ZNACZENIE RNA W REGULACJI EKSPRESJI GENÓW

26
BIOLETYN 17/III/2015 | Ścieżki wiedzy
ZNACZENIE RNA W REGULACJI EKSPRESJI
GENÓW
ANNA DANIŁOWICZ
ekspresja genów, siRNA, RNA, CRISPR
Przed naukowcami zajmującymi się biotechnologią postawiono trudne zadanie
w postaci kontroli procesów zachodzących w komórce i ich wykorzystania do np. syntezy
użytecznych dla człowieka metabolitów komórkowych. Biotechnolodzy codziennie wykorzystują znajomość mechanizmu ekspresji genów, co pozwala im na działalność w różnych
dziedzinach. Przykładem jest narzucenie mikroorganizmom określonych warunków,
w których są zdolne do produkcji leków
lub nakłonienie komórek do poprawnego
funkcjonowania, co ma ogromne znaczenie
w medycynie. Duży nacisk kładzie się
na systemy regulacji oparte na białkach,
ale ostatnio zaczęto skupiać się również
na wykorzystaniu systemach opartych na RNA,
które w równym stopniu jak polipeptydy
bierze udział w regulacji takich procesów
jak transkrypcja, degradacja mRNA (ang. messenger RNA) i translacja[2]. Kwas rybonukleinowy może regulować ekspresję genów
poprzez obecność miejsc w łańcuchu tej
cząstki, gdzie poszczególne jego części są do
siebie komplementarne i mogą wytworzyć się
między nimi wiązania wodorowe, tworząc
drugorzędową strukturę[4].
TRANSKRYPCJA
Rysunek 1. Struktura RNA (źródło: http://www.nature.com/).
Proces transkrypcji stanowi pierwszy etap ekspresji genów. Jego mechanizm opiera się
na przepisaniu informacji genetycznej zawartej w sekwencji nukleotydów z nici DNA na RNA.
Proces można podzielić na inicjację, elongację oraz terminację. W pierwszym etapie polimeraza RNA wiąże się z rozplecioną lokalnie matrycą w miejscu promotorowym. Następnie
w fazie elongacji dobudowuje ona kolejne rybonukleotydy, komplementarne do nici DNA,
do powstającej nici mRNA w kierunku 5' → 3'. Proces kończy się w miejscu terminacyjnym,
które najczęściej charakteryzuje się komplementarnymi do siebie regionami, co skutkuje
wytworzeniem w transkrypcie struktury drugorzędowej typu spinka do włosów[5].
W procesie transkrypcji kontrola na poziomie RNA polega głównie na regulacji terminacji
transkrypcji [2], która może przebiegać w postaci zależnej od białka (helikazy) Rho. Białko to
podąża za polimerazą RNA dobudowującą kolejne nukleotydy komplementarne do nici.
Gdy polimeraza dotrze do drugorzędowej struktury spinki do włosów utworzonej przez mRNA
ZNACZENIE RNA W REGULACJI EKSPRESJI GENÓW | Anna Daniłowicz
kończy elongację. Wtedy helikaza Rho dogania polimerazę i rozbija wiązania wodorowe
między parami zasad RNA-DNA, co pozwala na odłączenie matrycy od transkryptu. Innym
równie powszechnie występującym w komórkach mechanizmem jest zatrzymanie się polimerazy na strukturze spinki do włosów oraz jej odłączenie się w wyniku zmniejszania siły oddziaływań pomiędzy drugorzędowym RNA i podjednostką polimerazy [1] [2].
Cząsteczka siRNA (ang. small interfering RNA) jest to rodzaj kwasu rybonukleinowego
o długości 20-30 nukleotydów, który nie ulega translacji i bierze udział w regulacji różnych
procesów, szczególnie w procesie syntezy białek[3]. Jednym z mechanizmów regulacji transkrypcji z udziałem siRNA jest atenuacja występująca w plazmidach i fagach bakterii zarówno
u gram-dodatnich jak i u bakterii gram – ujemnych. Jej rola wynika z sprzężenia transkrypcji
i translacji u bakterii. Mechanizm atenuacji zależy od powstania dwóch struktur przestrzennych: dużej i małej pętli, których konformacja zależy od siRNA. W zależności od powstania
jednej z nich transkrypcja ulega zakończeniu (w przypadku utworzenia mniejszej pętli tworzącej sygnał terminacji) lub jest kontynuowana (gdy powstanie większa pętla zatrzymująca
rybosom) [1] [2].
