Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin, High

Monoclonal Mouse
Anti-Human
Cytokeratin, High Molecular Weight
Klon 34βE12
Nr kat. M0630
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Wysokocząsteczkowe (HMW) mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkim cytokeratynom, klon
34βE12(1) (anty-CK HMW, 34βE12), są przeznaczone do analiz immunohistochemicznych. Przeciwciała te są
przydatne w identyfikacji komórek podstawnych i nabłonka płaskiego w róŜnych tkankach. Wyniki dodatnie
ułatwiają odróŜnienie łagodnych nowotworów gruczołu krokowego od gruczolakoraka prostaty, jak równieŜ
wykrywanie róŜnicowania komórek płaskonabłonkowych w przypadku słabo zróŜnicowanych nowotworów.
Interpretacja kliniczna wystąpienia barwienia lub jego braku musi być uzupełniona o badania morfologiczne z
wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa
z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Cytokeratyny to białka występujące w filamentach pośrednich cytoszkieletu, odgrywające kluczową rolę w
rozwoju i róŜnicowaniu komórek nabłonka. Zidentyfikowano około dwudziestu róŜnych cytokeratyn, które
sklasyfikowano się i oznaczono numerami na podstawie masy cząsteczkowej i punktu izoelektrycznego (2).
Zasadniczo cytokeratyny o niskiej masie cząsteczkowej (40–54 kDa) występują w nabłonku innym niŜ
wielowarstwowy płaski — 7–8 i/lub 17–20 w klasyfikacji Molla (3). Cytokeratyny o wysokiej masie cząsteczkowej
(48-67 kDa) występują w nabłonku wielowarstwowym płaskim – kategorie 1-6 i (lub) 9-16 (3).
Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC.
Odczynnik
dostarczony
Mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci płynnej hodowli komórkowej w buforze Tris/HCl o
stęŜeniu 0,05 mol/l i pH 7,2, zawierającym azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/l. Produkt zawiera białko
stabilizujące.
Klon: 34βE12(1)
Izotyp: IgG1, kappa
StęŜenie mysiego przeciwciała IgG w mg/l: Patrz: informacja podana na etykiecie fiolki.
StęŜenie białek w róŜnych partiach moŜe się róŜnić bez wpływu na rozcieńczenie optymalne. W celu
zapewnienia jednolitości odczynów immunohistochemicznych wykonywanych przy uŜyciu róŜnych partii
produktu, miano kaŜdej partii jest porównywane i dostosowywane do partii referencyjnej.
Immunogen
Solubilizowana immunogenna keratyna wyizolowana z komórek warstwy rogowej ludzkiego naskórka (1).
Swoistość
Wykazano, Ŝe wysokocząsteczkowe przeciwciała przeciwko cytokeratynie (Anti-CK HMW), klon 34βE12, w
analizie Western blot reagują z białkami o masie cząsteczkowej 66, 57, 51 i 49 kDa, które odpowiadają
cytokeratynom 1, 5, 10 oraz 14 wg klasyfikacji Molla (1, 2, 4). Ref
Środki ostroŜności
1.
Do stosowania przez wyszkolony personel.
2.
Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek
sodu, zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe
reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie
wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się
azydku metalu w kanalizacji.
3.
Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4.
W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5.
Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z rozporządzeniami lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi.
Przechowywanie
Skrócona instrukcja
uŜytkownika*
(112958-003)
Przechowywać w temperaturze 2–8 °C. Nie u Ŝywać po upływie daty waŜności podanej na fiolce. Jeśli odczynniki
są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie warunki. Nie
ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem próbek
pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole pozytywne i negatywne. W wypadku nieoczekiwanego
wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się
problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Krok
Komentarze
Utrwalanie
Obróbka wstępna
Formalina
EnVision FLEX™, High pH (nr kat. K8004)
Rozcieńczenie
Bufor do
1:100
Antibody Diluent (rozcieńczalnik do przeciwciał)
20 min HIER, 3 w 1 z uŜyciem
PT Link i PT Link Rinse Station
Inkubacja 20 min
Rozcieńczyć bezpośrednio
303295PL_003_M0630/2012.07 1/4
rozcieńczania
Kontrola
negatywna
Wizualizacja
firmy Dako (nr kat. S0809)
Negative Control, Mouse IgG1 (nr kat. X0931)
przed uŜyciem
Inkubacja 20 min
EnVision™ FLEX, High pH (nr kat. K8000/K8010)
Barwnik
kontrastowy
Tkanka kontrolna
Szkiełka
EnVision™ FLEX Hematoxylin (nr kat.
