Część III - Wydział Chemii UW

Synteza związków znakowanych i ich
zastosowanie w chemii organicznej, biochemii i
medycynie
Część III
Prof. dr hab. Marianna Kańska
IZOTOPOWE METODY BADANIA MECHANIZMÓW
REAKCJI
Ustalenie mechanizmów reakcji jest jednym z bardzo ważnych zadań
fizykochemii organicznej, która ułatwia zrozumienie i sterowanie złożonymi
syntezami związków biologicznie czynnych. Znajomość mechanizmów reakcji
ułatwia odtworzenie in vitro przebiegu syntez, zachodzących in vivo w
organizmach żywych, oraz opracowanie nowych dróg syntezy bardzo
skomplikowanych związków organicznych. W badaniach mechanizmów reakcji
stosuje się różne metody eksperymentalne, a wśród nich również metody
izotopowe.
W chemii organicznej można wyróżnić trzy metody, gdzie stosuje się
znakowanie izotopami zarówno promieniotwórczymi, jak i stabilnymi.
1. Metoda wskaźników izotopowych, która umożliwia w warunkach laboratoryjnych
lub in vivo prześledzenie drogi interesującego nas atomu, lub stabilnych grup
atomów, w cząsteczce biorącej udział w reakcji organicznej lub bioorganicznej.
2. Metoda specyficznej wymiany izotopowej, która jest stosowana w radiochemii i
znajduje szerokie zastosowanie w syntezie znakowych związków organicznych
oraz w badaniu trwałości wiązań. Dzięki tej metodzie ustalono, które atomy
wodoru w cząsteczce organicznej są labilne i wymieniają się miejscami z
wodorami labilnymi cząsteczek rozpuszczalnika zawierającymi wodory np. w
grupach
aminowych,
hydroksylowych,
czy
merkaptanowych.
Takie
radiochemiczne wstępne informacje są często wykorzystywane w syntezach
związków organicznych znakowanych metodą wymiany izotopowej. Istnieje
bogata literatura na temat wymian izotopowych, a mimo to metoda ta w dalszym
ciągu jest wykorzystywana do ustalania struktury skomplikowanych związków
organicznych
3. Metoda kinetycznego efektu izotopowego, KEI- (Kinetic Isotope Effect, KIE), która
polega na wyznaczeniu stałych szybkości przebiegających reakcji z użyciem cięższego i
lżejszego izotopu. Najczęściej wyznaczane są KEI deuteru, trytu i węgla. Cząsteczka
chemiczna, wykorzystywana w tych badaniach, jest znakowana izotopem w ściśle
określonym miejscu. Korelacja między doświadczalnie zmierzonym, a teoretycznie
wyliczonym KEI jest jedną z najlepszych metod do wyjaśnienia struktury i detali
kompleksu aktywnego, a także zmian, jakie zachodzą w wiązaniu w trakcie
przechodzenia od substratu do produktu. Metoda KEI jest szczególnie użyteczna, kiedy
do badania mechanizmu danej reakcji używa się kolejno substratów znakowanych w
różnych pozycjach, przy których mogą występować zmiany w wiązaniach chemicznych.
Dodatkowych cennych szczegółów może dostarczyć użycie substratu z różnymi
podstawnikami, indukującymi zmiany w otoczeniu wiązań ulegających przekształceniu
w trakcie badanego procesu.
Mechanizm reakcji
Mechanizm opisuje przebieg reakcji chemicznej.
Mówi on o tym:
a) które wiązania ulegają pęknięciu,
b) jakie wiązania się się tworzą,
c) jaka jest kolejność tych zjawisk,
d) z ilu etapów składa się rozpatrywany proces,
e) jakie są względne szybkości poszczególnych etapów
Poznanie odpowiedzi na te pytania jest często bardzo trudnym zadaniem.
Szczególnie może to być skomplikowane w przypadku reakcji enzymatycznych, ze względu na złożoną strukturę enzymu i zachodzące procesy
katalityczne.
Metody wyznaczania mechanizmów reakcji
1. Badanie produktów produktów reakcji:
• identyfikacja,
• dowody stereochemiczne.
2. Badanie produktów pośrednich:
• izolacja produktów pośrednich,
• wykrywanie produktów pośrednich (metody spektroskopowe i rezonansowe),
• wychwycenie produktów pośrednich (przy założeniu, że produkt pośredni będzie reagować
z danym reagentem dając ściśle określony produkt),
• dodatek oczekiwanego produku pośredniego.
3. Badania kinetyczne:
• równanie kinetyczne (mechanizm musi objaśniać obserwowane równanie i rząd reakcji),
• badania katalizy (również inhibicji),
• efekty izotopowe.