Inną grupą makrocząsteczek biorącą udział w terminacji transkrypcji są ryboprzełączniki
(ang. ryboswitchers)[2], które składają się z aptameru[7], czyli krótkiego odcinka wiążącego się
z metabolitem i platformy ekspresyjnej, zmieniającej konformację pod wpływem przyłączenia
do aptameru liganda[6]. W przypadku ryboprzełączników mechanizm polega na przyłączeniu
się platformy ekspresyjnej do mRNA i po związaniu się aptameru z odpowiednią cząsteczkę
wytworzenie przez transkrypt struktury spinki do włosów i terminacji transkrypcji.
Ostatnio odkryto również ich udział w regulacji terminacji zależnej od białka Rho [2].
System CRISPR (ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)
to metoda bakterii do obrony przed obcym kwasami nukleinowymi. Charakteryzuje się
palindromowymi powtórzeniami (sekwencja,do której komplementarna część czytana
w kierunku 5'-3' jest taka sama) w genach kodujących cząstki tego systemu. Składa się on
z sekwencji liderowej (promotor transkrypcji systemu CRISPR) oraz genów kodujących białka
z rodziny Cas, które rozpoznają i tną na kawałki obce kwasy nukleinowe włączając przy tym
ich fragmenty do sekwencji CRISPR, co pozwala mikroorganizmowi na rozpoznanie intruza
przy kolejnym jego ataku[10]. Znane są trzy główne typy tego systemu różniące się mechanizmem rozkładu inwazyjnego materiału genetycznego przez nukleazy[9]. W najpowszechniej
występującym u prokariaontów typie II CRISPR łączy się z sgRNA (ang. small guide RNA)
łączy się z obcym materiałem genetycznym, jednocześnie oznaczając go i pozwalając
na przyłączenie się nukleazy Cas9 (numer białka zależy od pełnionej funkcji) powodując
jego rozkład[2][9].
TRANSLACJA
Kolejnym etapem ekspresji genów jest translacja, czyli synteza na matrycy mRNA łańcucha białkowego, poprzez dołączanie kolejnych aminokwasów w zależności od sekwencji
27
28
BIOLETYN 17/III/2015 | Ścieżki wiedzy
nukleotydów w kierunku 5'→3' katalizowana przez rybosomy. Składa się ona z trzech etapów:
inicjacji, elongacji i terminacji. W pierwszej fazie mała podjednostka rybosomu przyłącza się
do końca 5' mRNA, a do niej dołącza się duża podjednostka. Każdy rybosom posiada dwa miejsca, do których w trakcie elongacji wiąże się tRNA (ang. transport RNA) z aminokwasem odpowiadającym sekwencji. W drugim miejscu znajduje się tRNA z aminokwasem włączonym
już do łańcucha polipeptydowego. Obydwa aminokwasy znajdują się na tyle blisko siebie,
aby mogło wytworzyć się wiązanie peptydowe. Następnie cząsteczka tRNA z pierwszego miejsca przesuwa się na drugie miejsce, z którego w tym samym uwolniony zostaje poprzedni
tRNA. Proces trwa do momentu napotkania kodonu STOP, co powoduje rozpad rybosomu
i odłączenie syntezowanego białka[5].
Największą rolę w procesie translacji odgrywa 16S rRNA (rybosomalne RNA wchodzące
w skład małej podjednostki rybosomu), którego fragment na końcu 3' jest częściowo komplementarny do miejsca wiązania rybosomu na matrycy mRNA zwanego również sekwencją
Shine-Dalgarno. Jest także wiadome, że stopień dopasowania pomiędzy tymi dwoma sekwencjami wpływa na efektywność translacji. Dodatkowo tworzenie drugorzędowych struktur
przez RNA w regionach przylegających do miejsca wiązania rybosomu i kodonu inicjacyjnego
również mogą zmienić dostępność miejsca wiązania dla 16S rRNA, co powoduje zmianę
wydajności translacji. Mechanizm tworzenia struktur drugorzędowych jest regulowany dzięki
obecności siRNA i ich białek opiekuńczych, które poprzez oddziaływania z mRNA odsłaniają
miejsce wiązania rybosomu i umożliwiają inicjację procesu translacji, co obserwuje się
w pewnych genach E. coli[2].