K8008/K8018)
Migdałek
FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020)
Inkubacja 20 min, inkubacja w
odczynniku DAB+ 2x5 min
Inkubacja 5 min
Zatapianie
preparatu
Wymagane niewodne, trwałe zatapianie preparatów
Oprzyrządowanie
Autostainer Link 48 i Autostainer Plus
Odczyn cytoplazmatyczny
Zaleca się stosowanie w celu
uzyskania lepszego przylegania
skrawków tkankowych do
szkiełek.
Po przeprowadzeniu barwienia,
skrawki muszą być odwodnione,
oczyszczone i zatopione w
środku do trwałego zatapiania.
NaleŜy stosować fiolki
dostosowane do aparatu (nr kat.
SK200-SK203 i S3425)
*UŜytkownik jest zobowiązany przeczytać ulotki dostarczane do opakowań, które zawierają dokładne instrukcje
przeprowadzania procedury barwienia i postępowania z produktem.
Przygotowanie próbek
Skrawki parafinowe: Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków
zatapianych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o grubości około 4 µm.
Obróbka wstępna: Wymagane jest poddanie utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER). Optymalne wyniki uzyskuje po przeprowadzeniu na
tkankach wstępnej obróbki HIER przy uŜyciu roztworu EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)
(nr kat. K8004). Odparafinowanie, nawodnienie i cieplne odmaskowanie antygenu (HIER) moŜna przeprowadzić
z uŜyciem Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe informacje zawiera instrukcja uŜytkownika aparatu
PT Link (PT Link User Guide). Dla aparatów PT Link naleŜy stosować następujące parametry: Temperatura
ogrzewania wstępnego: 65 °C; temperatura i czas odmaskowania antygenu: 97 °C przez 20 (±1) minut,
następnie ochłodzić do 65 °C. Usun ąć statywy na szkiełka ze zbiornika aparatu PT Link i natychmiast zanurzyć
szkiełka w słoju/zbiorniku (np. PT Link Rinse Station (nr kat. PT109)) wypełnionym rozcieńczonym buforem
EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x) (nr kat. K8007) o temperaturze pokojowej. Zostawić szkiełka w buforze
Wash Buffer na 1-5 minut.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą zostać
odwodnione, oczyszczone i zatopione w środku do trwałego zatapiania.
Rozcieńczenie: Zalecany współczynnik rozcieńczenia wysokocząsteczkowych mysich przeciwciał
monoklonalnych przeciwko ludzkim cytokeratynom, klon 34βE12 (nr kat. M0630) wynosi 1:100. Przeciwciała
naleŜy rozcieńczyć z uŜyciem rozcieńczalnika Dako Antibody Diluent (nr kat. S0809). Fragmenty tkanki poddane
obróbce wstępnej inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Są to jednak wyłącznie wytyczne.
Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i
powinny być weryfikowane indywidualnie w kaŜdym laboratorium.
Procedura barwienia
Kontrola negatywna: Zalecanym odczynnikiem do kontroli negatywnej jest Dako Negative Control, Mouse IgG1
(nr kat. X0931) rozcieńczony do tego samego stęŜenia IgG1 , co przeciwciała pierwotne. O ile nie potwierdzono
stabilności rozcieńczonych przeciwciał i kontroli negatywnej w rzeczywistej procedurze wykonania odczynu,
rozcieńczyć te odczynniki bezpośrednio przed uŜyciem. Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od
pacjentów naleŜy wykonywać pozytywne i negatywne próby kontrolne.
Wizualizacja: Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH, (nr kat. K8000/K8010) przy
zastosowaniu trwającego 20 minut okresu inkubacji w temperaturze pokojowej. Postępować zgodnie z procedurą
dostarczoną z wybranymi systemami do wizualizacji.
Automatyzacja: Przeciwciała dobrze nadają się do wykonywania odczynów immunohistochemicznych w
systemach zautomatyzowanych, takich jak Dako Autostainer, Autostainer Plus oraz Autostainer Link, a takŜe PT
Link do obróbki wstępnej.
Charakterystyka
działania
Barwienie kontrastowe: Zalecanym barwnikiem kontrastowym jest EnVision FLEX Hematoxylin (nr kat.
