ChromatograFiczny rozdział i identyFikacja taurynowych połączeĘ
Transkrypt
ChromatograFiczny rozdział i identyFikacja taurynowych połączeĘ
&ARM0RZEGL.AUK COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. #HROMATOGRAFICZNYROZDZIAIIDENTYFIKACJA TAURYNOWYCHPOCZEÊWYBRANYCHKWASÌWÌCIOWYCH WICHMIESZANINIE #HROMATOGRAPHICSEPARATIONANDIDENTIFICATION OFTAURINECONJUGATESOFSELECTEDBILEACIDSINTHEIRMIXTURE -AGORZATA$OOWY :AKAD#HEMII!NALITYCZNEJ+ATEDRA#HEMII/GÌLNEJI!NALITYCZNEJ 7YDZIA&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ gLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNY 3OSNOWIEC +IEROWNIK+ATEDRYPROFDRHABNCHEM!LINA0YKA Streszczenie Celem pracy było zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej w normalnym i odwróconym układzie faz (NP-TLC i RP-TLC) do rozdziału i identyfikacji taurynowych połączeń wybranych kwasów żółciowych, takich jak: kwas taurocholowy (TCA), taurodeoksycholowy (TDCA), taurochenodeoksycholowy (TCDCA) i taurolitocholowy (TLCA) w ich mieszaninie. Do oceny rozdziału trzech par badanych kwasów żółciowych tj. TCA/TDCA, TDCA/ TCDCA i TCDCA/TLCA użyto współczynniki rozdziału ∆RF i RS. Wykazano, że NP-TLC i RP-TLC są przydatne do rozdziału tylko dwóch par kwasów żółciowych z ich mieszaniny: TCA/TDCA i TCDC/TLCA. Problem stanowi separacja kwasu TDCA od TCDCA. Para ta nie rozdzieliła się w żadnych z zastosowanych warunków chromatograficznych. Stwierdzono, że trudności w separacji pary kwasów TDCA/TCDCA wynikają z podobieństwa ich retencji chromatograficznej. Abstract The aim of this paper was to apply a thin-layer chromatography in normal and reversed phase system (NP-TLC and RP-TLC) to separate and identify a mixture of selected taurine- conjugates bile acids such as: taurocholic acid (TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA) and taurolithocholic acid (TLCA). The estimation of resolution of three investigated pairs of bile acids was carried out on the basis of the separation factors values ∆RF and RS. It was showed that, the NPTLC and RP-TLC methods are useful for separation of two of three examined bile acids of their mixture: TCA/TDCA and TCDCA/TLCA. The biggest problem in bile acids separation is resolution of TDCA from TCDCA. This pair didn’t separate under all applied chromatographic conditions. It was stated that the problems in TDCA/TCDCA separation arise from similarities of their chromatographic retention. słowa kluczowe: kwasy żółciowe, rozdział kwasów żółciowych, analiza kwasów żółciowych, TLC key words: bile acids, separation of bile acids, analysis of bile acids, TLC ' Ö Kwasy żółciowe to pochodne steroidowe, czyli zawierające w swojej strukturze charakterystyczny dla steroidów układ 1,2-cyklopentanoperhydrofenantrenu składający się z czterech nasyconych, skondensowanych pierścieni, w tym trzech pierścieni sześciowęglowych i jednego pięciowęglowego. W żółci człowieka kwasy te występują w postaci wolnej oraz sprzężonej, tj. są połączone wiązaniem amidowym poprzez grupę karboksylową z glicyną (H2N-CH2-COOH) lub z tauryną (H2N-CH2-CH2-SO3H) – rys. 1. Kwasy żółciowe różnią się ilością grup OH i C=O. W zależności od ilości grup hydroksylowych (OH) obecnych w cząsteczce kwasu żółciowego, związki te dzieli się na [1-3]: u pochodne monohydroksylowe np. kwas litocholowy u pochodne dihydroksylowe