Właściwości kinetyczne fosfatazy kwaśnej z ziemniaka

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.
Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
Właściwości kinetyczne fosfatazy kwaśnej z ziemniaka
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się metodyką wyznaczania szybkości reakcji Vmax
oraz stałej Michaelisa Menten dla fosfatazy kwaśnej z ziemniaka
WPROWADZENIE
Szybkość przeprowadzanych reakcji enzymatycznych i jej dostosowanie do warunków
środowiskowych lub bodźców hormonalnych ma istotne znaczenie dla każdego organizmu
dążącego do zachowania homeostazy. Badaniem szybkości reakcji enzymatycznych i wpływu
na nią różnych czynników zajmuje się dział enzymologii nazywany kinetyką enzymatyczną.
Szybkość reakcji enzymatycznej mierzy się ubytkiem stężenia substratu lub przyrostem
stężenia produktu reakcji w jednostce czasu.
Na przebieg reakcji enzymatycznej wpływa wiele czynników chemicznych i
fizycznych, takich jak stężenie enzymu, stężenie substratu, temperatura, pH, stężenie
aktywatorów i inhibitorów, mogących przyśpieszać lub hamować reakcje. W warunkach
optymalnych przy nadmiarze substratu i stałym stężeniu enzymu szybkość reakcji powinna
być wielkością stałą a wykres szybkości odpowiadać linii prostej (reakcja zerowego rzędu).
Jednak w rzeczywistości wraz z upływem czasu szybkość reakcji (V) często maleje wskutek
ubytku substratu, hamowania przez produkt oraz stopniowej inaktywacji enzymu i dlatego
wyznaczając szybkość początkową reakcji (Vo) powinno stosować się możliwie krótki czas
inkubacji enzymu z substratem. W celu poznania ogólnego mechanizmu działania enzymu,
szczególnie istotne jest badanie wpływu stężenia substratu na szybkość reakcji
enzymatycznej.
Dla wielu enzymów zależność szybkości reakcji (Vo) od stężenia substratu [S] może
być wyrażona zależnością matematyczną zawartą w równaniu Michaelisa –Menten:
gdzie:
Vo- szybkość początkowa reakcji
V max –szybkość maksymalna reakcji dl enzymu całkowicie wysycanego substratem,
[S]-stężenie substratu
Km –stała Michaelisa
1
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.
Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
W omawianym modelu kinetycznym zakłada się powstawanie odwracalnego kompleksu
enzym –substrat (E-S) oraz nieodwracalnej reakcji rozpadu tego kompleksu na produkt i
enzym:
E+S
k+1
k-1
ES
k2
E+P
gdzie: k+n –stałe szybkości przy tworzeniu nowych związków a k-n –stała szybkości w
kierunku odwrotnym.
Obrazem graficznym tego równania jest hiperbola :
Rys 1. Wykres zależności szybkości reakcji od stężenia substratu wg. Michaelisa-Menten.
Przy niższych stężeniach substratu szybkość reakcji rośnie proporcjonalnie do wzrostu jego
stężenia. W miarę nasycenia enzymu substratem szybkość reakcji enzymatycznej
asymptotycznie zbliża się do wartości granicznej, nazywanej szybkością maksymalną
(Vmax). Reakcja osiąga szybkość maksymalną przy stężeniu substratu wystarczającym na
wysycenie wszystkich miejsc aktywnych enzymu, w takim momencie dalsze zwiększanie
stężenia substratu nie powoduje zmian szybkości katalizy. Stężenie substratu [S] przy którym
szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej (Vmax) nosi nazwę stałej Michaelisa
(Km). Wartość Km, wyrażana w jednostkach stężenia substratu, jest cechą charakterystyczną
każdego enzymu określającą powinowactwo enzymu do danego substratu. Wartości stałych
Km zwykle zawierają się w granicach 10
-1
do 10
-7
M i są zależne od rodzaju substratu, nie
są natomiast zależne od stężenia enzymu. Ten sam enzym ma więc różne wartości Km dla
2
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.
Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
różnych. swoich substratów. Wysoka wartość tej stałej wskazuje na słabe powinowactwo a
niska na wysokie powinowactwo enzymu do substratu. Stałą Michaelisa wyznacza się
stosując w reakcji kilka różnych stężeń substratu. Nie jest możliwe jednak dokładne
wyznaczenie tej wartości z wykresu będącego graficznym przedstawieniem równania
Michaelisa –Menten, dlatego najczęściej do wyznaczania parametrów kinetycznych stosuje
się wykres Lineweavera i Burka odpowiadający odwrotności tego równania. Zgodnie z
równaniem Lineweavera i Burka, przez odłożenie na osi rzędnych 1/Vo a na osi odciętych 1/S
otrzymuje się prostą przecinającą się z osią rzędnych w punkcie odpowiadającym 1/Vmax a z
osią odciętych -1/Km, z nachylenia prostej można odczytać wartość km/V.