K8008/K8018). W celu uzyskania optymalnych wyników zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do
zatapiania.
Kontrole: Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać pozytywne i
negatywne próby kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Tkanka uŜyta w kontroli pozytywnej powinna
obejmować nabłonki wielokątne, natomiast komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany
dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”.
Przeciwciała dają odczyn cytoplazmatyczny.
Tkanki prawidłowe (5):
Rodzaj tkanki
Składniki tkankowe dające
Rodzaj tkanki
Składniki tkankowe dające
(liczba badanych
dodatni odczyn
(liczba
dodatni odczyn
przypadków)
badanych
przypadków)
Nadnercza (3)
(112958-003)
0/3
Jajniki (3)
3/3 Nabłonek powierzchniowy (80–
303295PL_003_M0630/2012.07 2/4
Szpik kostny (3)
0/3
Trzustka (3)
Sutek (2)
Przytarczyce (3)
MóŜdŜek (3)
2/2 Nabłonek gruczołu i przewodu
(80%), cytoplazmatyczny
0/3
Mózgowie (3)
0/3
Szyjka macicy (2)
2/2 Powierzchniowy nabłonek płaski
(100%), cytoplazmatyczny
Jelito grube (3)
3/3 Nabłonek powierzchniowy (10%),
cytoplazmatyczny
3/3 Nabłonek płaski (100%),
cytoplazmatyczny
Przełyk (3)
Serce (3/3)
0/3
Nerka (3)
3/3 Nabłonek kanalika nerkowego
(10–30%), cytoplazmatyczny
3/3 Nabłonek przewodu Ŝółciowego
(50%), cytoplazmatyczny
3/3 Nabłonek oskrzeli (10%),
cytoplazmatyczny
Wątroba (3)
Płuca (3)
Komórki
międzybłonka (2)
Mięsień sercowy (3)
Mięśnie szkieletowe
(3)
Nerwy obwodowe (3)
Przysadka
mózgowa (3)
Gruczoł krokowy
(3)
Gruczoł ślinowy (3)
Skóra (3)
Jelito cienkie (3)
Śledziona (3)
śołądek (3)
3/3 Nabłonek pęcherzykowy (50%),
cytoplazmatyczny
2/2 Nabłonek mezodermalny (100%),
cytoplazmatyczny
0/3
Jądro (3)
Grasica (3)
0/3
Migdałki (3)
0/3
Macica (2)
Tarczyca (3)
100%), cytoplazmatyczny
3/3 Nabłonek przewodu
trzustkowego (50–80%),
cytoplazmatyczny
0/3
0/3
3/3 Komórki podstawne i nabłonek
przewodu (90%), cytoplazmatyczny
3/3 Nabłonek przewodu
wydzielniczego (100%),
cytoplazmatyczny
3/3 Nabłonek płaski (100%),
cytoplazmatyczny
3/3 Nabłonek przewodu i gruczołu
potowego (80–100%),
cytoplazmatyczny
1/3 Nabłonek gruczołu łojowego
(100%) cytoplazmatyczny
3/3 Nabłonek (20–50%),
cytoplazmatyczny
0/3
3/3 Nabłonek gruczołu dołka
Ŝołądkowego (10–30%),
cytoplazmatyczny
0/3
3/3 Nabłonek płaski (100%),
cytoplazmatyczny
1/3 Komórki pęcherzykowe (5%),
cytoplazmatyczny
3/3 Nabłonek płaski (100%),
cytoplazmatyczny
2/2 Nabłonek endometrium (580%), cytoplazmatyczny
Tkanki patologiczne: Dodatnią immunoreaktywność z uŜyciem przeciwciał anty-CK HMW, 34βE12 odnotowano w
przypadku raka kolczystokomórkowego, przewodowego oraz przejściowonabłonkowego, w tym: raka
kolczystokomórkowego skóry, płuc i jamy nosowo-gardłowej; raka przewodowego sutka, trzustki, dróg
Ŝółciowych oraz gruczołu ślinowego; raka przejściowonabłonkowego pęcherza moczowego i jamy nosowogardłowej oraz grasiczaków (6-11). Przeciwciała anty-CK HMW, 34βE12 wykazały równieŜ zdolność identyfikacji
międzybłoniaków nabłonkowych i jednocześnie brak reaktywności w przypadku międzybłoniaków mięsakowatych
lub desmoplastycznych (12). W przypadku gruczolakoraków jajników, przewodu Ŝołądkowo jelitowego oraz
tarczycy przeciwciała anty-CK HMW 34βE12 wykazywały zmienną skuteczność. Do nowotworów wykazujących
znaczny brak reaktywności z klonem 34βE12 zaliczają się gruczolaki narządów wydzielania wewnętrznego, rak
wątroby (rak wątrobowokomórkowy) oraz nowotwory śluzówki macicy, nerek i nowotwory neuroendokrynne (6, 7,
11). W obrębie prostaty klon 34βE12 dodatnio znakuje komórki podstawne łagodnych zmian, w tym atrofii,
atypowego rozrostu gruczolakowatego i rozrostu postwardnieniowego. Brak zabarwienia przeciwciałem anty-CK
HMW, 34βE12 warstwy podstawnej sugeruje obecność raka prostaty. W celu określenia, czy ma on złośliwy
charakter, konieczne jest uwzględnienie innych danych morfologicznych (3, 7, 13-15). Stwierdzono, Ŝe
przeciwciało anty-CK HMW, klon 34βE12 znakuje komórki nowotworowe w podzbiorze gruczolakoraków o
budowie groniastej (3,15). W przypadku klonu 34βE12 stwierdzono równieŜ pozorne barwienie immunologiczne
gwiaździaków (7,16).