np. chenodeoksycholowy, ursodeoksycholowy i deoksycholowy u pochodne trihydroksylowe np. kwas cholowy. Pod wpływem enzymów bakterii jelitowych, których wzrost jest objawem pętli zastoinowej, glicyna lub tauryna, mogą ulegać odszczepieniu od cząsteczek kwasów żółciowych do wolnych kwasów lub może dojść do dehydroksylacji czyli zamianie trihydroksylowych kwasów żółciowych do monohydroksylowych. U osób z kamicą żółciową oraz w przypadku marskości wątroby (tj. uszkodzenia miąższu wątroby) całkowita pula kwasów żółciowych w surowicy krwi zwiększa się w porównaniu do zdrowych osobników [3]. *Badania finansowane przez Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach z umowy KNW-2-023/09 &ARM0RZEGL.AUK kwasów żółciowych w ich mieszaninie, tj. kwasu taurocholowego (TCA), kwasu taurodeoksycholowego (TDCA), kwasu taurochenodeoksycholowego (TCDCA) oraz kwasu taurolitocholowego (TLCA). - Rl-t¬ Rys. 1. Struktura chemiczna kwasów żółciowych [2] Dlatego bardzo ważna i istotna dla celów diagnostyki schorzeń wątroby i dróg żółciowych byłaby możliwość rozdziału mieszaniny kwasów żółciowych na poszczególne frakcje tzn. wolne kwasy, kwasy połączone z glicyną i tauryną oraz ich identyfikacja i ilościowe oznaczenia w surowicy czy żółci. Wśród metod stosowanych do rozdziału i oznaczania kwasów żółciowych w materiale biologicznym (surowica krwi, mocz i kał) stosuje się następujące metody analityczne [4,5]: u chromatografia cienkowarstwowa (TLC) u chromatografia gazowa (GC) u wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) u elektroforeza kapilarna (CE) u metody enzymatyczne i immunoenzymatyczne. Budowa kwasów żółciowych wskazująca na obecność słabych ugrupowań chromoforowych absorbujących promieniowanie przy długości fali około 200 nm sprawia, że spektrofotometryczne oznaczanie kwasów żółciowych bez wcześniejszej ich derywatyzacji do bardziej czułych na działanie światła pochodnych jest niemożliwe [5]. W standardowej diagnostyce laboratoryjnej do oznaczania całkowitej puli kwasów żółciowych w surowicy krwi stosuje się metodę enzymatyczną. W metodzie tej wykorzystuje się katalityczne utlenianie kwasów żółciowych przy użyciu swoistego dla nich enzymu – dehydrogenazy 3α-hydroksysteroidowej. Barwny produkt tej reakcji oznacza się spektrofotometrycznie, a jego stężenie jest proporcjonalne do poziomu kwasów żółciowych w surowicy krwi ludzkiej. Metoda ta jest prosta w wykonaniu i obarczona małymi błędami analitycznymi, co sprawia, że znalazła szerokie zastosowanie w analizie chorób wątroby i dróg żółciowych [4,5]. Powyższa praca jest kontynuacją chromatograficznych badań kwasów żółciowych w modelowej mieszaninie odpowiadającej składowi żółci ludzkiej. Poprzednie prace pozwoliły na opracowanie optymalnych warunków chromatograficznych (techniką TLC) do rozdziału i identyfikacji wolnych i związanych z glicyną kwasów żółciowych [6-12]. Ponadto chromatograficzno – densytometryczna metoda okazała się również przydatna do ilościowego oznaczania wolnych kwasów żółciowych po wstępnym ich rozdziale z mieszaniny [9]. W prezentowanej pracy podjęto próbę chromatograficznego rozdziału i identyfikacji taurynowych połączeń Do badań użyto metanolowe roztwory następujących kwasów żółciowych: TCA, TDCA TCDCA i TLCA (Sigma- Aldrich, USA) o stężeniu 5μg/μl oraz ich mieszaninę zawierającą 5 μg każdego kwasu w 1 μl. Składniki