Inną grupą cząsteczek biorącą udział w inicjacji translacji są ryboprzełączniki, które zmieniają konformację pod wpływem przyłączenia do aptameru liganda, co powoduje odsłonięcie
lub zakrycie miejsca, do którego może przyłączyć się rybosom. Mechanizm ten jest idealny
do kontrolowania ekspresji komórkowej[2].
Kolejną regulującą ten proces strukturą są rybozymy, czyli małe jądrowe rybonukleoproteiny (snRNP, ang. small nuclear ribonucleoproteins), które biorą udział w procesie wycinania
intronów i łączenia egzonów[1][8]. Połączono je z aptamerami tworząc kompleks zależny
od przyłączonego liganda nazywany aptozymem. W zależności od reakcji na ligand jego
obecność może oznaczać aktywację genu przez rozpoczęcie wycinania intronów lub represjonować ekspresję przez zatrzymanie składania mRNA[2].
Opisane powyżej mechanizmy są przykładami mechanizmów regulacji ekspresji genów
przez RNA, które wykorzystywane w inżynierii genetycznej mogą pomóc w m.in. wyciszaniu
lub aktywacji danych genów. Warto również wspomnieć o cząsteczkach RNA biorących udział
w obróbce potranslacyjnej białek, które również mogą być inspiracją w planowaniu nowych
rozwiązań biotechnologicznych[2].
ZNACZENIE RNA W REGULACJI EKSPRESJI GENÓW | Anna Daniłowicz
DEGRADACJA mRNA
Fragmenty RNA kontrolują również proces degradacji mRNA. W przypadku bakterii
degradacja jest prowadzona przez degradosom, składający się z RNazy E (endonukleazy),
fosforylazy polinukleotydowej (PNPaza) usuwającej nukleotydy od końca 3' i zależnej od obecności fosforu jako kosubstratu oraz helikazy RhIB, rozbijającej struktury spinki do włosów.
Działalność RNazy E dotyczy głownie RNA jednoniciowych, struktury drugorzędowe hamują
jej aktywność, co czyni je czynnikiem ograniczającym ten proces[1][2].
Interakcje pomiędzy siRNA i mRNA prowadzą do degradacji matrycy do syntezy białek
poprzez działalność endonukleaz takich jak RNazy III i E, co powoduje zahamowanie inicjacji
translacji, często nieodwracalnie. Większość siRNA powoduje degradację, ale niekiedy także
może stabilizować mRNA[2].
Rybozymy także katalizują degradację mRNA. Przykładem jest rybozym klasy glmS,
który w odpowiedzi na przyłączenie się fosforanu glukozaminy szybko rozkłada matrycę
do syntezy białek.
W przypadku ryboprzełączników, oprócz pośredniego działania poprzez opisany już
powyżej proces hamowania translacji, odkryto w ostatnich latach, że w E. coli mogą one
indukować bezpośrednio rozkład mRNA, a nawet blokować inicjację translacji poprzez zmianę
wynikającą z przyłączenia ligandu skutkującym wystawieniem na działanie RNazy E [2].
JAK ZNALEŹĆ POWIĄZANIE POMIĘDZY SEKWENCJĄ RNA I JEGO STRUKTURĄ?
Ważnym elementem badań nad wykorzystaniem wyżej wymienionych mechanizmów
jest dogłębne poznanie zależności między sekwencją i konformacją oraz poznanie zasad
zachowania struktur drugorzędowych RNA. Pomoc w rozwiązaniu tego problemu oferują
narzędzia komputerowe, które pozwalają zwizualizować cząsteczkę w 3d, a także przewidzieć
jej reakcję podczas poszczególnych
etapów ekspresji genów. Najsłynniejsze algorytmy biorące pod uwagę
struktury drugorzędowe zostały opracowane w programie MC-Fold
i MCSim. Problemem są niektóre struktury tworzone przez RNA takie jak
'pseudoknocks', czyli co najmniej
podwójne pętle dodatkowo połowicznie tworzące wiązania między sąsiadującymi parami nukleotydów. Dla takich
struktur odpowiedniejsze są programy
Hotknocks i Turboknot uwzględniające
w swoich algorytmach ten problem.
