Dako Liquid Permanent Red for Immunohistochemistry and

Dako
Liquid Permanent Red
for Immunohistochemistry and In Situ Hybridization
Code K0640
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Zestaw substrat-chromogen Liquid Permanent Red (LPR) jest przeznaczony do wykonywania odczynów
immunohistochemicznych i hybrydyzacji in situ przy uŜyciu fosfatazy alkalicznej. LPR tworzy produkt reakcji o
trwałym czerwonym zabarwieniu zlokalizowany w miejscu występowania docelowego antygenu lub kwasu
nukleinowego. Produkt ten moŜna obserwować przy uŜyciu klasycznej mikroskopii świetlnej lub
fluorescencyjnej (z zastosowaniem filtra barwnika Texas Red lub filtra rodaminowego).1
Odczynniki
dostarczone
Dostarczane są następujące materiały, wystarczające do przygotowania 30 mL lub 110 mL roztworu substrat–
chromogen:
Ilość
Mała objętość
1 mL
Opis
Płynny trwały czerwony chromogen
30 mL
Bufor substratu płynnego trwałego czerwonego chromogenu
DuŜa objętość
3 mL
Płynny trwały czerwony chromogen
110 mL
Bufor substratu płynnego trwałego czerwonego chromogenu
Środki ostroŜności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Nie połykać, nie wdychać i unikać kontaktu ze skórą. W razie kontaktu ze skórą natychmiast przepłukać
wodą.
3. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
4. Niewykorzystany roztwór usuwać zgodnie z rozporządzeniami lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi.
5. Karta Charakterystyki Substancji (SDS) jest dostępna na Ŝyczenie profesjonalnych uŜytkowników.
Przechowywanie
Zestaw Dako Liquid Permanent Red naleŜy przechowywać w temperaturze 2–8°C. Je śli odczynniki są
przechowywane w warunkach innych niŜ podane w ulotce, uŜytkownik powinien zweryfikować te warunki.
Nie zamraŜać.
Przygotowanie
odczynników
1. Przed uŜyciem naleŜy odczekać, aŜ bufor substratu i chromogen uzyskają temperaturę pokojową.
2. Odmierzyć 3 mL buforu substratu LPR do probówki. Dodać do probówki jedną kroplę chromogenu LPR.
Starannie wymieszać.
3. Przygotowany odczynnik bufor substratu-chromogen naleŜy zuŜyć w ciągu 30 minut od przygotowania.
Dla uzyskania najlepszych wyników roztwór naleŜy przygotować bezpośrednio przed uŜyciem.
4. Większe ilości roztworu bufor substratu-chromogen moŜna przygotować, dodając jedną kroplę chromogenu
do kaŜdych 3 mL buforu substratu.
(127871-001)
P04032PL_01_K0640/2015.07 s. 1/3
Procedura
Po zakończeniu inkubacji z odczynnikiem znakowanym fosfatazą alkaliczną naleŜy spłukać nadmiar
odczynnika buforem płuczącym (nie naleŜy kierować strumienia bezpośrednio na powierzchnię próbki).
Umieścić próbkę w kąpieli z buforem na około 5 minut.
Po zakończeniu płukania strząsnąć nadmiar buforu i ostroŜnie wytrzeć szkiełko wokół próbki.
KROK 1. Zatopić preparaty w przygotowanym roztworze LPR. Inkubować przez 5–20 minut. Optymalny czas
inkubacji moŜe się zmieniać w zaleŜności od stęŜenia antygenu i/lub utrwalenia materiału, dlatego w
kaŜdym laboratorium jest on ustalany indywidualnie. OstroŜnie przepłukać wodą do odczynników
laboratoryjnych.
KROK 2. Barwienie kontrastowe hematoksyliną, jeśli jest wymagane. (Patrz zalecenia poniŜej). Inkubować
przez 2–5 minut, w zaleŜności od stęŜenia stosowanego roztworu hematoksyliny lub poŜądanego
nasilenia barwienia kontrastowego.
Zalecenia:
Dako Hematoxylin (nr kat. S3302) — zalecana inkubacja przez 2 minuty dla skrawków tkankowych.
Dako Hematoxylin (nr kat. S3309) — zalecana inkubacja przez 4 minuty dla preparatów
cytologicznych.
Dako Automation Hematoxylin (nr kat. S3301) — produkt zalecany do stosowania z urządzeniami
Dako Autostainer.
OstroŜnie przepłukać wodą do odczynników laboratoryjnych, a następnie umieścić w kąpieli wodnej
na 2–5 minut.