faz ruchomych to: n -heksan (POCh, Gliwice), octan etylu (POCh, Gliwice), kwas octowy (99,5%, POCh, Gliwice), metanol (POCh, Gliwice), chloroform (POCh, Gliwice), izooktan (POCh, Gliwice), n- butanol (POCh, Gliwice) oraz woda destylowana (Zakład Chemii Analitycznej, Wydział Farmaceutyczny ŚUM, Sosnowiec). W celu wizualizacji plamek badanych kwasów zastosowano około 95% H2SO4 (POCh, Gliwice). Wodny roztwór CuSO4 × 5H2O (POCh, Gliwice) użyto do impregnacji płytek chromatograficznych stosowanych w badaniach. W pracy użyto płytki chromatograficzne do chromatografii w normalnym układzie faz (NP –TLC) produkcji E. Merck o numerach: Art. 1.05715, Art. 1.05554 i Art. 1.05553 oraz płytki do chromatografii w odwróconym układzie faz (RP – TLC) o numerze Art. 1.05559. R |J¬p-7-J-Í Rozdział mieszaniny kwasów żółciowych techniką NP –TLC ( rozwijanie jednokierunkowe) Zastosowano płytki aluminiowe pokryte żelem krzemionkowym 60F254 i 60 (E. Merck, Art. 1.05554 i Art. 1.05553) oraz szklane Art. 1.05715 o wymiarach 10cm×10cm. Na zaktywowane w temp. 120oC płytki nanoszono 10 μl mieszaniny badanych kwasów i 3μl roztworu standardowego kwasu TCA, TDCA, TCDCA i TLCA. Płytki rozwijano na wysokość 9 cm w klasycznej komorze chromatograficznej 20cm×20cm (Camag, Szwajcaria) przy użyciu 50 ml fazy ruchomej: u n- heksan –octan etylu –kwas octowy w następujących stosunkach objętościowych: 25:20:8 i 22:22:5 (v/v/v) u chloroform –metanol-kwas octowy w stosunkach objętościowych: 25:12:3, 35:10:5, 25:20:5, 45:0:5, 40:5:5 i 37,5:13,5:1,55 (v/v/v). Impregnacji płytek chromatograficznych dokonywano poprzez ich zanurzenie na 30 sekund w wodnym roztworze CuSO4 o stężeniu 5% i następnie wysuszenie w temp. 18±1oC przez 24 h. W celu uwidocznienia plamek analizowanych kwasów płytki spryskiwano 10% roztworem H2SO4 i ogrzewano je przez 20 minut w temp. 120oC. Rozdział mieszaniny kwasów żółciowych techniką 2D –TLC ( rozwijanie dwukierunkowe) W przypadku rozwijania dwukierunkowego użyto płytki chromatograficzne Art. 1.05715 wymiarach 10cm×10cm oraz mieszaninę izooktan –octan etylu- kwas octowy COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. w stosunku objętościowym 5:4:1 (v/v/v) jako fazę ruchomą w I- szym kierunku rozwijania. Natomiast mieszaninę: chloroform- woda-kwas octowy- n- butanol w stosunku objętościowym 2:1:1:16 (v/v/v/v) zastosowano w II kierunku rozwijania prostopadłym do pierwszego. Na płytki nanoszono tylko 10 μl mieszaniny kwasów w obu etapach rozwijania dwukierunkowego. Każdorazowo użyto 50 ml fazy ruchomej. Chromatogramy rozwijano na wysokość 9 cm. Po wysuszeniu, w celu wizualizacji plamek badanych związków, chromatogramy spryskiwano 10% wodnym roztworem H2SO4 i ogrzewano przez 20 minut w temp. 120oC. Rozdział mieszaniny kwasów żółciowych techniką RP –TLC (rozwijanie jednokierunkowe) W badaniach zastosowano płytki aluminiowe RP-18F254 (Art. 1.05559) o wymiarach 10cm×10cm. Mieszaninę metanol-kwas octowy- woda w ilości 50 ml użyto jako fazę ruchomą w następujących stosunkach objętościowych: 15:20:15, 30:5:15, 30:15:5, 10:30:10, 35:5:0, 25:5:20, 25:20:8, 22:22:5 i 25:20:5 (v/v/v). Chromatogramy rozwijano w komorze firmy Camag na wysokość 9 cm. Na płytki nanoszono 10 μl mieszaniny i 3 μl roztworów badanych kwasów. Wizualizacji plamek badanych kwasów dokonywano za pomocą 10% H2SO4. Ocena