Jak przygotować wodę wolną od RNAz (H2O

Jak przygotować wodę wolną od
RNAz (H2O-DEPC) — protokół
Woda wolna od RNAz to podstawa wszelkich manipulacji z RNA, podatnym
na działanie wszędobylskich i bardzo stabilnych rybonukleaz. Wodę taką,
najlepszej jakości, można zakupić u dystrybutorów większych firm
sprzedających odczynniki dla biologii molekularnej. Gotowa woda
ultraczysta jest niezbędna w sytuacji, gdy jakość każdej próbki jest
niezwykle ważna (np. w diagnostyce medycznej), jednak w placówkach
naukowych i przy zastosowaniach niekomercyjnych warto pomyśleć o
własnoręcznym przygotowaniu wody do izolacji RNA. Jest to tak zwana
„woda DEPC”, nazywana tak od odczynnika, który jest używany do
degradacji RNAz.
Dlaczego akurat DEPC?
Dietylopirowęglan to silny środek alkilujący, któremu nie straszne są żadne
białka, także bardzo stabilne i powszechne w środowisku RNAzy. Zaletą DEPC jest
za to jego termolabilność i rozpad do neutralnych związków chemicznych pod
wpływem autoklawowania. DEPC rozpada się na CO2, H2O oraz etanol, który w
niewielkim stężeniu nie zagraża RNA. W temperaturze pokojowej przy dłuższym
przechowywaniu lub przy zbyt wysokim stężeniu dietylopirowęglan ulega
przekształceniu do niższych estrów, dlatego jeżeli trąci on owocowym, estrowym
zapachem, nie nadaje się już do neutralizacji nukleaz.
Przygotowanie wody wolnej od rybonukleaz:
1. Do 1 litra wody destylowanej (najlepiej zaś poddanej odwrotnej osmozie) dodaj
1ml dietylopirowęglanu (DEPC), by otrzymać roztwór 0.1% (v/v) .
2. Dobrze wymieszaj, pozwól roztworowi odstać się w temperaturze pokojowej ok.
60-90 minut
3. Autoklawuj w standardowych warunkach (121*, 15 minut, 1 Bar)
4. Voila! Woda wolna od RNAz gotowa. Przed użyciem pozwól jej ostygnąć do
temperatury pokojowej. Dobrze jest przepipetować część świeżo przygotowanej
wody na małe alikwoty np. do zakręcanych próbówek i zamrozić.
Uwagi:
* DEPC jest silnie toksyczny i kancerogenny (odczynnik alkilujący!), należy
obchodzić się z nim ostrożnie.
* Dietylopirowęglan jest niestabilny rozcieńczony w wodzie i buforach, dlatego
roztwór do autoklawowania przygotowuje się na świeżo, a przechowuje się już po
sterylizacji jako czystą wodę DEPC.
Marzena Pieronkiewicz
Data publikacji: 27.01.2017r.