4. Stosowanie cząsteczek znakowanych izotopowo (analiza produktów takimi
technikami, jak MS, NMR itp.).
Kinetyczny efekt izotopowy
k1
A +
1
B
------------→
A1B
k2
A +
2
B
------------→
k1 -stała szybkości reakcji z udziałem izotopu lżejszego ( 1B)
k2 -stała szybkości reakcji z udziałem izotopu lżejszego ( 2B)
k1
= 1
k2
k1
 1
k2
k1
1
k2
nie ma KIE
jest KIE
odwrotny KIE
A2B
Kinetyczny efekt izotopowy
Jednym z najpotężniejszych narzędzi w badaniu mechanizmów reakcji jest metoda
kinetycznego efektu izotopowego. Jest ona bardzo często stosowana do badania
mechanizmów reakcji enzymatycznych.
Teoretyczne wyjaśnienie kinetycznych efektów izotopowych jest złożonym i
trudnym zadaniem. Z praktycznego punktu widzenia istotne jest jedynie uzmysłowienie
sensu fizycznego tego zjawiska. Zastąpienie atomu pierwiastka, w cząsteczce związku
biorącym udział w reakcji, na jego cięższy izotop często powoduje zmianę szybkości
reakcji.
Różna szybkość tych dwóch reakcji jest nazywana kinetycznym efektem
izotopowym i określa się ją jako stosunek stałych szybkości:
kiz. lżejszego / kiz. cięższego
Różnica ta wynika z tego, że energia oscylacyjna wiązania chemicznego na najniższym
możliwym poziomie (zero-point energy) nie jest zerowa (wynosi: E = hυ) i zależy od
masy zredukowanej:
µ=
m1m 2
m1 + m 2
zgodnie z prawem Hook’a:
υ
≈
1
2
k
µ
(k- stała siłowa niezależna od masy).
Z tego wynika że wiązanie z cięższym izotopem będzie miało niższą energię
oscylacji i rozerwanie wiązania będzie wymagało większej energii.
Obrazowo przedstawiono to na poniższym schemacie:
Energia dysocjacji wiązań C-H i C-D
Ta właśnie różnica w energiach dysocjacji jest powodem różnych szybkości
procesów z udziałem izotopów. Efekt izotopowy obserwujemy jedynie wówczas,
gdy rozpatrywany etap jest wystarczająco wolny, aby mieć decydujący wpływ na
szybkość całego procesu.
Kinetyczne efekty izotopowe. Najważniejsze kryteria podziału.
1. Podział KEI ze względu na wielkość stosunku
k is.lighter
k is. heavier
• efekty normalne, występują wówczas gdy szybkość reakcji dla związku z izotopem
lżejszym jest większa niż dla związku z izotopem cięższym
k is.lighter
k is.heavier
>1
• brak efektu izotopowego
k is.lighter
k is.heavier
=1
• efekty odwrotne (obserwowane rzadko) gdy:
k is .lighter
k is .heavier
<1
Metody wyznaczania mechanizmów reakcji
1. Badanie produktów produktów reakcji:
• identyfikacja,
• dowody stereochemiczne.
2. Badanie produktów pośrednich:
• izolacja produktów pośrednich,
• wykrywanie produktów pośrednich (metody spektroskopowe i rezonansowe),
• wychwycenie produktów pośrednich (przy założeniu, że produkt pośredni będzie reagować
z danym reagentem dając ściśle określony produkt),
• dodatek oczekiwanego produku pośredniego.
3. Badania kinetyczne:
• równanie kinetyczne (mechanizm musi objaśniać obserwowane równanie i rząd reakcji),
• badania katalizy (również inhibicji),
• efekty izotopowe.
4. Stosowanie cząsteczek znakowanych izotopowo (analiza produktów takimi
technikami, jak MS, NMR itp.).
3. Podział KEI ze względu na położenie znacznika izotopowego w stosunku do
miejsca w cząsteczce, gdzie zachodzi etap determinujący szybkość reakcji:
a) pierwszorzędowe,
b) α−drugorzędowe
c) β−drugorzędowe
Na przykładzie mechanizmu E1 można wyjaśnić te efekty.
Według tego mechanizmu, najwolniejszym etapem jest rozerwanie wiązania pomiędzy
atomem węgla a grupą X (odchodzącą), co prowadzi do utworzenia karbokationu. Ten etap
będzie decydował o szybkości całego procesu. W związku z tym podstawienie atomu 12C1
izotopem 14C spowolni reakcję. Taki efekt izotopowy jest nazywany efektem pierwszorzędowym. Analogicznie dla wodoru H2 wystąpi efekt α−drugorzędowy, a dla wodoru H3
wystąpi efekt β−drugorzędowy.