rozdziału taurynowych połączeń badanych kwasów żółciowych Efekt rozdziału badanej mieszaniny oceniano za pomocą wartości współczynników rozdziału tj. ∆RF i RS [6] obliczonych na podstawie otrzymanych chromatogramów wg wzorów: ∆RF=RF2 – RF1 (1) gdzie: RF1 i RF2 są wartości RF dwóch sąsiadujących ze sobą plamek na chromatogramie, a RF2> RF1. a Rs = 2x – b (2) a- odległość pomiędzy środkami dwóch sąsiadujących plamek [cm] b- suma szerokości obu plamek w kierunku rozwijania [cm] '¬ylpll|u}ªlRylRª¬ylp}ª Prezentowana praca miała na celu opracowanie optymalnych warunków chromatograficznych pozwalających na całkowity rozdział i identyfikację taurynowych połączeń wybranych kwasów żółciowych, tj. kwasu TCA, TDCA, TCDCA i TLCA. Badania przeprowadzono techniką chromatografii cienkowarstwowej w normalnym układzie faz (NP-TLC) przy użyciu mieszaniny n- heksan– octan etylu– kwas octowy w następujących stosunkach objętościowych: 25:20:8 i 22:22:5 oraz chloroform –metanol- kwas octowy w stosunku objętościowym: 25:12:3, 35:10:5, 25:20:5, 45:0:5, 40:5:5, 37,5:13,5:1,55 (v/v/v) jako fazy ruchomej. Mieszaninę kwasów TCA+ TDCA+ TCDCA+ TLCA roz- dzielano na płytkach chromatograficznych pokrytych żelem krzemionkowym 60F254 i 60 produkcji E. Merck (Art. 1.05554, Art. 1.05715 i Art. 1.05553). Rozdział mieszaniny badanych kwasów oceniano na podstawie wartości współczynników rozdziału: ∆RF i RS wyznaczonych dla trzech par badanych kwasów żółciowych tj. TCA/TDCA, TDCA/ TCDCA i TCDCA/TLCA w zastosowanych warunkach chromatograficznych. Za kryterium całkowitego rozdziału każdej z par badanych kwasów żółciowych przyjęto wartości ∆RF≥0.05 i RS>1 [6,7]. Z przeprowadzonych badań rozdziału mieszaniny kwasów techniką NP -TLC z użyciem fazy ruchomej chloroform –metanol- kwas octowy w różnym stosunku objętościowym wynika, że żadne z zastosowanych warunków chromatograficznych nie pozwalają na całkowity rozdział wszystkich trzech par badanych kwasów. Użyte płytki chromatograficzne (Art. 1.05554, Art. 1.05715 i Art. 1.05553) i mieszanina chloroform –metanol- kwas octowy w stosunkach objętościowych: 25:12:3, 35:10:5, 25:20:5 i 37,5:13,5:1,55 (v/v/v) pozwoliły na rozdział tylko dwóch spośród trzech par badanych kwasów żółciowych tj. TCA/TDCA i TCDCA/TLCA, dla których otrzymano ∆RF≥0.05 i RS>1. Modyfikacja zastosowanych płytek chromatograficznych za pomocą 5% wodnego roztworu CuSO4×5H2O nieznacznie tylko polepszyła rozdział pary kwasów TDCA i TCDCA. Natomiast stosowane płytki i mieszanina chloroform –metanol- kwas octowy w stosunku objętościowym 45:5:5 (v/v/v) pozwalają na rozdział tylko jednej pary badanych kwasów TCDCA/TLCA. Zupełnie nie przydatna do rozdziału badanej mieszaniny kwasów okazała się również faza ruchoma: chloroform –metanol-kwas octowy 40:0:5 (v/v/v) oraz n- heksan –octan etylu –kwas octowy w obu zastosowanych stosunkach objętościowych tj. 25:20:8 i 22:22:5 (v/v/v). Dla tych warunków chromatograficznych brak jest rozdziału żadnej z par kwasów (∆RF dla wszystkich par kwasów wynosi 0). Przykładowy chromatogram otrzymany techniką NP-TLC przedstawiono na rys. 2. Sugerując się wynikami wcześniejszych badań nad wolnymi i sprzężonymi z glicyną kwasami żółciowymi, w kolejnym etapie przeprowadzono rozwijanie dwukierunkowe omawianej mieszaniny taurynowych połączeń kwasów żółciowych, czyli techniką 2D- TLC. W tym