Cel ćwiczenia: Opis stanowiska - MEMS lab

ZASTOSOWANIE MIKROSYSTEMÓW W MEDYCYNIE
LABORATORIUM
Ćwiczenie nr 4
MIKROCYTOMETR DO BADANIA KOMÓREK BIOLOGICZNYCH
Cel ćwiczenia:
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z budową i warunkami działania mikrocytometru typu
„T” z detekcją fluorymetryczną. W ćwiczeniu badany będzie poziom sygnału
fluorescencyjnego pochodzącego od mikrokulek fluorescencyjnych, które stanowią model dla
oocytu/zarodka bydła lub trzody chlewnej.
Opis stanowiska:
1.
2.
3.
4.
5.
Krzemowo-szklany mikrocytometr typu „T”
Źródło światła: laser półprzewodnikowy o długości fali emisji 532 nm i mocy 5 mW
Kamera CCD z filtrem optycznym górnoprzepustowym FEL600 nm oraz kartą TV
Zasilacz do kamery (12 V) oraz lasera (5 V)
Komputer z oprogramowaniem
Rys. 1. Schemat budowy mikrocytometru
Rys. 2. Obszar detekcji fluorymetrycznej
Rys. 3. Idea pracy mikrocytometru
________________________________________________________________________
___
www.memslab.pl
1
Rys. 4. Schemat układu pomiarowego
Stanowisko wyposażone jest w pompę perystaltyczną, która w sposób ciągły (pulsacyjny)
podaje ciecz nośną z zawieszonymi w niej mikrokulkami fluorescencyjnymi. Kierunek
przepływu mikrokulek jest dowolny.
Przebieg ćwiczenia:
1. Zaznajomienie się z układem pomiarowym
2. Pomiary sygnału fluorescencyjnego
polistyrenowe:
emitowanego przez oznakowane kulki
1. Włączyć zasilacz.
2. Sprawdzić, czy laser oraz kamera CCD są podłączone do zasilacza (kamera: zasilacz
dogniazdkowy 12 V, laser: zasilacz MDM 5 V).
3. Włączyć komputer i zalogować się na konto Student (hasło: Student).
4. Włączyć program VirtualDub, wybrać opcję File→ Capture AVI, Video→ Preview.
Sprawdzić czy obraz z kamery CCD, która znajduje się dokładnie nad chipem jest
wyraźny.
5. W programie VirtualDub kreślić ścieżkę zapisu filmu (File→ Set Capture File).
6. Włączyć pompę perystaltyczną: początkowo włączyć duży przepływ (6), a kiedy front
cieczy dojdzie do wlotu mikrokanału zmniejszyć przepływ (1).
7. Rozpocząć proces nagrywania filmu (Capture → Start Capture).
8. W czasie nagrywania filmu co najmniej 10 kulek powinno przepłynąć przez
skrzyżowanie „T” tak, aby dobrze widoczny był sygnał fluorescencji.
9. Wyłączyć nagrywanie filmu (Capture → Stop Capture).
3. Analiza wyników pomiarów:
Analizę wyników dokonuje się na podstawie obrazów graficznych zarejestrowanych kamerą
cyfrową.
 Zmiana rozmiaru filmu
1. Uruchomić program VirtualDub.
2. Wczytać plik z filmem (File → Open video file). Pojawią się dwa okna z wczytanym
filmem.
________________________________________________________________________
___
www.memslab.pl
2
3. Następnie zmienić rozmiar analizowanego pliku (Video → Filters → Add…; pojawi
się dodatkowe okienko, w którym wybieramy filtr resize i zadajemy szerokość 320 i
wysokość 240 pikseli, po czym zatwierdzamy przyciskiem OK, dwukrotnie).
4. Kolejnym krokiem jest zapisanie filmu w formacie *.avi (File → Save as AVI).
5. Czynność tą wykonujemy dla każdego z nagranych filmów.

Analiza sygnału fluorescencji
1. Uruchomić program OPTOLABCARD software.
2. Wybrać ścieżkę zapisu wygenerowanego po analizie pliku *.xls oraz zdjęcia (Change
dir).
3. Wczytać wybrany film do analizy (Select movie).
4. Po wczytaniu pliku w oknie po prawej stronie pojawi się obraz do analizy.
Analizowany obraz
5. W celu dokładnego zaznaczenia analizowanych punktów należy powiększyć
analizowany obszar przez naciśnięcie Enlarge area i zakreślenie tylko obszaru
oświetlanego kanału.
6. Należy wybrać obszary, które będą poddane analizie. W tym celu należy zaznaczyć
2 pola do analizy (1 – czerwone i 2 – zielone). Jedno z nich powinno znajdować się
w obszarze świecenia (sygnał fluorescencji kulki), a drugie poza nim (sygnał tła), ale
w obszarze kanału. Pola do analizy nie powinny przekraczać wymiarów 2×2. W celu
dokładnego narysowania pola do analizy można się posługiwać precyzyjnymi
strzałkami.
________________________________________________________________________
___
www.memslab.pl
3
Analizowane
pola
Rozmiar
analizowanych
pól
Precyzyjne
strzałki
7. W celu dokonania analizy zaznaczonych pól należy wcisnąć przycisk Measure.
Spowoduje to pojawienie się krzywych pomiarowych w lewej części ekranu
(Rys. 5) oraz automatycznie zostaną wygenerowane pliki *.xls oraz bmp do katalogu,
który został wskazany na początku procedury.
Krzywe pomiarowe
8. Powyższe czynności należy wykonać tak, aby uzyskać co najmniej 10 pików
fluorescencyjnych (sygnały od 10 kulek).
4. Opracowanie wyników:
1. Wygenerowany w trakcie analizy plik *.xls zawiera trzy kolumny: 1 – czas, 2 – sygnał
fluorescencji z pola czerwonego, 3 – sygnał fluorescencji z pola zielonego.
2. Dla pojedynczej, wybranej kulki należy odjąć maksymalny sygnał tła od
maksymalnego sygnału fluorescencji w programie Excel lub Origin.
3. Czynności te należy powtórzyć dla każdej z 10 kulek.
4. Końcowym wynikiem analizy danych pomiarowych jest wykres intensywności
fluorescencji w zależności od numeru kulki.
________________________________________________________________________ 4
___
www.memslab.pl
UWAGA !!!
Po przeprowadzeniu serii pomiarów należy kanał mikrocytometru przepłukać wodą
dejonizowaną. W tym celu należy:
a) odłączyć rurkę wlotową pompy od naczynka z kulkami nr 1 i poczekać, aż cała
objętość roztworu z kulkami zostanie przepompowana do zbiorniczka z kulkami nr 2,
b) zamienić oba naczynka z kulkami na naczynka z wodą DI.
Przykładowe pytania:
 Gdzie znajdują zastosowanie urządzenia typu Lab-on-a-Chip?
 Przedstawić schemat budowy mikrocytometru wraz z opisem funkcji poszczególnych
elementów.
 Jakie rodzaje detekcji oraz jakie detektory stosuje się w mikrocytometrach?
 Jakie metody są wykorzystywane do oceny jakości komórek rozrodczych?
Przed wykonaniem ćwiczenia proszę zapoznać się z materiałami pomocniczymi
przygotowanymi do ćwiczenia.
________________________________________________________________________
___
www.memslab.pl
5