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
(112958-003)
Gown AM, Vogel AM. Monoclonal antibodies to intermediate filament proteins of human cells: Unique and
cross-reacting antibodies. J Cell Biol 1982; 95:414-24.
Moll R, Franke WW, Schiller DL. The catalog of human cytokeratins: Patterns of expression in normal
epithelia, tumors and cultured cells. Cell 1982; 31:11-24.
Miettinen M. Keratin immunohistochemistry: update of applications and pitfalls. Pathol Ann 1993; 28:11343.
Gown AM, Vogel AM. Monoclonal antibodies to human intermediate filament proteins II. Distribution of
filaments in normal human tissues. Amer J Pathol 1984; 114:309-21.
IR051(IHC003-D09346).
Gown AM, Vogel AM. Monoclonal antibodies to human intermediate filament proteins. III. Analysis of
tumors. Am J Clin Pathol.1985 Oct;84(4):413-24.
Diagnostic immunohistochemistry: theranostic and genomic applications. Dabbs, David J. 3rd ed.
Philadelphia, PA : Saunders /Elsevier, 2010.
Hurlimann J, Gardiol D. Immunohistochemistry in the differential diagnosis of liver carcinomas. Amer J Surg
Pathol 1991; 15:280-8.
Dairkee SH, Puett L, Hackett AJ. Expression of basal and luminal epithelium-specific keratins in normal,
benign and malignant breast tissue. J Nat Can Inst 1988; 80:691-5.
Thike AA, Cheok PY, Jara-Lazaro AR, Tan B, Tan P, Tan PH. Triple-negative breast cancer:
clinicopathological characteristics and relationship with basal-like breast cancer. Mod Pathol
2010;23(1):123-33.
Gown AM, Vogel AM. Anti-intermediate fillament monoclonal antibodies; tissue-specific tools in tumor
303295PL_003_M0630/2012.07 3/4
12.
13.
14.
15.
16.
diagnosis. Surv Synth Pathol Res. 1984;3:369-385.
Bolen JW, Hammar SP, McNutt MA. Reactive and neoplastic serosal tissue: a light-microscopic,
ultrastructural, and immunocytochemical study. Amer J Surg Pathol 1986; 10:34-47.
Varma M, Amin MB, Linden MD, Zarbo RJ. Discriminant staining pattern of small glandular and
preneoplastic lesions of the prostate using high molecular weight cytokeratin antibody—A study of 301
consecutive needle biopsies. Mod Pathol 1997; 10:93A
O’Malley FP, Grignon DJ, Shum DT. Usefulness of immunoperoxidase staining with high-molecular-weight
cytokeratin in the differential diagnosis of small-acinar lesions of the prostate gland. Virch Arch Pathol Anat
1990; 417:191-6.
Brimo F, Epstein JI. Immunohistochemical pitfalls in prostate pathology. Hum Pathol 2012;43:313-24
Bacchi CA, Zarbo RJ, Jiang JJ, Gown AM. Do glioma cells express cytokeratin? Appl Immunohistochem
1995; 3:45-53.
Edition 07/12
(112958-003)
303295PL_003_M0630/2012.07 4/4