celu zastosowano płytki chromatograficzne Art. 1.05715 i mieszaninę izooktan –octan etylu-kwas octowy w stosunku objętościowym 5:4:1 (v/v/v) jako fazę ruchomą w pierwszym kierunku rozwijania. Natomiast w drugim kierunku rozwijania (prostopadłym do pierwszego) użyto fazę ruchomą chloroform –woda-kwas octowy- n- butanol w stosunku objętościowym TLCA TDCA + TCDCA TCA Rys. 2. Rozdział mieszaniny taurynowych połączeń kwasów żółciowych (M) na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym 60F254 (E. Merck, Art. 1.05715) rozwijanych przy użyciu fazy ruchomej: chloroform -metanol –kwas octowy w stosunku objętościowym: 35:10:5 (v/v/v). &ARM0RZEGL.AUK 2:1:1:16 (v/v/v/v). Niestety, tak jak w przypadku rozwijania jednokierunkowego, rozdziałowi uległy dwie pary kwasów TCA i TDCA oraz TCDCA i TLCA. Brak natomiast jest rozdziału kwasu TDCA od TCDCA. Oprócz techniki chromatograficznej w normalnym układzie faz, do rozdziału mieszaniny kwasów zastosowano płytki chromatograficzne RP-18F254 (E. Merck, Art. 1.05559) czyli z odwróconym układem faz. Mieszaninę: metanolkwas octowy- woda w następujących stosunkach objętościowych: 15:20:15, 30:5:15, 30:15:5, 10:30:10, 35:5:0, 25:5:20, 25:20:8, 22:22:5 i 25:20:5 (v/v/v) użyto jako fazy ruchome. Ocenę rozdziału trzech par badanych kwasów żółciowych dokonywano na podstawie wartości współczynników rozdziału: ∆RF i RS. Za najbardziej optymalne fazy ruchome tj. pozwalające na rozdział tylko dwóch par badanych kwasów żółciowych TCA/TDCA i TCDCA/TLCA uznano mieszaninę: metanol-kwas octowy-woda w stosunkach ob- jętościowych: 15:20:15, 30:5:15, 30:15:5, 10:30:10, 25:5:20 i 25:20:8. Natomiast żadna z zastosowanych faz ruchomych nie pozwoliła na całkowity rozdział wszystkich trzech par badanych kwasów techniką RP- TLC. Problem, podobnie jak w przypadku rozdziału w normalnym układzie faz, stanowiła separacja kwasu TDCA od TCDCA. Dla tej pary kwasów bez względu na zastosowane warunki chromatograficzne uzyskiwano parametry chromatograficznego rozdziału poza kryterium rozdziału tj. ∆RF<0.05 i RS<1. W celu uzasadnienia przyczyny trudności w uzyskaniu całkowitego rozdziału kwasu taurodeoksycholowego (TDCA) od taurochenodeoksycholowego (TCDCA) techniką NP-TLC i RP-TLC otrzymane obiema technikami chromatograficznymi współczynniki retencji chromatograficznej (RF) omawianych kwasów, czyli TDCA i TCDCA porównano za pomocą analizy skupień (rys. 3 i 4). Zaprezentowane na poniższych rysunkach dendrogramy dowodzą, że przyczyną trudności w separacji kwasu TDCA i TCDCA jest niewątpliwie duże podobieństwo w wartościach RF obu kwasów otrzymane metodą chromatografii cienkowarstwowej NP-TLC i RP-TLC (na prezentowanych w pracy dendrogramach te dwa kwasy tworzą wyraźne skupienie). Wnioski Rys. 3. Dendrogram podobieństwa rozdziału taurynowych połączeń kwasów żółciowych techniką NP- TLC na płytkach szklanych pokrytych żelem krzemionkowym 60F254 (E. Merck, Art. 1.05715) przy użyciu fazy ruchomej: chloroform -metanol –kwas octowy w stosunkach objętościowych: 25:12:3, 35:10:5, 25:20:5, 45:0:5, 40:5:5, 37,5:13,5:1,55 (v/v/v). Przeprowadzone badania pozwoliły sformułować następujące wnioski: u chromatografia cienkowarstwowa w normalnym i odwróconym układzie faz (NP-TLC i RP-TLC) może być przydatna do rozdziału wybranych taurynowych połączeń kwasów żółciowych z ich mieszaniny, u