Rys 2. Wykres Lineweara-Burka
Wykres Lineweavera i Burka jest także użyteczny przy wyznaczaniu typu inhibicji
danej reakcji enzymatycznej. W przypadku inhibicji kompetycyjnej zmianie ulega punkt
przecięcia prostej z osią odciętych a więc wartość -1/Km, niezmienny pozostaje punkt
przecięcia z osią rzędnych a więc 1/Vmax (rys 3)
Rys. 3. Wykres Lineweara-Burka dla inhibicji kompetycyjnej
3
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.
Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
W przypadku inhibicji niekompetycyjnej bez zmian pozostaje punkt przecięcia prostej
z odciętych –punkt -1/Km, zmianie ulega punkt przecięcia z osią rzędnych (rys 4)
Rys. 4 Wykres Lineweara-Burka dla inhibicji niekompetycyjnej
Obok przedstawionych powyżej zależności do wyznaczania typu inhibicji w
reakcjach enzymatycznych stosuje się także wykresy , np. Hanesa –Woolfa lub Woolfa –
Auguistinsson –Hofstee.
Bardziej szczegółowe informacje na temat kinetyki reakcji oraz inhibitorów enzymów
zostaną podane na wykładzie
4
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.
Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
Fosfatazy należą do klasy hydrolaz, podklasy esteraz i katalizują rekcję odszczepienia
reszty fosforanowej od cukrowców, białek, tłuszczowców, nukleotydów i innych naturalnych
estrów fosforanowych, zgodnie z ogólnym schematem:
Wyróżnia się fosfatazy alkaliczne, z optimum pH w zakresie 9,0-11,0 oraz fosfatazy
kwaśne z optimum pomiędzy 3,8 a pH 7,0. Fosfatazy występują powszechnie u wielu
organizmów, ich obecność stwierdzono m.in. u bakterii, roślin i zwierząt. Fosfatazy kwaśne
zwierzęce występują głównie w lizosomach, gdzie są uważane za enzymy znacznikowe
(markerowe) tych struktur komórkowych. Aktywność tego enzymu występującego u
człowieka w znacznej ilości w gruczole sterczowym, gwałtownie wzrasta w pierwszych
etapach rozwoju raka tego narządu, co jest obecnie wykorzystywane w diagnostyce
medycznej. Większość poznanych dotychczas roślinnych fosfataz kwaśnych to glikoproteiny
o zróżnicowanej masie cząsteczkowej wahającej się od 20 do 200 kDa. Niskocząsteczkowe
formy tych enzymów (20 -70 kDa)
występują jako monomery, wysokocząsteczkowe
(powyżej 70 kDa) jako dimery lub tetrametry. Obecność fosfataz stwierdzono w różnych
organach roślin m.in. w nasionach i bulwach, gdzie ich aktywność zwiększa się podczas
kiełkowania i maleje w miarę wzrostu kiełków, co może być związane z rolą tego enzymu w
uwalnianiu fosforanów z organicznych substancji zapasowych –estrów inozytoli.
Fosfataza kwaśna występująca w dużym stężeniu w bulwach ziemniaka będzie obiektem
badań podczas zajęć laboratoryjnych.
Zasada metody oznaczania aktywności fosfatazy kwaśnej:
Aktywność tego enzymu będzie oznaczana z wykorzystaniem syntetycznego substratu –
p-nitrofenylofosforanu, produktami tej reakcji hydrolizy będą p-nitrofenol i kwas fosforowy,
zgodnie z poniższą reakcją:
5
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.
Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
Produkt reakcji, p-nitrofenol przyjmuje w środowisku zasadowym barwę żółtą, co jest przy
wykorzystane do oznaczania absorbancji w próbach przy długości fali 420 nm.
WYKONANIE
Studenci wykonują ćwiczenie parami
1. Przygotowanie wyciągu enzymu:
Odważyć 5 –gramową porcję obranej bulwy z ziemniaka oraz 2 g piasku, rozdrobnić i
ucierać w moździerzu stopniowo dodając 20 ml 0,1 M buforu octanowego o pH 5,0.
