Celem wykładu „Metody Biofizyki Molekularnej” przeznaczonego dla

Celem wykładu „Metody Biofizyki Molekularnej” przeznaczonego dla studentów kierunku
„Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie” jest poznanie podstaw metod niespektroskopowych
stosowanych przez współczesną fizykę eksperymentalną do badania struktury biocząsteczek oraz
procesów zachodzących na poziomie molekularnym.
Po wysłuchaniu wykładu studenci powinni umieć odpowiedzieć na następujące pytania:
Z punktu widzenia metody:
Jakie warunki musi spełniać obiekt, aby można było badać go wiarygodnie wybraną
metodą?
Jakie są ograniczenia metody?
Z punktu widzenia obiektu:
Czy dana metoda nadaje się do badania wybranego obiektu i czego możemy się o nim
dowiedzieć stosując wybrana metodę?
W trakcie wykładu poruszane będą następujące zagadnienia:
Oczyszczanie i separacja makrocząsteczek:
chromatografia,
elektroforeza.
Metody hydrodynamiczne:
ultrawirowanie,
wiskozymetria.
Określanie struktur chemicznych i przestrzennych cząsteczek:
spektrometria mas,
krystalizacja i rentgenografia kryształów.
Metody termodynamiczne:
kalorymetria,
osmometria.
Metody relaksacyjne:
zatrzymanego przepływu,
perturbacyjne.
Nanobiologia — obserwacje, spektroskopia i manipulacje pojedynczymi molekułami:
mikroskopia optyczna i elektronowa,
mikroskopia sil atomowych (AFM),
szczypce optyczne i magnetyczne.
Obiektami pomiarów są makrocząsteczki biologiczne nazywane zamiennie makromolekułami,
biocząsteczkami lub biopolimerami. Są to związki o masie do kilku milionów daltonów tworzone z
podjednostek: białka — z aminokwasów, kwasy nukleinowe — z nukleotydów, polisacharydy — z
monosacharydów.
Właściwości makromolekuł jakie wykorzystuje się podczas ich identyfikacji i charakterystyki to:
powinowactwo do innych molekuł,
ładunek elektryczny,
kształt.
masa,
hydrofobowość,
lepkość,
zdolność krystalizowania.
Przy tworzeniu trójwymiarowych struktur makrocząsteczek takich jak białka i kwasy nukleinowe
zasadniczą rolę odgrywają wiązania wodorowe. Są to słabe oddziaływanie elektrostatyczne pomiędzy
elektroujemnym atomem (akceptorem), a atomem wodoru, który jest kowalencyjnie połączony z
innym atomem elektroujemnym (donorem). W wiązaniu wodorowym wodór pełni rolę mostka
łączącego dwa elektroujemne atomy (O,N,P).
Charakterystyczną cechą biocząsteczek jest wąski zakres warunków chemicznych (pH, siła jonowa) i
fizycznych (temperatura, ciśnienie) w których pełnia prawidłowo funkcje biologiczne. W związku z
tym aby nie uszkodzić w sposób nieplanowany biomolekuł należy uważnie zaplanować pomiary
eksperymentalne biorąc pod uwagę wpływ środowiska pomiarowego na stabilność makromolekuł.
Należy odpowiedzieć w jakich warunkach najkorzystniej będzie wykonywać pomiary, a więc co
wybrać:
Jaki bufor?
W jakiej temperaturze pracować?
Jaka siła jonowa?
Jakie stężenie białka?
Czy stosować dodatkowe odczynniki:
środki redukujące (beta-merkaptoetanol, DTT),
odczynniki utleniające,
inhibitory proteaz,
odczynniki denaturujące,
detergenty jonowe i niejonowe,
związki wiążące kwasy nukleinowe?
Planując pomiary, należy umieć oszacować stężenie makromolekuł.
Przypominamy, że:
Masa cząsteczkowa to masa określonej cząsteczki, wyrażona w atomowych jednostkach masy (Da,
u) będąca sumą mas atomowych pierwiastków wchodzących w jej skład. Jednostka masy atomowej
(u) jest równa 1/12 masy atomu węgla 12C
podaje się najczęściej w kilodaltonach, np. GFP
. Masę cząsteczkową białek
.
Masa molowa to masa jednego mola substancji wyrażona w gramach (gram/mol).
1 mol — liczba cząsteczek równa liczbie atomów zawartych w masie 0.12 kg czystego nuklidu 12C.
Wynosi ona
(liczba Avogadra NA) (masa molowa
jest taką liczbą gramów danej
substancji, która jest co do wielkości równa jej (względnej) masie cząsteczkowej
, wyrażonej w
atomowych jednostkach masy)
Masa molowa [g/mol] = średnia masa cząsteczkowa [Da]
Wyznaczanie stężenia białek na podstawie zawartości aminokwasów aromatycznych:
tryptofanu,
tyrozyny,
fenyloalaniny.
Współczynnik ekstynkcji w 280 nm:
Trp —
,
Tyr —
,
Phe —
.
prawo Lamberta-Beera
stężenie białka[mol/l]
Stężenie procentowe białka:
ilość gramów białka w 100 ml roztworu
np. 1% = 1 g/100 ml = 10 mg/ml.
Stężenie molowe:
ilość moli białka w litrze roztworu (ozn. [M] = [mol/l]).
Procentowy współczynnik ekstynkcji odpowiada absorpcji białka o stężeniu 1% w kuwecie o
długości drogi optycznej 1cm. Jednostka
.
Molowy współczynnik ekstynkcji odpowiada absorpcji 1 M białka w kuwecie o długości drogi
optycznej 1 cm. Jednostka
.
Zależność pomiędzy molowym a procentowym współczynnikiem ekstynkcji:
masa molowa białka.
Jeśli nie wiemy nic o białku to przyjmuje się, ze
(dla większości białek
).
Przeliczanie stężenia białka z M (czyli mol/l) na mg/ml i odwrotnie:
X [mol/l] X [mol] * masa molowa [g/mol]/l = X [mol] * masa molowa *1000[mg/mol]/1000 ml =
X * masa molowa [g] = Y [mg/ml]
Y [mg/ml] Y / masa molowa [g] = X [M].
Celem wielu pomiarów biofizycznych jest m.in. wyznaczenie średniej masy biocząsteczek.
Najczęściej spotykamy się z wagowo (masowo) średnią masą cząsteczkowa lub ilościowo (liczbowo)
średnią masą cząsteczkową. Definicje tych wielkości są dyskutowane w dalszej części wykładu
(osmometria).