(Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. IS527

FLEX
Polyclonal Rabbit
Anti-Human
von Willebrand Factor
Ready-to-Use
(Dako Autostainer/Autostainer Plus)
Nr kat. IS527
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciało FLEX Polyclonal Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor, Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer
Plus), jest przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Dako Autostainer/Autostainer Plus.
Przeciwciała te są przydatne w identyfikacji ostrych białaczek szpikowych FAB typu M7 (1, 2) i mięsaków
naczyniowych (3, 4). Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania
morfologiczne, z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych, i powinna być przeprowadzana przez
doświadczonego patologa, z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Synonimy antygenu
Antygen związany z czynnikiem VIII (5).
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Czynnik von Willebranda to duŜa glikoproteina o strukturze multimeru i masie cząsteczkowej w przedziale od
500 kDa do ponad 10 000 kDa. Ta najcięŜsza odmiana jest największym znanym rozpuszczalnym białkiem
ludzkiego osocza (6). Główny produkt genu czynnika von Willebranda, zlokalizowanego na chromosomie 12p13.2, to
białko zawierające 2813 aminokwasów, składające się z peptydu sygnałowego złoŜonego z 22 aminokwasów,
duŜego polipeptydu z 741 aminokwasów i dojrzałej cząsteczki VWF zawierającej 2050 aminokwasów (7). Ekspresja
genu czynnika von Willebranda zaleŜy od tkanki i ogranicza się do tkanek śródbłonka oraz megakariocytów (6, 7).
Czynnik VWF jest obecny w osoczu, w ciałach Weibla-Pallade’a komórek śródbłonka, w ziarnistościach alfa
megakariocytów oraz w pochodzących z nich płytkach krwi, a takŜe w podśródbłonkowej substancji
międzykomórkowej ścian naczyń. Czynnik von Willebranda pełni rolę nośnika czynnika VIII w osoczu, chroniąc
krąŜący koenzym koagulacyjny przed rozkładem proteolitycznym (6).
Choroba von Willebranda jest najczęściej występującym zaburzeniem krzepliwości, dotykającym 1% populacji, i jest
spowodowana przez jakościowy lub ilościowy niedobór czynnika VWF (7). WyróŜnia się trzy główne typy choroby:
typ 1 to częściowy niedobór ilościowy, typ 2 reprezentuje defekt jakościowy i podzielony jest na dalsze cztery
kategorie, typ 3 to całkowity brak czynnika VWF (8).
Patrz dokument “Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych” firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem,
3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie
problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Odczynnik
dostarczony
Gotowe do uŜycia poliklonalne przeciwciało królicze dostarczane w postaci płynnej w buforze zawierającym białko
stabilizujące i azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/L.
Immunogen
Czynnik von Willebranda wyizolowany z osocza ludzkiego.
Swoistość
Przeciwciała reagują z kompleksem ludzkim czynnika von Willebranda/czynnikiem VIII. Ślady zanieczyszczeń
przeciwciałami usunięto przez absorpcję w fazie stałej z innymi białkami ludzkiego osocza. Poliklonalne przeciwciała
królicze skierowane przeciwko ludzkim antygenom von Willebrand Factor reagują z czynnikiem von Willebranda w
komórkach śródbłonka, megakariocytach i płytkach krwi w badaniach prawidłowych ludzkich tkanek – szpiku
kostnego, nerek, wątroby, płuc, węzłów chłonnych, skóry i śledziony – preparatów utrwalanych w formalinie i
zatapianych w parafinie (9).
W immunoelektroforezie krzyŜowej przy zastosowaniu 12,5 µL przeciwciał na cm2 powierzchni Ŝelu na 10 µL
osocza ludzkiego pojawia się wyłącznie precypitat odpowiadający czynnikowi von Willebranda. Barwnik: Coomassie
Brilliant Blue.
Środki ostroŜności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu,
zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków
metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
(119539-001)
Dako Denmark A/S
IS527/PL/SSM/2009.01.21 str. 1/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8 °C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie
warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem
próbek pochodzących od pacjenta, naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego
wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem
z przeciwciałem, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Przygotowanie
próbek
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
Wymagane jest poddanie cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) z uŜyciem Dako PT Link (nr kat.
PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje
się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH
(50x) (nr kat. K8010/K8004).
Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem odczynnika Dako PT Link. Postępować według procedury
wstępnej obróbki tkanek, zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)
(nr kat. K8010/K8004). Uwaga: Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone
zakryte za pomocą środka do trwałego zatapiania.
Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecane jest uŜycie odczynnika Dako PT Link i przeprowadzenie procedury opisane dla skrawków
parafinowych. Po zakończeniu barwienia szkiełka naleŜy zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych, zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020).
Procedura barwienia
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX+, High pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat.
K8010). Kolejne kroki barwienia oraz czasy inkubacji zaprogramowano wstępnie w oprogramowaniu aparatów Dako
Autostainer/Autostainer Plus, przy uŜyciu następujących protokołów:
Protokół wzorcowy: FLEXRTU2 (200 µL dozowanych odczynników) lub FLEXRTU3 (300 µL dozowanych odczynników)
Autoprogram: VWF (bez barwienia kontrastowego) lub VWFH (z barwieniem kontrastowym)
Dla etapu „Auxiliary” naleŜy ustawić opcję „rinse buffer ” w programach barwienia ≤10 szkiełek. W przypadku
programów barwienia >10 szkiełek etap Auxiliary naleŜy ustawić na „none”. Zapewnia to porównywalne czasy płukania.
Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje
zawiera instrukcja obsługi odpowiedniego aparatu Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym aparacie Dako
Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobów jego przygotowania, i powinny
być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. Aby moŜliwe było wykonanie oceny przez patologów z róŜnym
nasileniem odczynu preparatów, naleŜy skontaktować się z działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako, w celu
uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie
zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe – w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części
„Charakterystyka wydajnościowa”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Dako
Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów, naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować okręŜnicę i wątrobę,
natomiast komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki, jak opisany dla tej tkanki w części
„Charakterystyka wydajnościowa” we wszystkich dodatnich preparatach. Zalecana kontrola ujemna to FLEX
Negative Control, Rabbit, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS600).
Interpretacja
wybarwienia
Komórki znakowane przez przeciwciało wykazują odczyn cytoplazmatyczny.
Charakterystyka
działania
Tkanki normalne: W przypadku okręŜnicy, komórki śródbłonka naczyń w blaszce właściwej wykazują odczyn
zakresu od umiarkowanego do silnego. W wątrobie komórki śródbłonka zatok wątrobowych wykazują odczyn
zakresu od słabego do umiarkowanego. Przeciwciała znakują komórki śródbłonka wyściełające wnętrze kapilar,
naczyń limfatycznych, tętnic i Ŝył, a takŜe komórki śródbłonka kłębuszków nerkowych oraz zatok wątroby i śledziony.
Ponadto, poza znakowaniem komórek śródbłonka, przeciwciała znakują megaraiocyty oraz płytki krwi (9).
Tkanki patologiczne: W ostrej białaczce szpikowej (AML), przy uŜyciu klasyfikacji francusko-amerykańsko-brytyjskiej
(FAB), przeciwciała znakowały 3/3 AML FAB M7 i 0/56 AML FAB M1-M6 (1). W innym badaniu, przeciwciała
oznakowaly 1/1 AML FAB M7 (2). Przeciwciała oznakowały 29/36 przypadków mięsaków naczyniowych tkanki
miękkiej (3) a w badaniu mięsaków jamy ustnej i ślinianek oznakowały 19/21 przypadków mięsaków naczyniowych
(4). Przeciwciała uŜywane były do szacowania liczby mikronaczyń w polu 200x w obszarach najbardziej inwazyjnej
neoangiogenezy w przebiegu inwazyjnego raka sutka (10). U 99% ze 137 pacjentów, u których zdiagnozowano
śródbłoniaki krwionośne nabłonkowate (EHE) wątroby, nabłonkowate, dendrytyczne lub pośrednie komórki złośliwej
tkanki naczyniowej wykazywały silną ekspresję czynnika von Willebranda (11).
(119539-001)
Dako Denmark A/S
IS527/PL/SSM/2009.01.21 str. 2/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Piśmiennictwo
1.
Pileri SA, Ascani S, Milani M, Visani G, Piccioli M, Fraternali G et al. Acute leukaemia immunophenotyping in
bone-marrow routine sections. Br J Haematol. 1999;105:394-401
2.
Manaloor EJ, Neiman RS, Heilman DK, Albitar M, Casey T, Vattuone T et al. Immunohistochemistry can be
used to subtype acute myeloid leukemia in routinely processed bone marrow biopsy specimens. Comparison
with flow cytometry. Am J Clin Pathol 2000;113:814-22
3.
Meis-Kindblom J, Kindblom LG. Angiosarcoma of soft tissue: A study of 80 cases. Am J Surg Pathol
1998;22:689-97
4.
Fanburg-Smith JC, Furlong MA, Childers ELB. Oral and salivary gland angiosarcoma: A clinicopathologic study
of 29 cases. Mod Pahol 2003;16:263-71
5.
Ingerslev J. A sensitive ELISA for von Willebrand factor (vWf:Ag). Scand J Clin Lab Invest 1987;47:143-49.
6.
Ruggeri ZM, Ware J. von Willebrand factor. FASEB 1993;7:308-16.
7.
Rodeghiero F. von Willebrand disease: still an intriguing disorder in the era of molecular medicine. Haemophilia
2002;8:292-300.
8.
Sadler JE. A revised classification of von Willebrand disease. Thromb Haemost 1994;71:520-5.
9.
Sehested M, Hou-Jensen K. Factor VIII related antigen as an endothelial cell marker in benign andmalignant
diseases. Virchows Arch (Pathol Anat) 1981;391:217-25.
10. Weidner N, Semple JP, Welch WR, Folkman J. Tumor angiogenesis and metastasis – correlation in invasive
breast carcinoma. N Engl J Med 1991;324:1-8.
11. Makhlouf HR, Ishak KG, Goodman ZD. Epithelioid hemangioendothelioma of the liver: a clinicopathologicstudy
of 137 cases. Cancer 1999;85:562-82.
Objaśnienie symboli
N ume r ka ta log owy
Tempe ratura
prze chow ywan ia
Zu Ŝyć p rzed
Wyró b medyczny do
d ia gno styki in vi tro
Zawa rto ść w ysta rcza na
<n> testów
Produ cent
S prawd zić w instrukcj i
sto sowa nia
Nu mer serii
(119539-001)
Dako Denmark A/S
IS527/PL/SSM/2009.01.21 str. 3/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17