Homogenat przenieść ilościowo ma sączek z gazy i przesączyć do kolby miarowej o
pojemności 100 ml, uzupełnić do kreski buforem octanowym, przelewając porcjami przez
gazę, dokładnie wymieszać. Dalsze rozcieńczenie przygotować przez przeniesienie np. 10 ml
rozcieńczonego roztworu z kolby (100 ml) do kolby miarowej na 25 ml i dopełnić do kreski
buforem octanowym, dokładnie wymieszać. Tak rozcieńczony ekstrakt enzymatyczny
wykorzystywać do oznaczeń aktywności fosfatazy kwaśnej.
2. Oznaczanie aktywności fosfatazy kwaśnej: Do trzech próbówek -2 próby pełne i 1 próba
materiałowa - odmierzyć po 1 ml p-nitrofenylofosforanu, 1 ml wody oraz 1 ml buforu
octanowego . wszystkie próby preinkubować 5 min w temp. 30 C, po 5 min (nie wyjmując
prób z łaźni) dodać do dwóch po 0,5 ml ekstraktu enzymatycznego (próby pełne) i dokładnie
wymieszać. Wszystkie próby inkubować 15 min. w 30 C. Reakcję enzymatyczną przerwać
dodając do prób pełnych i materiałowej po 2,5 ml 0,1 M NaOH, dokładnie wymieszać i dodać
do próby materiałowej 0,5 ml ekstraktu enzymu. Wyzerować fotometr wobec próby
materiałowej przy długości fali 420 mn, zmierzyć absorbancję prób pełnych.
Uwaga: Uśredniona wartość absorbancji prób pełnych powinna zawierać się 0,40 -0,45
Jeśli uzyskana absorbancja nie mieści się w tym przedziale, należy – po konsultacji z
nauczycielem prowadzącym zajęcia - zmienić stopień rozcieńczenia ekstraktu roślinnego.
6
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.
Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
3. Wyznaczanie stałej KM i Vmax fosfatazy z ziemniaka
Oznaczenie enzymatyczne będzie wykonywane przy 6 różnych stężeniach substratu w dwóch
powtórzeniach, próbę materiałową w jednym powtórzeniu, zgodnie z poniższą tabelą:
bufor
substrat
H2O
Numer
octanowy (ml)
(ml)
próby
1
2
3
4
5
6
M
(ml)
1
1
1
1
1
1
1
1,9
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
1,0
0,1
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,0
Wszystkie probówki wstawić do łaźni wodnej o temp. 30º C i preinkubować 5 min., po tym
czasie dodać do wszystkich-z wyjątkiem próby materiałowej- po 0,5 ml odpowiednio
rozcieńczonego wyciągu enzymu z bulwy ziemniaka, wymieszać i inkubować 15 min w 30ºC.
Reakcję enzymatyczną przerwać przez dodanie 2,5 ml NaOH, wymieszać , do próby
materiałowej dodać 0,5 ml wyciągu enzymu. Zmierzyć absorbancję prób pełnych w
fotometrze wyzerowanym na próbę materiałową przy długości fali 420 nm.
OPRACOWANIE WYNIKÓW
Wyznaczanie Km i Vmax
W celu obliczenia ilości mikrogramów uwolnionego w reakcji p-nitrofenolu należy
średnią wartość absorbancji równoległych prób podzielić przez molowy współczynnik
absorbancji 0,002 dla 1 μg p-nitrofenolu. Następnie obliczyć szybkość reakcji enzymatycznej
(V) przy poszczególnych stężeniach substratu, przedstawić ją w μmol p-nitrofenolu (masa
molowa p-nitrofenolu wynosi 139). Należy także obliczyć stężenie substratu [S](mol/litr) w
poszczególnych próbach, uwzględniając jego rozcieńczenie w mieszaninie reakcyjnej.
W celu sporządzenia wykresu Lineweara i Burka należy odłożyć na osi rzędnych 1/Vo oraz
na odciętych 1/[S]. Prostą łączącą naniesione punkty należy przedłużyć, tak aby przecięła się
z osią odciętych, z punktu przecięcia odczytać wartość -1/Km, obliczyć Km. Z punktu
przecięcia prostej z osia rzędnych odczytać wartość 1/Vmax, obliczyć Vmax.
7
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.
Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
Obliczenie aktywności fosfatazy kwaśnej z ziemniaka
Uwzględniając rozcieńczenie obliczyć aktywność enzymu w μmol p-nitrofenolu utworzonego
w czasie 1 min przez enzym z 1 g bulwy ziemniaka.
8