3
H H
2
3
H C C1 X
wolno
H H
2
+
H C C1
H H
H H
3
H H
2
+
H C C1
szybko
H H
Mechanizm E1
H
3
H
C C1
H
H
2
4. Podział na efekty substratowe i rozpuszczalnikowe
• substratowe – występują wówczas gdy zmiana składu izotopowego substratu
powoduje zmianę szybkości reakcji,
• rozpuszczalnikowe – występuje wówczas gdy zmiana rozpuszczalnika np.
• z H2O na D2O powoduje zmianę szybkości reakcji.
5. Podział efektów izotopowych znajdujących odbicie w
zmianie kinetycznych parametrów reakcji enzymatycznych:
kinetyczne efekty izotopowe na Vmax
kinetyczne efekty izotopowe na Vmax
/Km
4. Podział na efekty substratowe i rozpuszczalnikowe
• substratowe – występują wówczas gdy zmiana składu izotopowego substratu
powoduje zmianę szybkości reakcji,
• rozpuszczalnikowe – występuje wówczas gdy zmiana rozpuszczalnika np.
• z H2O na D2O powoduje zmianę szybkości reakcji.
5. Podział efektów izotopowych znajdujących odbicie w
zmianie kinetycznych parametrów reakcji enzymatycznych:
kinetyczne efekty izotopowe na Vmax
kinetyczne efekty izotopowe na Vmax
/Km
METODY WYZNACZANIA KINETYCZNYCH
EFEKTÓW IZOTOPOWYCH
1. Bezpośrednie wyznaczanie kinetycznych efektów
izotopowych.
2. Metoda zaburzeń równowagi.
3. Metody z użyciem spektrometrii mas.
Wyznaczanie KIE wg równań Bigeleisena i Wolsgerga
R0 + 1
R
)
ln(1 − f ∗ 0 )
Rp + 1
Rp
α =
≈
R ∗ f ∗ ( R0 + 1)
ln(1 − f )
ln[1 − p
]
R0 ∗ ( R p + 1)
ln(1 − f ∗
(1 − f ) ∗ ( R0 + 1)
(1 − f ) ∗ R0
ln
Rs + 1
Rs
α =
≈
R ∗ (1 − f ) ∗ ( R0 + 1)
ln(1 − f )
ln s
R0 ∗ ( Rs + 1)
ln
f ∗ ( R p − Rs )
f ∗ ( R p − Rs )
1
1
ln[
−
]
ln[
−
]
1 − f (1 − f ) ∗ ( R p + 1)
1− f
(1 − f ) ∗ R p
α =
≈
f ∗ ( R p − Rs )
f ∗ ( R p − Rs )
1
1
ln[
−
] ln[
−
]
1 − f (1 − f ) ∗ Rs ∗ ( R p + 1)
1 − f (1 − f ) ∗ Rs ∗ R p
ln
α =
ln
R p − Rs
( R p − R0 ) ∗ Rs
( R p − Rs ) ∗ R0
- R0 - aktywność molową lub stosunek zawartości izotopu lżejszego do izotopu cięższego
w substracie przed rozpoczęciem reakcji,
- Rp - aktywność molową lub stosunek zawartości izotopu lżejszego do izotopu cięższego w produkcie w chwili, gdy stopień przereagowania wynosi f,
- Rs - aktywność molową lub stosunek zawartości izotopu lżejszego do izotopu cięższego w substracie, gdy stopień przereagowania wynosi f,
- f - stopień przereagowania.
- α - kinetyczny efekt izotopowy,
R p − R0
Badanie mechanizmu elektrofilowej substytucji w pierścieniu
aromatycznym
H
(1)
ArH + Y
Ar
Powoli; etap określajacy
szybkość reakcji
Y
H
(2)
Ar
+
Z
ArY
+
Szybko
H: Z
Y
H
(1a)
ArH + Y
Ar
ArY
+
H
Y
Mechanizm elektrofilowej substytucji w pierścieniu aromatycznym
Badanie mechanizmu elektrofilowej substytucji w pierścieniu aromatycznym
Znajomość efektu izotopowego oraz ogólna znajomość przyczyn jego występowania,
stwarza możliwość wyjaśnienia, dlaczego ten efekt interesuje chemika organika.