największe trudności w rozdziale mieszaniny kwasów żółciowych związanych z tauryną techniką chromatografii cienkowarstwowej obserwuje się w przypadku separacji kwasu taurodeoksycholowego od taurochenodeoksycholowego, u zarówno modyfikacja powierzchni płytek chromatograficznych za pomocą CuSO4, jak i rozwijanie dwukierunkowe nie poprawiają znacząco efektu rozdziału kwasu taurodeoksycholowego od taurochenodeoksycholowego (TDCA od TCDCA), u techniki chemometryczne, do których należy analiza skupień są pomocne w ocenie separacji mieszaniny taurynowych połączeń kwasów żółciowych, u chromatografia cienkowarstwowa (TLC) może znaleźć praktyczne zastosowanie w analityce wybranych kwasów żółciowych obecnych w żółci ludzkiej. Piśmiennictwo Rys. 4. Dendrogram podobieństwa rozdziału taurynowych połączeń kwasów żółciowych techniką RP- TLC na płytkach aluminiowych RP-18F254 (E. Merck, Art. 1.05559) przy użyciu mieszaniny: metanol-kwas octowy- woda w stosunkach objętościowych: 15:20:15, 30:5:15, 30:15:5, 10:30:10, 35:5:0, 25:5:20, 25:20:8, 22:22:5 i 25:20:5 (v/v/v) jako fazy ruchomej. 1. Gumińska M. Zarys biochemii ogólnej dla studentów farmacji i analityki medycznej. Wydaw. Uniwersytetu Jagiellońskiego Kraków 1998. 2. Radziwon A.I., Zarzycki P. K. Budowa, biosynteza oraz zastosowanie kwasów żółciowych jako leków. Farm. Pol. 2004; T. 60(18): 869-873. 3. Orłowski W. Nauka o chorobach wewnętrznych. T. VI. Wydaw. PZWL Warszawa 1988. 4. Lorenc J. Kliniczne aspekty metabolizmu kwasów żółciowych. Diagn. Lab. 1996; 32: 285-295. COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. 5. Scalia S. Bile acids separation. J. Chromatogr. B. 1985; 671: 299-317. 6. Pyka A., Dołowy M. Separation of selected bile acids by TLC. III. Separation on various stationary phases. J. Liq. Chromatogr. & Rel. Technol. 2004; 27(16): 2613-2623. 7. Pyka A., Dołowy M. Separation of selected bile acids by TLC. VII. Separation by reversed partition HPTLC. J. Liq. Chromatogr. & Rel. Technol. 2005; 28(10): 1573-1581. 8. Pyka A., Dołowy M. Separation of selected bile acids by TLC. II. One dimensional and two-dimensional TLC. J. Liq. Chromatogr. & Rel. Technol. 2004; 27(13): 2031-2038. 9. Dołowy M., Bat. B., Niestrój A. Application of NP-TLC with densitometric detection for separation and quantitative analysis of unconjugated bile acids presented in human bile. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2009; 32 (1): 144-153. 10. Dołowy M. Badanie tożsamości kwasu ursodeoksycholowego w wybranych preparatach farmaceutycznych techniką NP- TLC. Farm. Pol. 2008; T.64 (17): 753758. 11. Dołowy M. Rozdział mieszaniny wybranych kwasów żółciowych techniką TLC na płytkach aluminiowych pokrytych mieszaniną żelu krzemionkowego 60 i ziemi okrzemkowej F254 impregnowanych kationami Cu[II], Ni [II], Fe[II] oraz Mn[II]. Farm. Przegląd. Nauk. 2008; 2: 34-37. 12. Dołowy M. Chromatograficzna analiza jakościowa taurynowych połączeń wybranych kwasów żółciowych. Aktualne problemy chemii analitycznej. 3 Seminarium Naukowe. Wydaw. Górnośląskie Towarzystwo Przyjaciół Nauk im. W. Roździeńskiego. Katowice 2009: 19. Adres do korespondencji: Małgorzata Dołowy Zakład Chemii Analitycznej, Katedra Chemii Ogólnej i Analitycznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny, ul. Jagiellońska 4, 41-200 Sosnowiec, e-mail: [email protected]