
przy osiąganiu konformacji
natywnej
Single chain FtsH (=HflB)
charonin
Zwijanie i składanie białek
błonowych
DegP (=HtrA) Czaperon przy niskich
temperaturach, proteaza przy
wysokich
Lon
Hsp33
Hsp33
α-Hsp
IbpA,
IbpB
Segregacja substratu dla
proteolizy
Ochrona podczas stresu
związanego ze środowiskiem
silnie utleniającym
Zapobieganie agregacji białek
(Czynnik indukcji podczas szoku
termicznego – około 300)
DnaK/DnaJ
Hsp70
DnaK
• DnaK jest jednostką wykazującą właściwości czaperonowe,
jego koczaperonami są DnaJ i GrpE.
• Jego aktywność czaperonowa związana jest z hydrolizą ATP.
• Ulega ekspresji konstytutywnej i bierze udział także w
normalnym metabolizmie białek na terenie komórki.
• Wiąże się z dużymi białkami.
Schemat zwijania białek przez kompleks DnaK/DnaJ
Krok 1/3
DnaJ
DnaK
białko w stanie
nienatywnym
ATP
Przyłączenie DnaJ do kompleksu DnaK z ATP zwiększa
aktywność ATPazową DnaK oraz zdolność do wiązania się
z substratem – niepoprawnie sfałdowanym białkiem.
Schemat zwijania białek przez kompleks DnaK/DnaJ
Krok 2/3
GrpE
DnaJ
DnaK
ADP
P
Następuje hydroliza ATP, do kompleksu DnaK/DnaJ z białkiem
dołącza się GrpE.
Schemat zwijania białek przez kompleks DnaK/DnaJ
Krok 3/3
GrpE
DnaK
DnaJ
ADP
ATP
Dochodzi do wymiany nukleotydu, a białko w stanie natywnym
i DnaJ oddysocjowują.
GroEL/GroES
Hsp60
GroEL
• GroEL jest kompleksem dwóch heptamerycznych pierścieni
złożnych z identycznych podjednostek, jego koczaperonem
jest GroES.
• Jego aktywność czaperonowa związana jest z hydrolizą ATP.
• Ulega ekspresji konstytutywnej i bierze udział także w
normalnym metabolizmie białek na terenie komórki.
• Wiąże się z białkami o masie od 20 do 60 kDa.
GroEL/ES
GroES
Widok
z góry
Widok z boku
Widok
od dołu
GroEL/ES - przekroje
Przekroje
poprzeczne
przekrój podłużny
Hydrofobowy pasek
Miejsce wiążące ATP
Wnęka główna
© RCSB - zmodyfikowany
Schemat zwijania białek
przez cykle wiązania i
uwalniania substratu.
Schemat zwijania białek
wewnątrz komór białka
GroEL wykorzystujący
kompleks białkowy
GroEL-GroES
i hydrolizę ATP.
α-Hsp
Białka z domeną α-krystaliny
α-Hsp
• Są to białka czaperonowe o niskiej masie molekularnej
(rzędu 16 kDa).
• Ich aktywność czaperonowa nie jest związana z hydrolizą ATP.
• Ich ekspresja jest indukowana w czasie szoku termicznego,
czynnik indukcji może sięgać ~300.
• Ich aktywność czaperonowa powiązana jest ze zdolnością do
tworzenia oligomerycznych kompleksów.
• Cechują się wysoką stechiometrią wiązania substratu
(do 1 białka na 1 podjednostkę α-Hsp).
• Niesfałdowane białka są prawdopodobnie wiązane na powierzchni
kompleksu.
Białka szoku termicznego typu α-crystallin
Region
N-terminalny
Domena α-crystallin
Region
C-terminalny
Lokalizacja sekwencji
najwyższej zgodności
AXXXXG(L/V)L
• Cechą charakterystyczną tych białek jest 80 aminokwasowa,
konserwowana domena α-krystaliny.
• Wszystkie trzy domeny są odpowiedzialne za oligomeryzację.
• Za wiązanie substratu odpowiedzialna jest domena N-terminalna.