Z dotychczasowych ustaleń eksperymentalnych, dotyczących reakcji elektrofilowej
substytucji w związkach aromatycznych, wynika, że zachodzą one według jednego
mechanizmu, niezależnie od rodzaju reagenta biorącego w niej udział. Dla reagenta YZ
ogólny mechanizm tej reakcji można zapisać następująco:
H
(1)
ArH + Y
Ar
Powoli; etap określajacy
szybkość reakcji
Y
H
(2)
Ar
+
Z
ArY
+
H:Z
Szybko
Y
Mechanizm elektrofilowej substytucji w pierścieniu aromatycznym
Mechanizm obejmuje dwa zasadnicze etapy: Etap (1) – atak reagenta elektrofilowego na pierścień z
utworzeniem karbokationu oraz etap (2) – oderwanie protonu od karbokationu przez dowolną zasadę.
Pytanie skąd wiadomo, że elektrofilowa substytucja w pierścieniu aromatycznym obejmuje dwa etapy,
a nie tylko jeden.
H
(1a)
ArH + Y
Ar
ArY
+
H
Y
Oraz skąd wiadomo, że pierwszy z dwóch etapów [etap (1)] przebiega znacznie wolniej niż [etap (2)]?
Odpowiedź uzyskano w wyniku serii badań rozpoczętych przez Melandera (z Instytutu Chemii im.
Nobla w Sztokholmie) i prowadzonych także przez wielu innych badaczy. Różnorodne związki
aromatyczne znakowane atomami deuteru i trytu w pierścieniu aromatycznym poddano nitrowaniu,
bromowaniu i alkilowaniu metodą Friedla-Craftsa.
Stwierdzono, że w reakcjach tych następuje wymiana atomów deuteru lub trytu z taką samą
szybkością jak atomów zwykłego wodoru (protu). Również nie zaobserwowano wyraźnego efektu
izotopowego. Wiadomo, że wiązanie węgiel-deuter ulega rozerwaniu wolniej niż wiązanie węgiel-prot, a
wiązanie węgiel-tryt jeszcze wolniej.
Jak więc możemy interpretować fakt, że nie stwierdza się w tym przypadku efektu izotopowego?
Jeżeli szybkości substytucji różnych izotopów wodoru są taki same, może to tylko
oznaczać, że w reakcjach, których szybkość porównujemy, nie następuje rozerwanie
wiązania węgiel-wodór.
Interpretacja ta jest zgodna z przyjętym mechanizmem. Powolne przyłączenie
reagenta elektrofilowego określa szybkość całego procesu substytucji. Powstający
karbokation szybko traci jon wodorowy i przekształca się w cząsteczkę produktu.
Etap (1) jest etapem określającym szybkość reakcji. W etapie tym nie następuje
rozerwanie wiązania węgiel-wodór, dlatego szybkość tego etapu, a więc szybkość
całej reakcji, nie zależy od rodzaju izotopu wodoru, który znajduje się w pierścieniu.
Gdyby reakcja substytucji obejmowała etap (1a), to musiał by on być etapem
określającym szybkość reakcji, a ponieważ następowałoby w nim rozerwanie
wiązania węgiel-wodór, powinniśmy zaobserwować kinetyczny efekt izotopowy.
Gdyby natomiast etap (2) w sekwencji dwuetapowej przebiegał dostatecznie wolno
w porównaniu z etapem (1), wówczas musiałby on wpływać na całkowitą szybkość
reakcji i ponownie należałoby się spodziewać wystąpienia KEI.
Badanie mechanizmu kondensacji Dieckmana
Reakcja kondensacji Dieckmana polega na katalizowanej przez zasadę cyklizacji wewnętrznej
estru dikarboksylowego do β-ketoestru
CH2COOR
CH2COOR
B
-
CHCOOR
(1)
CH2 C O
OR
(2)
O
O
OR
O
OR
O
(3)
OR
Mechanizm kondensacji Dieckmana
Każdy z trzech etapów może określać kinetykę procesu. Problem który z etapów jest kinetycznie
istotnym, rozwiązano znakując kolejno ester węglem
grupie karbonylowej.
14
C, raz w grupie metylenowej, drugi raz w
1. Jeżeli etap (1) jest istotny kinetycznie, wtedy powinniśmy obserwować KEI
14
C w grupie
metylenowej oraz brak KEI 14C w grupie karbonylowej.
2. Jeżeli etap drugi jest istotny kinetycznie, wtedy powinniśmy obserwować KEI zarówno
dla węgla w
grupie metylenowej jak i w grupie karbonylowej, gdyż
w
stanie
przejściowym tego etapu ulegają zmianie wiązania chemiczne przy obu tych węglach.
3. Jeżeli etap trzeci jest istotny kinetycznie, wtedy w stanie przejściowym reakcji wiązania
chemiczne przy węglu grupy metylenowej nie ulegają zmianie. W tym przypadku KEI 14C
grupy karbonylowej powinien być obserwowany.
