4. Woda, gleba i powietrze jako środowisko życia

4. Woda, gleba i powietrze jako rodowisko ycia drobnoustrojów
Zagadnienia:
1. Metody liczenia drobnoustrojów
2. Czynniki decyduj ce o wyst powaniu drobnoustrojów w wodzie, glebie i powietrzu
3. Wska niki stanu sanitarnego wody i gleb (miano i wska nik coli); organizmy
wska nikowe w powietrzu (Pseudomonas fluorescens, promieniowce, gronkowce)
4. Metody oznaczania mikrobiologicznego zanieczyszczenia wody, gleby i powietrza
Literatura:
Ró alski A.: wiczenia z mikrobiologii ogólnej, cz. I, 1998.
Schlegel H.: Mikrobiologia ogólna, 2001.
Normy: PN-EN ISO 6222:2004, PN-EN ISO 7899-1:2004, PN-EN ISO 7899-2:2004, PN-EN
ISO 9308-1:2004/Ap2005, PN-EN ISO 9308-3:2002, PN-ISO 8199:2001, PN-75/C-04615 –
arkusz 05, PN-77/C-04615 – arkusz 07, PN-89/Z-04111.01, PN-89/Z-04111.02, PN-89/Z04111.03
Materiały:
woda destylowana, r-ór soli fizjologicznej, podło e ENDO, fiolet krystaliczny, ziemia
ogrodowa, 1% woda peptonowa, odczynnik Nesslera, agar od ywczy, hodowla E. coli, hodowla
B. subtilis
Aparatura i szkło:
mikroskop wietlny z obiektywem immersyjnym, komora Thoma, probówki, płytki Petriego
Wykonanie wiczenia:
1 . O z n a c z a n i e l i c z b y b a k t e r i i metoda Wrighta.
Metoda ta oparta jest na ustaleniu liczby drobnoustrojów w porównaniu do znanej liczby
komórek dro d y. Oznaczenie liczby komórek dro d y w l ml wykonuje si za
pomoc hemocytometru Thoma (lub Bürkera). Komora Thoma ma gł boko 0,1 mm; na
jej dnie znajduje si siatka składaj ca si z 16 du ych kwadratów, ka dy z nich podzielony
jest na 16 małych; wymiary jednej małej komory wynosz : wysoko - 1/10 mm,
szeroko - 1/20 mm, długo - 1/20 mm; tak wi c powierzchnia małej komory wynosi
1/400 mm2, a jej obj to 1/4000 mm3.
Po przygotowaniu zawiesiny dro d y wprowadza si j do komory Thoma.
Nast pnie pod mikroskopem liczy si komórki dro d y w 5 du ych tj. w 80 małych
kwadracikach komory. Liczb komórek dro d y (Y) w 1 mm3 ustala si według wzoru:
liczba komórek × rozcie czenie × 4000
Y=
80
Dla ustalenia liczby badanych drobnoustrojów, w tym wypadku, B. subtilis nale y:
- skos z hodowl B. subtilis zmy 3 ml 0,85% NaCl; zawiesin bakterii
rozcie czy trzykrotnie,
- zmiesza 0,5 ml zawiesiny dro d y i 0,5 ml zawiesiny bakteryjnej,
- sporz dzi rozmaz na szkiełku podstawowym, wysuszy go a nast pnie utrwali w
płomieniu palnika,
- utrwalony rozmaz barwi fioletem krystalicznym przez 2 minuty,
- fiolet zmy wod destylowan i preparat wysuszy ,
- u ywaj c mikroskopu zliczy liczb komórek dro d y i bakterii w 20 polach widzenia,
- obliczy liczb komórek bakteryjnych według wzoru:
Liczba bakterii w l ml =
liczba bakterii × Y × 1000
,
liczba drozdzy
gdzie: (Y) - liczba komórek dro d y w l mm 3 , 1000 - przelicznik na l ml.
2. Oznaczanie liczby bakterii metod płytkow
W metodzie tej liczb komórek bakterii okre la si na podstawie liczby koloni wyrosłych po
okresie inkubacji na podło u od ywczym. Dla ustalenia liczby bakterii tj. E. coli nale y:
- sporz dzi zawiesin bakterii E. coli zmywaj c hodowl ze skosu 3 ml 0,85% NaCl,
- przygotowa rozcie czenia wg schematu na rys. 1,
Rys. 1. Schemat rozcie cze bakterii
wysia po 1 ml zawiesiny na E. coli - na 2 płytki z podło em ENDO z rozcie cze : 10 -7 ,
10 -8 i 10 -9 ,
- hodowle inkubowa przez noc w temperaturze 37°C,
- po okresie inkubacji zliczy wyrosłe kolonie na podło ach od ywczych,
- liczb komórek w zawiesinie wyj ciowej obliczy mno c liczb wyrosłych koloni przez
dane rozcie czenie.
3. Oznaczanie miana bakterii amonifikacyjnych w próbce gleby metod NPL:
- 2g wie ej masy gleby zawiesi w 20 ml płynu fizjologicznego (rozcie czenie 10-1), wytrz sa
kilka minut,
- wykona szereg rozcie cze : do szeregu probówek zawieraj cych 4,5ml płynu
fizjologicznego dodawa po 0,5ml poprzedniego rozcie czenia (rozcie czenia 10-2, 10-3, 10-4,
10-5, 10 -6),
- z ka dego rozcie czenia wysia po l ml do dwóch probówek z 9ml wody peptonowej,
- hodowl inkubowa 7 dni w temp. 26°C,
- po okresie inkubacji wykona obserwacje wzrostu bakterii (zm tnienie, obecno ko ucha,
osadu), a tak e oznaczenia odczynu pH podło a oraz obecno ci amoniaku - odczynnikiem
Nesslera,
-
-
odczyn podło a sprawdzi zanurzaj c krótki fragment paska wska nikowego w po ywce,
do probówek doda po 0,2ml odczynnika Nesslera. Pomara czowa barwa wiadczy o
obecno ci amoniaku,
stwierdzenie wzrostu bakterii, obecno ci amoniaku i alkalizacji podło a do pH ok. 8,0- 9,0
wiadczy o zaszłym procesie amonifikacji. Wynik oznaczenia poda jako NPL i miano
bakterii amonifikacyjnych.
4. Oznaczanie ogólnej liczby bakterii w powietrzu metod sedymentacyjn :
-
przygotowa trzy płytki Petriego z agarem od ywczym,
ustawi płytki w miejscu poboru próbki powietrza, zdj wieczka i podda płytki ekspozycji,
przez 15 minut. W tym czasie drobnoustroje sedymentuj na powierzchni po ywki,
płytki zakry , inkubowa 24h w temp. 37°C,
policzy kolonie wyrosłe na płytkach, obliczy liczb bakterii w 1m3 powietrza wg
wzoru:
4
A=
5 ⋅ a ⋅10
2
π ⋅r ⋅t
gdzie: a - rednia liczba kolonii bakterii na płytce, r - promie płytki Petriego [cm], t - czas
ekspozycji [min],
- zinterpretowa wynik oceniaj c stopie zanieczyszczenia powietrza.