POPULARYZATORSKI OPIS REZULTATÓW PROJEKTU (Wersja w
Transkrypt
POPULARYZATORSKI OPIS REZULTATÓW PROJEKTU (Wersja w
Nr wniosku: 205156, nr raportu: 8177. Kierownik (z rap.): mgr Jakub Andrzej Kochan POPULARYZATORSKI OPIS REZULTATÓW PROJEKTU (Wersja w języku polskim) Nie tylko obecność RNA w konkretnych komórkach, ale jego lokalizacja wewnątrzkomórkowa decyduje o jego funkcji. W nowotworach, a także w przypadku innych schorzeń, transkrypty są często znajdywane w niewłaściwych dla nich lokalizacjach. Z tego powodu w ciągu ostatnich lat coraz więcej badań skupia się na analizie położenia RNA oraz poszukiwaniu metod obrazowania transkryptów. Świadomość, że ekspresja genów w poszczególnych komórkach w sposób znaczący różni się od uśrednionego zachowania całych populacji przyczyniła się do rozwoju nowych metod pozwalających na ilościowe oznaczenie RNA w pojedynczych komórkach. Jedną z nich jest smRNA FISH – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ do detekcji RNA połączona z analizą mikroskopową uzyskanych preparatów. Metoda ta pozwala na uzyskanie nieosiągalnej do tej pory czułości, specyficzności sygnału i znakomitej jakości obrazu. Jest to jedyna dostępna metoda pozwalająca na proste, precyzyjne i stosunkowo szybkie oznaczanie ilości RNA w utrwalonych komórkach. Prawdziwe wyzwanie stanowi jednak połączenie smRNA FISH z immunofluorescencyjną detekcją białek. Realizacja projektu pozwoliła na opracowanie i sprawdzenie w naszym laboratorium procedury pozwalającej na jednoczesną detekcję białka oraz RNA opartą o metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do detekcji pojedynczych cząsteczek RNA (smRNA FISH). Połączenie tych metod otwiera nowy rozdział w badaniach oddziaływania białek z RNA, w tym na obrazowanie szczególnie interesujących świat naukowy w ostatnich latach białek regulujących czas półtrwania transkryptów (Rycina 1). Wykorzystując opracowaną procedurę po raz pierwszy w sposób bezpośredni potwierdzono oddziaływanie białka MCPIP1 z mRNA IL-6. Ponadto zbadano oddziaływanie transkryptu i białka MCPIP1 z białkami odpowiedzialnymi za regulację stabilności mRNA. Rycina 1 | Weryfikacja opracowanej procedury jednoczesnej detekcji białek i mRNA. (A) Reprezentatywne zdjęcia mikroskopowe komórek HeLa stymulowanych interleukiną 1β (IL-1β) oraz komórek kontrolnych poddanych opracowanej procedurze IF › FISH (DAPI - jądra komórkowe, NFkB - przeciwciało 1°: p65, przeciwciało 2°: Fluorescein (FITC), MCPIP1 - zestaw sond wyznakowanych barwnikiem fluorescencyjnym Quasar® 570). (B) Analiza ilości mRNA MCPIP1 - względny poziom mRNA MCPIP1 obliczony w oparciu o smRNA FISH. Wartości średnie ± SEM (smRNA FISH, n ≥ 35).