Pomiary doświadczalne wykazały istnienie kinetycznego efektu izotopowego zarówno dla
węgla metylenowego i dla węgla z grupy karbonylowej;
Grupa metylenowa; k12/k14 = 1,089
Grupa karbonylowa; k12/k14 = 1,084
Oznacza to, że etap drugi tj. tworzenie nowego wiązania węgiel – węgiel decyduje o
kinetyce reakcji.
Badanie mechanizmu reakcji addycji elektrofilowej chlorku
2,4 dinitrobenzenosulfenowego do styrenu i jego para pochodnych w środowisku
kwasu octowego
R
β
α
Z
1
ArSX
R
R
β
X
α
ArS β
Z
2
Ar
α
S
X
R
β
Ar
α
Z
Z
3
4
S
X
R
X
ArS
Z
Mechanizm reakcji addycji elektrofilowej chlorku 2,4-dinitrobenzenosulfenowego
Jeżeli reakcje addycji chlorku 2,4-dinitrobenzenosulfenylowego do styrenu i jego para pochodnych
prowadzi się w kwasie octowym, to wiadomo, że reakcja przebiega zgodnie z regułą Markownikowa i
dodatnia część cząsteczki chlorku 2,4-dinitrobenzenosulfenowego przyłącza się do βC natomiast
ujemny chlor przyłącza się do αC i powstają odpowiednie siarczki chloro fenyloetylowo-2,4dinitrofenylowe.
Powstaje pytanie, jaką strukturę posiada kompleks aktywny powstający w etapie określającym
szybkość reakcji w reakcji elektrofilowej? Prezentowany schemat zawiera trzy różne struktury stanów
przejściowych dające ten sam produkt końcowy.
Na temat reakcji elektrofilowej addycji do nienasyconych węglowodorów ukazało się wiele prac, ale
nie było jednomyślności jaką strukturę ma kompleks aktywny. Problem ten mógł być rozwiązany przez
14
wyznaczenie KEI
C w pozycji α- i β-styrenów zawierających elektronodonorowe i
elektronoakceptorowe podstaw\niki.
Przewidziano, że jeżeli kompleks aktywny posiada strukturę (2) to powinniśmy obserwować
kinetyczny efekt izotopowy dla βC, ponieważ tworzy się wiązanie z siarką tylko przy tym węglu.
Natomiast jeżeli kompleks aktywny posiada strukturę (3) bądź (4) wówczas powinniśmy obserwować
KEI dla αC i dla βC.
Badania doprowadziły do wyznaczenia KEI dla αC i βC następujących dla kolejno
podstawionych styrenów:
C
β
C
α
p-CH3; p-H; p-Cl; k/kα = 1,004; 1,022; 1,027
p-CH3; p-H: p-Cl; k/kβ = 1,037; 1,032; 1,035
Oznaczenia wartości k/kα i k/kβ wykazały, że kinetyczny efekt izotopowy dla
węgla 14C jest zależny od miejsca podstawienia izotopowego oraz od charakteru
podstawników w pierścieniu aromatycznym.
Wyznaczona wartość k/kβ dla βC jest dość duża i nie zależny od charakteru
podstawników w pozycji para pierścienia. Natomiast k/k α jest zależny od charakteru
podstawnika. Wyraźnie mały kinetyczny efekt izotopowy węgla 14C w reakcji
addycji ArSCl do styrenu, posiadający elektronodonorowy podstawnik w pozycji
para pierścienia aromatycznego, sugeruje, że struktura stanu przejściowego jest
zbliżona do struktury otwartej karbokationu (2), w której dodatni ładunek jest
zlokalizowany przy węglu α.
Wiązanie βC-S tworzy się niezależnie od mechanizmu i dlatego jest jasne, że
KEI występuje i jego wartość nie zmienia się, niezależnie od tego jaki podstawnik
jest w pierścieniu aromatycznym.
Jeśli aktywny kompleks miałby strukturę (3) lub (4) to utworzone wiązanie
pomiędzy αC i siarką powinno być taki samo lub podobne i wówczas KEI dla αC
powinien być podobny. Im silniejsze jest wiązanie αC-S tym większy powinien być KEI.
Jeżeli ładunek dodatni na αC jest bardziej zdelokalizowany w pierścieniu wówczas
wiązanie αC-S jest bardzo słabe lub go nie ma i wtedy jest brak kinetycznego efektu
izotopowego. Jeżeli podstawnik jest elektronodonorowy (-CH3), to wolna para
elektronowa jest do pewnego stopnia zdelokalizowana, co powoduje zwiększenie
chmury elektronowej pierścienia, a następnie osłabienie ładunku dodatniego przy αC.
Wiązanie αC-S jest wtedy bardzo słabe i w konsekwencji tego KEI jest bardzo mały.