Upewnić się, Ŝe wszystkie pozostałości hematoksyliny zostały dokładnie wypłukane.
KROK 3. Przykryć wodnym środkiem do zatapiania lub środkiem do trwałego zatapiania.
W przypadku wodnego środka do zatapiania zaleca się zastosowanie produktów: Dako Glycergel
Mounting Medium (nr kat. C0563), Faramount Aqueous Mounting Medium (nr kat. S3025) lub
Ultramount (nr kat. S1964).
W przypadku niewodnego środka do trwałego zatapiania zaleca się całkowite wysuszenie preparatów na
powietrzu w temperaturze pokojowej lub przez 1 godzinę w temperaturze 60°C, a nast ępnie inkubację w
ksylenie lub odpowiedniku ksylenu przez 5 minut.
NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe w niektórych przypadkach przed nałoŜeniem szkiełek nakrywkowych na preparatach
poddanych suszeniu na powietrzu mogą być obserwowane niewielkie punktowe artefakty. Problem ten moŜna
rozwiązać, stosując się do jednej z poniŜszych procedur:
Opcja 1: bezpośrednie przeniesienie skrawków tkankowych z urządzenia Autostainer do alkoholu z
zastosowaniem:
a) 99% roztworu alkoholu i inkubacji przez maksymalnie 2 min lub
b) trzech następujących po sobie kąpieli w 100% alkoholu, 10 zanurzeń w kaŜdej.
Następnie zanurzenie preparatów 10 razy w jednej z dwóch następujących po sobie kąpieli
ksylenowych i trwałe zatopienie.
Opcja 2: bezpośrednie przeniesienie skrawków tkankowych z urządzenia Autostainer do gradientu
stęŜeń alkoholu, tylko na 30 sekund do kaŜdego stęŜenia, oraz bez zanurzania w ksylenie, a
następnie trwałe zatopienie.
DłuŜsze poddanie preparatów działaniu alkoholu i/lub ksylenu moŜe prowadzić do ekstrakcji chromogenu i w
konsekwencji słabszego wybarwienia.
PowyŜszych procedur nie przetestowano z uŜyciem wszystkich przeciwciał pierwotnych i w związku z tym
stanowią jedynie wskazówkę. Podobnie naleŜy zweryfikować działanie zmodyfikowanego protokołu
odwadniania oraz trwałego zatapiania względem uŜywanego przeciwciała pierwotnego. KaŜde przeciwciało
pierwotne naleŜy ocenić z uŜyciem zmodyfikowanego protokołu odwadniania w celu potwierdzenia, Ŝe
uzyskany odczyn jest identyczny z odczynem opisanym w części „Charakterystyka pracy”.
(127871-001)
P04032PL_01_K0640/2015.07 s. 2/3
Wyniki
Toksyc
W przebiegu oznaczenia przy uŜyciu zestawu substrat-chromogen Liquid Permanent Red powstaje produkt
reakcji o trwałym czerwonym zabarwieniu zlokalizowany w miejscu występowania docelowego antygenu lub
kwasu nukleinowego. Produkt ten moŜna obserwować przy uŜyciu klasycznej mikroskopii świetlnej lub
fluorescencyjnej (z zastosowaniem filtra barwnika Texas Red lub filtra rodaminowego).1
W celu prawidłowej interpretacji równolegle z odczynami badanych próbek naleŜy wykonywać dodatnie i
ujemne próby kontrolne.
Kontrole dodatnie stosuje się jako wskaźniki prawidłowego przygotowania i obróbki preparatów. Kontrole
ujemne są przydatne do oceny odczynu nieswoistego.
Aktywność endogennej fosfatazy alkalicznej w niektórych tkankach moŜe powodować uzyskanie wyników
fałszywie dodatnich. Aktywność tę moŜna zahamować poprzez dodanie odczynnika Dako Dual Endogenous
Enzyme Block (nr kat. S2003) lub Levamisole (nr kat. X3021). Lewamizol nie hamuje izoform jelitowej i
łoŜyskowej fosfatazy alkalicznej i moŜe nie przynieść oczekiwanego efektu w przypadku barwienia próbek
zawierających te izoenzymy. Dodatkowe informacje dotyczące stosowania znajdują się w ulotkach produktów
o numerach kat. S2003 i X3021.
Piśmiennictwo
1. Speel, EJM, et al. A novel fluorescence detection method for in situ hybridization, based on the alkaline
phosphatase-Fast Red reaction. J Histochem Cytochem 1992; 40(9):1299
Wydanie 07/15
(127871-001)
P04032PL_01_K0640/2015.07 s. 3/3