Rysunek 2. Sekwencjonowanie (źródło: http://www.genengnews.com).
Istnieją także metody takie jak Kingfold
29
30
BIOLETYN 17/III/2015 | Ścieżki wiedzy
(pozwala na wizualizację zachowania RNA podczas transkrypcji), które pozwalają na obserwacje zmian w strukturze podczas samych procesów ekspresji genów. Warto również wspomnieć
o bazach struktur RNA takich jak ViennaRNA lub Unafold, które pozwalają na porównywanie
otrzymanych w trakcie badań struktur RNA[2].
Strukturę RNA można poznać również w sposób doświadczalny. Jest możliwość określenia układu przestrzennego ryboprzełączników i rybozymów poprzez NMR (ang. nuclear
magnetic resonance) lub rentgenografię strukturalną. Niestety te metody nie pozwalają
na określenie struktury sRNA. Rozwiązaniem jest chemiczna i enzymatyczna modyfikacja RNA
lub weryfikacja poprzez różnego rodzaju elektroforezy i sekwencjowanie[2].
Obiecująca wydaje się tutaj metoda RNA-Seq, która pozwala na określenie ilości RNA
polegająca na izolacji RNA, jego fragmentacji i konwersji do DNA przy użyciu przypadkowych
starterów. Następnie sekwencjonuje się otrzymany materiał i porównuje się sekwencje
z danymi zamieszczonymi na specjalnej platformie. Strukturę RNA można uzyskać za pomocą
metody SHAPE-Seq (ang. selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension
sequencing), w której używa się chemicznych odczynników wpływających na strukturę drugorzędową i czwartorzędową RNA. Translację i transkrypcję RNA bada się izolując rybosomy
przeprowadzające właśnie translację i analizując fragmenty mRNA niezwiązane z białkiem.
Do badanie oddziaływań RNA z białkami używa się immunoprecypitacji RNA
(RIP-Seq- ang. RNA immunoprecipitation- sequencing), gdzie obrazowo ujmując sprawdza się,
które białko odpowiada badanej sekwencji. Materiał wyjściowy poddaje się odwrotnej transkrypcji i następnie sekwencjonuję się go, aby sprawdzić, która sekwencja reaguje z badanym
białkiem. Metody te określa się mianem technik NGS (ang. next-generation sequencing) [2].
PODSUMOWANIE
Wykorzystanie RNA w biologii syntetycznej stanowi innowacyjny potencjał dla dalszych
badań i jest inspiracją do poszukiwań rozwiązań opartych na naturalnych mechanizmach
regulacji ekspresji genów przez cząsteczki RNA. Rozwijające się metody laboratoryjne i techniki komputerowe pozwolą na coraz lepsze poznanie i wykorzystanie w praktyce wiedzy o tych
procesach, co pozwoli na ukierunkowanie komórek na produkcję wymaganych substancji,
np. dzięki sztucznym ryboprzełącznikom można produkować antybiotyki i niektóre białka [2].
ŹRÓDŁA BIBLIOGRAFICZNE:
1.
Brown T.A., Genomy, PWN, Warszawa 2012.
2.
Chappell J., Takahashi M., Meyer S., Loughrey D., Watters J., Lucks J., The centrality of RNA
for engineering gene expression, „Biotechnology Journal” 2013, nr 8, s. 1379-1395.
3.
Grosshance H., Filipowicz W.: The expanding world of small RNAs, Nature, 2008, vol. 451,
str. 414-416.
ZNACZENIE RNA W REGULACJI EKSPRESJI GENÓW | Anna Daniłowicz
4.
Turner P., McLennan A.,Bates A., White M.: Krótkie wykłady. Biologia molekularna,
Wydawnictwo PWN, Warszawa 2011.
5.
Ziembińska A., Lalik A., Węgrzyn A.: Markery Molekularne. Podstawy dla studentów
kierunków technicznych, Wyd. Politechniki Śląskiej, Gliwice 2011
6.
https://pl.wikipedia.org/wiki/Ryboprze%C5%82%C4%85cznik
7.
https://pl.wikipedia.org/wiki/Aptamer
8.
https://pl.wikipedia.org/wiki/Rybozymy
9.
https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR
10. http://crooveck.blogspot.com/2010/12/crispr-clustered-regularly-interspaced.html
31