Obecność chloru w pozycji para pierścienia powoduje, że gęstość elektronowa w
pierścieniu jest mniejsza niż w cząsteczce styrenu i dlatego też wiązanie αC-S jest
silniejsze i KEI jest większy.
A więc jeżeli podstawnik jest elektronodonorowy, to aktywny kompleks ma
strukturę (2).
Jeżeli podstawnik jest elektronoakceptorowy, to aktywny kompleks ma strukturę
(3) lub (4).
Reasumując, struktura kompleksu aktywnego powstającego w etapie określającym
szybkość reakcji zależy od budowy podstawnika znajdującego się przy podwójnym
wiązaniu.
Badania mechanizmu reakcji eliminacji bromu z kwasów
dibromocynamonowych do odpowiednich kwasów cynamonowych
I etap:
Br
COOH
R
Br
COOH
+ KI
+ KBr
R
II etap:
KJ + IBr ›
I2 + KI ›
KBr + I2
KI3(KI, J2)
+
IBr
Mechanizm eliminacji kwasu
para metylo[(2R),(3S)]-dibromocynamonowego
COOH
Br
Br
Br
wolno
CH3
COOH
COOH
szybko
CH3
CH3
Mechanizm eliminacji kwasu
para metylo[(2R),(3S)]-dibromocynamonowego
E 1 (jednocząsteczkowy)?
Br
α
β
COOH
Br
α
- Br
COOH
Br
β
-
R
R
-
- Br , - Br
- Br
+
α
COOH
β
R
+
E 2 (zsynchronizowany)?
Badania wykazały, że kinetyczny efekt izotopowy 14C występuje w pozycjach α, β, oraz jest
zależny od miejsca podstawienia izotopowego i od charakteru podstawnika w pierścieniu
aromatycznym. Gdy:
R = H, p-CH3, oraz p-NO2
wtedy (k12\k14) w pozycji α wynoszą odpowiednio:
1,05226; 1,0094; 1,0233.
Natomiast (k12\k14) w pozycji β dla podstawników R = p-CH3 i H wynoszą odpowiednio:
1,072; 1,0483
Wnioski dotyczące mechanizmu reakcji eliminacji bromu z kwasu
[(2R),(3S)]-dibromocynamonowego
Zakładany
mechanizm
E1
(jednocząsteczkowy)
E2
(zsynchronizowany)
KEI
k/α k
k/β k
k / *k
nie
tak
nie
tak
tak
nie
Badanie mechanizmu eliminacji amin z soli p-nitrofenylo-2-etylo-N,N,Ntrimetyloamoniowej i n-propylo-N,N,N-trimetyloamoniowej
Reakcje eliminacji, badane metodą KEI z zastosowaniem ciężkich atomów zachodziły
głownie według mechanizmu E1 i E2. W związku z tym prowadzone badania były
głównie ukierunkowane w stronę wyznaczenia trwałości wiązań przy βC-H i αC-X.
Skomplikowana natura takiej reakcji została wyjaśniona na przykładzie
wyznaczenia KEI dla kolejno znakowanych związków w trakcie rozkładu soli npropylo-N,N,N-trimetyloamoniowej oraz p-nitrofenylo-2-etylo-N,N,N-trimetyloamoniowej
α
R CH CH2 NMe3
T
β
B
β
-
R CH
−
α
CH2
δ
+
NMe3
δB T
α
β
R CH CH2
+ NMe3 + BT
Mechanizm eliminacji soli amoniowych do styrenu
Badano kinetyczny efekt izotopowy dla węgla 14C, wodoru i azotu. W literaturze występują znaczne
różnice w wyznaczonych efektach izotopowych przez dwie oddzielne grupy badawcze.
Pierwsza grupa dla podstawnika R = CH3 otrzymała:
oraz
k/kβ = 1,036 dla 14C w pozycji β,
k/kα = 1,069 dla 14C w pozycji α,
kH/kT = 2 dla trytu w pozycji β.
Reakcja ta była prowadzona w temperaturze 50 oC.
Ponadto wyznaczono KEI dla reakcji w tych samych warunkach z podstawnikiem R = p-NO 2C6H4
dla 14C w pozycji α, gdzie otrzymano: k/kα = 1,026.
Z tego widać, że występujące znaczne efekty izotopowe przy αC, βC i βH wpływają na etapy
determinujące szybkość reakcji.
Druga grupa badawcza dla podstawnika R = p-NO2C6H4 wyznaczyła kinetyczny efekt izotopowy:
k/kα = 1,078
dla14C w pozycji 2,
k14/k15 = 1,024
dla azotu,
H T
i
k /k = 2,12 dla trytu w pozycji β.