Tworzenie oligomerów przez α-Hsp
Mycobacterium tuberculosis Hsp 16.3
trimer
nonamer
Methanococcus jannaschii Hsp 16.5
dimer
24mer
Tworzenie oligomerów przez α-Hsp
Mus musculus Hsp25
∆T
dimer
tetramer
16mer
granula
Saccharomyces cerevisiae Hsp26
∆T
24mer
dimer
kompleks Hsp26 z
substratem białkowym
Methanococcus
jannnaschii Hsp16.5
Trójwymiarowy model
24-meru uzyskany metodą
dyfrakcji rentgenowskiej
Ten sam model w dwóch
położeniach z odciętą
1/3 kompleksu od strony
obserwatora
Schematyczny przekrój oligomerycznego kompleksu Hsp16
z Methanococcus janaschii
N-koniec
C-koniec
W jaki zatem sposób N-koniec może odpowiadać za wiązanie
substratu do powierzchni kompleksu??
Regulacja ekspresji α-Hsp
• Jest realizowana głównie poprzez indukcję transkrypcji.
Eukaryota:
HSF
trimeryzacja i
fosforylacja
szok
termiczny
HSE
α-A- lub
α-B-krystalina
Gen α-A-krystaliny jest zlokalizowany na chomosomie 21,
gen α-B-krystaliny na chromosomie 11.
Prokaryota:
• Pozytywna regulacja przez alternatywne czynniki σ - E.coli
Normalna temperatura
mRNA σ32
degradacja przy
współudziale DnaK/J
Podwyższona temperatura
mRNA σ32
DnaK/J
translacja
zdezaktywowane
σ32
σ54
IbpA
-35 -10
IbpB
-24 -12
σ32
• Negatywna regulacja przez represory – Streptomyces albus
RheA
termowrażliwy represor
hsp18
IR
• Kombinowana pozytywna i negatywna regulacja – Bacillus subtilis
σK
GerE
cotM
-35 -10
• Regulacja poprzez posttranskrypcyjne elementy kontrolne
Synechococcus vulcanus – transkrypt jest stabilniejszy w wyższej
temperaturze
Bradyrhizobium japonicum – 5’UTR zawiera konserwowaną
ewolucyjnie sekwencję ROSE.
ROSE
5’
Normalna
temperatura
3’
RBS
degradacja
Podwyższona
temperatura
translacja
5’
RBS
3’
degradacja
Efekt mutacji ∆IbpA/B na żywotność E.coli poddanej
szokowi termicznemu przy 50°C
Białe słupki –
mutanty ∆IbpA/B
Czarne słupki –
próba kontrolna
Agregacja białek u E.coli poddanej szokowi termicznemu (50°C)
Usuwanie białek frakcji S u E.coli poddanej szokowi
termicznemu
Efekt dodatku ATP na stabilność kompleksów
α-B-krystaliny z syntazą cytrynianową
Współpraca α-Hsp z innymi białkami opiekuńczymi
α-Hsp
DnaK
GroEL
refolding
refolding
?
refolding
Współpraca α-Hsp z innymi białkami opiekuńczymi
Refolding
DnaK/GroEL
Rozpuszczanie agregatów przez
DnaK/ClpB
agregacja
Refolding przez
DnaK (ewentualne
Przekazanie dalej do
GroEL)
Wiązanie przez
α-Hsp
Degradacja przez
komórkowe proteazy
?
Bibliografia:
2. „The E. Coli small heat-shock proteins IbpA and IbpB prevent
the aggregation...” D. Kuczyńska-Wiśnik et ales, Microbiology
2002, 148, ss.1757-1765
3.
4.
5.
6.
„α-Crystallin-Type Heat Shock Proteins: Socializing
Minichaperones in the context of a Multichaperone Network”
Franz Narberhaus, Microbiology and Molecular Revievs, Mar.
2002, ss.64-93
„ATP causes small heat shock proteins to release denaturated
protein” Keyang Wang, Abraham Spector, European Journal of
Biochemistry, Vol. 268, Issue 24, Page 6335 – Dec. 2001
„Eukariotyczne i archebakteryjne białka opiekuńcze Cpn60 typu
II” J. Osipiuk, Postępy biochemii, 48(2), 2002
www.pdb.org - Molecule of the Month - Chaperones