Reakcję prowadzono w temperaturze 100 oC.
Przyczyna tych rozbieżności nie jest znana, ale autorzy wyciągają podobne wnioski, że zmiany wiązań
przy N, αC,βC i βH decydują o szybkości reakcji.
Badanie mechanizmu reakcji dehydrohalogenacjii
R
β α
C CCl3
R
R
para podstawiony
2,2-difenylo-1,1,1-trichloroetan
α
β
CH2 CH2Cl
para podstawiony
1-chloro-2-fenyloetan
R
β
α
CH2 CH2 NMe3 Br
bromek para podstawiony
2-fenyloetylo-N,N,N-trimetyloamoniowy
R
α
β
CH CH3
Cl
para podstawiony
1-chloro-1-fenyloetan
Badanie mechanizmu reakcji dehydrohalogenacjii
Zaproponowany mechanizm reakcji dehydrohalogenacji przedstawia poniższy schemat
R
CH3O
H
β C
R
-
α CCl2
E1cb ?
β C
- CH3OH
wolno
Cl
R
R
- Cl
α CCl2
-
β C
szybko
α
CCl2
Cl
R
R
zsynchronizowany E2
- CH3OH, - Cl-
Przed dokładnym przebadaniem reakcji dehydrohalogenacji sądzono, że przebiega ona w
środowisku zasadowym według mechanizmu E1cB, ale nie wykluczono również
mechanizmu podobnego do E2.
W związku z czym przebadano proces eliminacji z użyciem czterech uprzednio
podanych układów.
Zakładany mechanizm eliminacji amoniaku i odtworzenie
miejsca aktywnego
O
Enzym
O
O
N
NR
a)
Enzym
N
Enzym
NR
N
b)
NH2
+
+
NH2
CO2-
NR
+
CO2-
CO2-
+
NH3
c)
a) Addycja Michaela
b) β − eliminacja
c) odtworzenie dehydroalaniny przez
O
β -eliminację
Enzym
N
NR
+ NH3
Mechanizm reakcji eliminacji z udziałem PAL zaproponowany
przez Havir’a i Hanson’a
+
B
B:
H
B:
O
H2N
N
H
Ph HRe
H Si
OH
Ph HRe
H Si
N
H
B:-
N
H
H
COO-
H2N
Ph
N
H
H2N
N H H
H
H
COO-
N H H
H
B:
OH
+
B:
HB
-
+
H
COO-
HRe
HB
Ph
OH
N
H
H2N
N H H
H
COO-
Mechanizm reakcji eliminacji z udziałem PAL zaproponowany
przez Schuster’a i Retey’a
H
N
OH
OH
+
H
N
N
H
H ReHSi
N
H
H ReHSi
COO
+
COO
+
H3N H
+
H3N H
H
N
:B
OH
+
HB
N
H
COO
H
N
OH
+
N
H
+
HB
COO
+
H3N H
NH3
Kinetyczny efekt izotopowy H/T w pozycji 3-pro-S L-tyrozyny
Liaza fenyloalaninowa katalizuje również eliminację amoniaku z L-tyrozyny, co
pozwala na zbadanie wpływu grupy elektrodonorowej na wielkość kinetycznego efektu
izotopowego w tej reakcji. Nie można jednocześnie wykluczyć, że reakcja eliminacji z
udziałem L-tyrozyny przebiega według innego mechanizmu. Potwierdzeniem takiej
tezy byłby wynik znacząco różny od otrzymanego dla L-Phe, czyli na przykład brak
efektu lub duży efekt.
T
14
COOH
HO
NH2
14
COOH
PAL
pH = 8,7, 30 oC
+ NH2T
HO
Kinetyczny efekt izotopowy H/T w pozycji orto pierścienia
aromatycznego L-fenyloalaniny
O
T
14
C
T
T
PAL
OH
O
14
C
pH = 8,7
NH2
OH
+
NH3
T
Wyniki badań kinetycznego efektu izotopowego H/T w pozycji 2 i 6 pierścienia
aromatycznego L-fenyloalaniny.
Nr eksperymentu –
Stopień
nr frakcji
przereagowania [%]
KEI
1-1
5,89
0,8595
1-2
9,32
0,9664
1-3
12,09
1,0254
1-4
13,86
1,0870
1-5
16,22
1,0991
2-1
9,95
1,0143
2-2
12,34
1,0354
2-3
19,70
1,1559
2-4
21,82
1,1591
2-5
24,12
1,1598
Kinetyczny efekt izotopowy
12
C/14C w pozycji 2 L-Phe
O
O
H*
C
OH
NH2
*
C
H
PAL
pH = 8,7
OH
Kinetyczny efekt izotopowy 12C/14C w pozycji 2 L-fenyloalaniny
Nr eksp.*
R0, Rp, f
R0, Rr, f
Rp, Rr, f
R0, Rr, Rp
Średnia
1
0.9957
1.0262
1.0003
0.9981
1.0051
2
0.9955
0.9918
0.9955
0.9955
0.9946
3
1.0095
0.9696
1.0020
1.0050
0.9965
4
1.0085
1.0044
1.0075
1.0078
1.0070
średnia
1.0023
0.9980
1.0013
1.0016
1.0008
±0.0062
±0.0019
Procedura wyznaczenie KEI H/T w pozycji 3-pro-R
Mieszanina reakcyjna:
enzym, L-Phe [1-14 C, 3R-3H]
bufor boranowy 0,2M pH = 8,7
Pobieram V1 mieszaniny reakcyjnej
Mierzę aktywność (A0) 14 C oraz
stosunek aktywności3H/14 C (R0 )
t1
t2
t5
t3 t4
Pobieram 5 frakcji (każda V1)
o różnym stopniu przereagowania
w zakresie od 10% do 20%
Procedura postępowania dla każdej frakcji
Mieszanina reakcyjna pH=8,7
O
T
14
C
T
O
14
O
C
+
O
NH3
H+
Reakcja enzymatyczna zatrzymana pH=0-1
T
O
14
C
T
OH
O
14
C
+
OH
NH3
Ekstrakcja
(Et2 O)
Warstwa eterowa
T
O
14
C
Warstwa wodna
T
O
14
OH
C
OH
+
NH3
Po wydzieleniu L-Phe zastosowana
Pomiar aktywnosci14 C (Ai)
do następnego eksperymentu
oraz stosunku aktywności3 H/14C Rp
Kinetyczny efekt izotopowy H/T w pozycji 3-pro-R L-Phe
Nr Eksp.
KEI
1
1,0594
Odchylenie
stand.
0,0215
1,0535
0,0187
3
1,0566
0,0151
4
1,0480
0,0167
5
1,0585
0,0193
Średnia
1,0552
0,0046
2
Procedura badania KEI w pozycji 3-pro-S L-Phe
Mieszanina reakcyjna:
enzym, L-Phe [1-14C, 3S-3H]
bufor boranowy 0,2M pH = 8,7
Pobieram V1 mieszaniny reakcyjnej
Mierzę aktywność (A0) 14 C oraz
stosunek aktywności3H/14 C (R0)
t1
t2
t3 t4
t5
Pobieram 5 frakcji (każda V1)
o różnym stopniu przereagowania
w zakresie od 10% do 20%
Procedura postępowania dla każdej frakcji
Mieszanina reakcyjna pH=8,7
NH2T
O
T
14
C
O
14
O
C
+
NH3
H+
O
Reakcja enzymatyczna zatrzymana pH=0-1
+
NH3T
O
T
O
14
14
C
C
OH
OH
+
NH3
Ekstrakcja
(Et2O)
elucja H2O
Warstwa wodna
Kolumna jonowymienna
T
+
+
NH3T
Amberlit IR 120 (H)
0,3 M NH3
Warstwa eterowa
O
14
C
O
14
OH
C
OH
+
T
NH3
O
14
C
OH
+
NH3
HT O
O
T
14
C
+
NH3
OH
Odparowanie pod
zmniejszonym
ciśnieniem
Pomiar stosunku
aktywności 3H/14C (Rri)
Pomiar aktywnosci 14 C (Ai)
Kinetyczny efekt izotopowy D/T w pozycji 3-pro-S L-Phe
Nr Eksp.
KEI
Odchylenie
Stand.
1
1,0750
0,0186
1,0953
0,0187
3
1,0899
0,0151
4
1,0734
0,0167
Średnia
1,0834
0,0109
(1,01%)
2
Zależność Swain’a-Schaad’a
α=
k 
kH
=  H
kT
 kD 
Gdzie:
1, 44
α=
 kD 
 
 kT 
3 , 26
k 
=  H
 kT 
obl
k 
〈  H
 kT 
obs
kH/kT - KIE dla 1H/3H.
kH/kD - KIE dla 1H/2H.
kD/kT - KIE dla 2H/3H.
Jeśli efekt 1H/3H, obliczony z efektów 1H/2H lub 2H/3H przy pomocy
wspomnianych zależności, jest mniejszy od efektu zaobserwowanego, wtedy
prawdopodobnie w reakcji następuje tunelowanie protonu.
Jeśli wartość wyliczonego KIE jest większa od zaobserwowanej, to mamy do
czynienia ze złożonością kinetyczną, tzn. nie tylko etap odrywania protonu
decyduje o szybkości reakcji.